高效液相色譜法測(cè)定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二鈉的含量

巫立健，賴國(guó)銀，白 松，林立毅，鄭向華，徐敦明，張志剛

(廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 廈門 361026)

高效液相色譜法測(cè)定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二鈉的含量

巫立健，賴國(guó)銀，白 松，林立毅，鄭向華，徐敦明*，張志剛

(廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 廈門 361026)

在未使用離子對(duì)試劑和高鹽緩沖液條件下，采用親水性C18反相液相色譜柱，以甲醇-水體系為流動(dòng)相，建立了面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二鈉含量的高效液相色譜測(cè)定方法。樣品采用水溶液提取，在超聲輔助下與三氯化鐵反應(yīng)生成穩(wěn)定的衍生產(chǎn)物，用三氯甲烷凈化衍生產(chǎn)物。采用高效液相色譜法以pH 4.0甲醇-水溶液(10∶90，體積比)為流動(dòng)相，親水性C18反相液相色譜柱為固定相，260 nm波長(zhǎng)下測(cè)定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二鈉含量。乙二胺四乙酸二鈉的質(zhì)量濃度在1.0～50.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為0.999 6，檢出限為3.0 mg/kg，定量下限為10.0 mg/kg。面粉樣品添加濃度在10.0～200 mg/kg范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率為95.0%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～6.3%，可滿足面粉及面制品中乙二胺四乙酸二鈉的快速檢測(cè)和定量分析要求。

乙二胺四乙酸二鈉；面粉制品；高效液相色譜法;親水性C18反相液相色譜柱

乙二胺四乙酸鹽是一類多羧酸氨基絡(luò)合試劑，能與許多金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，廣泛地應(yīng)用于分析化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、精細(xì)化工和食品加工等領(lǐng)域[1-3]。在食品加工中，目前常用的乙二胺四乙酸鹽主要有乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、乙二胺四乙酸二鈉鈣(EDTA-CaNa)、乙二胺四乙酸鐵鈉(EDTA-FeNa)等。乙二胺四乙酸二鈉可與鈣、鎂、銅、鐵等多價(jià)離子配位形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，可以有效防止金屬離子引起的變色、變質(zhì)、變濁及維生素的氧化損失[4]。然而，乙二胺四乙酸二鈉可對(duì)粘膜、上呼吸道、眼睛及皮膚產(chǎn)生刺激作用，長(zhǎng)期大量食用乙二胺四乙酸二鈉超標(biāo)的產(chǎn)品可能對(duì)人體健康產(chǎn)生不良影響[5]。面粉制成品(如面條、餃子皮、餛飩皮等)在制作完成后會(huì)出現(xiàn)酶促褐變現(xiàn)象，影響產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分和感官品質(zhì)。多酚氧化酶是一種面粉中均含有的銅結(jié)合酶，是引起面粉制成品返色褐變的主要原因。為延緩面粉制成品的褐變過程，通常加入乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、抗壞血酸等多酚氧化酶抑制劑作用于多酚氧化酶上的銅離子，降低酶活性，減緩酶促褐變過程[6]。相關(guān)法規(guī)規(guī)定，將乙二胺四乙酸二鈉應(yīng)用于面粉及面粉制品中屬于超范圍使用乙二胺四乙酸二鈉[7]。

目前，食品中乙二胺四乙酸鹽的檢測(cè)方法包括氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9-10]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]等。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.278-2016采用反相離子對(duì)液相色譜法，以甲醇-四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液為流動(dòng)相測(cè)定罐頭食品和復(fù)合調(diào)味料中乙二胺四乙酸鹽的含量，樣品經(jīng)陰離子固相萃取柱凈化后，對(duì)各種復(fù)雜基質(zhì)均具有較好的適用性[13]。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3855-2014中液相色譜法選用陰離子交換色譜柱為固定相，以高濃度磷酸鹽緩沖體系為流動(dòng)相，測(cè)定飲料和罐頭食品中乙二胺四乙酸二鈉的含量[14]。然而，離子對(duì)試劑易造成色譜柱使用壽命與系統(tǒng)靈敏度降低，高鹽流動(dòng)相體系易堵塞儀器管路，對(duì)色譜分離系統(tǒng)造成損傷[14]。

現(xiàn)有的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中僅提供了罐頭食品和復(fù)合調(diào)味料中乙二胺四乙酸鹽的檢測(cè)方法[13-14，16]，尚未發(fā)布面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸鹽檢測(cè)的相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)已報(bào)道的文獻(xiàn)使用離子對(duì)試劑為流動(dòng)相[17-18]，無(wú)法避免離子對(duì)試劑對(duì)色譜柱壽命、色譜系統(tǒng)靈敏度的損傷。

在無(wú)離子對(duì)試劑和高鹽緩沖液條件下，本文以甲醇-水混合體系為流動(dòng)相，選用親水性C18反相液相色譜柱，建立了面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二鈉的檢測(cè)方法。本方法分析過程中避免了流動(dòng)相中使用離子對(duì)試劑和高鹽流動(dòng)相，降低了對(duì)色譜分離系統(tǒng)的損傷，同時(shí)方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器和Agilent OpenLAB CDS ChemStation Rev.C.01.05色譜工作站(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；色譜柱 Agilent SB-C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)、Agilent SB-Aq C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)、Agilent SAX(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；BSA224S-CW電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；T890/H超聲波清洗機(jī)(德國(guó)Elma公司)；Milli-Q Advantage Direct 16超純水系統(tǒng)(德國(guó)默克密理博公司)；FE20 FIVEEASY pH計(jì)(梅特勒-托利儀器(上海)有限公司)；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 材料與試劑

面粉、面條、餃子皮等面制品均為市售。

甲醇(色譜純，默克股份兩合公司)；濃鹽酸、濃磷酸、三氯化鐵(FeCl3·6H2O)(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉二水合物標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)：6381-92-6，純度≥99.0%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；0.2 μm有機(jī)相濾膜(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.3 溶液的配制

0.02 mol/L三氯化鐵溶液：稱取0.54 g三氯化鐵，溶于90 mL水中，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入0.03 mL鹽酸，加入超純水定容至100 mL，混勻，備用。

1.0 mol/L磷酸溶液：量取68 mL濃磷酸，超純水稀釋，定容至1 000 mL，混勻，備用。

乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取0.102 0 g乙二胺四乙酸二鈉二水合物標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解轉(zhuǎn)移入棕色容量瓶中，加入超純水定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品處理方法

稱取5.00 g面粉或面粉制品，置于50 mL離心管中，加入25 mL水，渦旋混勻，超聲30 min，7 500 r/min離心5 min，取上清液置于50 mL容量瓶中。剩余殘?jiān)屑尤?5 mL水重復(fù)提取1次，離心后合并上清液，向其中加入衍生化試劑0.02 mol/L三氯化鐵溶液1.0 mL，加入超純水定容至刻度，混勻，室溫下超聲20 min。取2.0 mL衍生后溶液于4 mL離心管中，加入三氯甲烷2.0 mL，混勻，15 000 r/min離心5 min，棄去有機(jī)相，水相過0.2 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液衍生化處理方法

吸取1.0 mL乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次準(zhǔn)確吸取0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、 2.50 mL該標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加入0.02 mol/L三氯化鐵溶液1.0 mL，混勻，加超純水定容至10 mL。室溫下超聲20 min后，得到質(zhì)量濃度依次為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.6 液相色譜條件

色譜柱：Agilent SB-Aq C18柱(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水體系(10∶90，體積比)，使用1.0 mol/L磷酸溶液調(diào)至pH 4.0；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

從分子結(jié)構(gòu)上看，乙二胺四乙酸二鈉分子結(jié)構(gòu)中缺少能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈紫外吸收的共軛結(jié)構(gòu)，因此在紫外區(qū)吸收十分微弱，需借助于與過渡金屬離子絡(luò)合形成具有共軛結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物增強(qiáng)紫外吸收[19-20]。已報(bào)道文獻(xiàn)常以Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)為絡(luò)合離子，在酸性條件下與乙二胺四乙酸二鈉發(fā)生衍生化反應(yīng)得到穩(wěn)定的乙二胺四乙酸銅絡(luò)合物或鐵絡(luò)合物，然后采用反相離子對(duì)液相色譜法進(jìn)行分析。鑒于乙二胺四乙酸鐵絡(luò)合物比乙二胺四乙酸銅絡(luò)合物具有更高的穩(wěn)定常數(shù)[20]，在應(yīng)用中穩(wěn)定性、可靠性更佳，因此，本實(shí)驗(yàn)以Fe(Ⅲ)為絡(luò)合離子，與乙二胺四乙酸二鈉進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后使用配備紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀測(cè)定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二鈉含量。乙二胺四乙酸二鈉衍生化反應(yīng)中三氯化鐵的用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等條件在文獻(xiàn)中已有詳細(xì)報(bào)道[21-22]，因此，本文的衍生化反應(yīng)條件參照已有文獻(xiàn)方法。

圖1 乙二胺四乙酸鐵鈉絡(luò)合物在Agilent SB-C18、SB-Aq C18、SAX色譜柱上的色譜圖Fig.1 Chromatograms of coordination compound EDTA-FeNa standard on Agilent SB-C18，SB-Aq C18 and SAX columns

2.1 色譜柱的選擇

采用液相色譜檢測(cè)乙二胺四乙酸二鈉的方法中常借助離子對(duì)試劑與離子態(tài)乙二胺四乙酸陰離子結(jié)合生成電中性內(nèi)鹽吸附于固定相中，提高分離效果。黃建等[21]采用以四丁基氫氧化銨為反相離子對(duì)試劑的甲酸水溶液為流動(dòng)相，研究了乙二胺四乙酸二鈉在果味飲料中的檢測(cè)方法。魏冬旭等[22]開發(fā)了使用陰離子交換色譜柱分析啤酒、飲料、八寶粥、番茄醬、板栗罐頭等基質(zhì)中乙二胺四乙酸二鈉的超高效液相色譜檢測(cè)方法。然而，離子對(duì)試劑和高鹽強(qiáng)酸流動(dòng)相易對(duì)色譜分離系統(tǒng)造成不可逆損傷。

在高效液相色譜分析中，影響色譜峰分離效果的因素眾多，其中色譜柱是決定因素之一。為得到較好的分離效果及峰形，本實(shí)驗(yàn)以不添加離子對(duì)試劑的甲醇-水體系為流動(dòng)相，對(duì)Agilent SB-C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)、Agilent SB-Aq C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)、Agilent SAX(150 mm × 4.6 mm，5 μm) 3種色譜柱的分離效果進(jìn)行了比較。如圖1所示，采用“1.6”所述液相色譜條件，Agilent SB-C18和Agilent SAX兩款色譜柱對(duì)乙二胺四乙酸鐵鈉絡(luò)合物的保留能力均較弱，不滿足檢測(cè)要求；乙二胺四乙酸鐵鈉絡(luò)合物在Agilent SB-Aq C18色譜柱上的峰形對(duì)稱、分析時(shí)間適中，滿足檢測(cè)要求。因此，本方法選用Agilent SB-Aq C18色譜柱。

2.2 流動(dòng)相的選擇

圖2 不同pH值條件下乙二胺四乙酸鐵鈉的色譜圖Fig.2 Chromatograms of EDTA-FeNa standard eluted with mobile phases under different pH value conditions

圖3 加標(biāo)面粉樣品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of spiked flour samplea.spiked flour solution cleaned up by chloroform;b.spiked flour solution uncleaned up by chloroform;c.flour solution;d:standard solution;* stands for peak of EDTA-FeNa

2.2.1流動(dòng)相pH值的影響以1.0 mol/L磷酸溶液為酸度調(diào)節(jié)劑，將pH值分別調(diào)至3.0、4.0、5.0。在甲醇-水(10∶90)流動(dòng)相條件下，當(dāng)流動(dòng)相pH值為3.0時(shí)，乙二胺四乙酸鐵鈉的保留時(shí)間僅4.0 min，保留時(shí)間過短，易與樣品基質(zhì)中的干擾物重合；當(dāng)流動(dòng)相pH值為5.0時(shí)，乙二胺四乙酸鐵鈉的色譜峰出現(xiàn)峰展寬或雙峰，這可能與弱酸性條件下部分乙二胺四乙酸鐵鈉在流動(dòng)相中發(fā)生水解反應(yīng)，引起組分的保留性質(zhì)發(fā)生變化有關(guān)；當(dāng)流動(dòng)相pH值為4.0時(shí)，目標(biāo)物出峰時(shí)間在6.5 min附近，保留時(shí)間適中，峰形對(duì)稱，如圖2所示。結(jié)果表明，流動(dòng)相pH值會(huì)對(duì)乙二胺四乙酸鐵鈉的出峰時(shí)間、峰形產(chǎn)生顯著影響。因此，為了滿足檢測(cè)要求，選用流動(dòng)相pH值為4.0。

2.2.2有機(jī)相甲醇體積分?jǐn)?shù)的影響以甲醇-水(pH 4.0)體系為流動(dòng)相，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)由10%增至20%時(shí)，流動(dòng)相的洗脫能力增強(qiáng)，乙二胺四乙酸鐵鈉的保留時(shí)間縮短，然而離子化合物在流動(dòng)相中的溶解度降低導(dǎo)致色譜峰分叉；當(dāng)流動(dòng)相中不含甲醇時(shí)，流動(dòng)相的洗脫能力減弱導(dǎo)致目標(biāo)物出峰延遲和峰展寬。當(dāng)甲醇為10%時(shí)，保留時(shí)間適中，峰形對(duì)稱，因此，最終確定流動(dòng)相中有機(jī)相組成為10%甲醇。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

面粉樣品加水提取后，形成渾濁的懸濁液，靜置離心后，上清液按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.278-2016[13]的固相萃取柱凈化法凈化，操作過程中會(huì)因提取液中溶解的淀粉大分子有機(jī)物析出，造成固相萃取柱堵塞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。文獻(xiàn)報(bào)道采用三氯甲烷凈化提取[22]，除去雜質(zhì)，可降低對(duì)色譜柱和儀器的損傷。本文以空白面粉為樣品，添加50.0 mg/kg乙二胺四乙酸二鈉，經(jīng)水溶液提取，三氯化鐵衍生反應(yīng)后，比較了三氯甲烷的凈化結(jié)果。結(jié)果表明，使用三氯甲烷凈化與否，不會(huì)在色譜圖上產(chǎn)生顯著差異(圖3)。但使用三氯甲烷為凈化試劑時(shí)，三氯甲烷與水的兩相交界層間存在明顯的固體析出，說明三氯甲烷可以發(fā)揮沉淀劑的作用，同時(shí)不會(huì)造成提取液中的乙二胺四乙酸鐵鈉損失。因此，本文使用操作簡(jiǎn)單、快速的三氯甲烷凈化法凈化提取液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍、檢出限與定量下限采用優(yōu)化色譜條件，對(duì)“1.5”配制的乙二胺四乙酸二鈉系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，以儀器響應(yīng)峰面積(Y)對(duì)乙二胺四乙酸鐵鈉絡(luò)合物的質(zhì)量濃度(X，mg/L)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，當(dāng)乙二胺四乙酸鐵鈉絡(luò)合物質(zhì)量濃度為1.0～50.0 mg/L時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=12.965 4X-5.515 4，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。

向空白面粉基質(zhì)中添加乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品,以3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限(LOD)為3.0 mg/kg；以S/N=10確定定量下限(LOQ)為10.0 mg/kg。本方法具有良好的線性范圍和靈敏度，適用于面粉基質(zhì)中乙二胺四乙酸二鈉的檢測(cè)。

2.4.2回收率與精密度分別向不含待測(cè)物的面粉中添加10.0、 50.0、 200 mg/kg的乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，加標(biāo)樣品色譜圖見圖3。其平均加標(biāo)回收率為95.0%～103%，RSD為4.0%～6.3%，表明該方法重復(fù)性良好、準(zhǔn)確可靠，適用于面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸鹽含量的測(cè)定。

2.5 市售面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸鹽的含量

應(yīng)用本文建立的分析方法，對(duì)市售的面粉、面條、餃子皮等90份面粉及其制品進(jìn)行測(cè)定。其中有3份面粉中檢出乙二胺四乙酸二鈉，含量為110～120 mg/kg；11份面條及餃子皮等面粉制品中檢出乙二胺四乙酸二鈉，含量為50～80 mg/kg；其余樣品中乙二胺四乙酸二鈉含量均低于方法檢出限。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用親水性C18反相液相色譜柱，以甲醇-水(90∶10，體積比)為流動(dòng)相，建立了測(cè)定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二鈉含量的高效液相色譜方法。本方法前處理方法簡(jiǎn)單、分離效果好，重復(fù)性良好、準(zhǔn)確可靠，同時(shí)可在非離子對(duì)試劑和高鹽強(qiáng)酸流動(dòng)相條件下實(shí)現(xiàn)面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二鈉含量的測(cè)定。

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Determination of Disodium Ethylenediaminotetraacetic Acid in Flour and Its Products by High Performance Liquid Chromatography

WU Li-jian，LAI Guo-yin，BAI Song，LIN Li-yi，ZHENG Xiang-hua，XU Dun-ming*，ZHANG Zhi-gang

(Inspection and Quarantine Technology Center，Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026，China)

In the absence of ion-pair reagents or high-salt buffer condition，a novel method for the quantitative analysis of disodium ethylenediaminotetraacetic acid in flour and its products by high performance liquid chromatography was developed，employing hydrophilic C18reversed-phase liquid chromatography column and methanol-water system as mobile phase.Samples were extracted with aqueous solution，and reacted with ferric chloride by ultrasound irradiation to product stable derivative which was cleaned up with trichloromethane.To determine ethylenediaminotetraacetic acid disodium in flour and flour products，the analytes were determined by high performance liquid chromatography with a wavelength of 260 nm and a hydrophilic C18reversed phase liquid chromatography column using mobile phases of pH 4.0 methanol and aqueous solution(10∶90，by volume).Under the optimal conditions，the calibration curves of the analytes were linear in the concentration range of 1.0-50.0 mg/L with the correlation coefficients of 0.999 6.The limits of quantification(LOQs) were 10.0 mg/kg，and the limits of detection(LODs) were 3.0 mg/kg.At spiked levels of 10.0-200 mg/kg，the average recoveries of spiked samples ranged from 95.0%to 103%，with relative standard deviations between 4.0%and 6.3%.The method could meet the requirement for the rapid screening and quantitative analysis of disodium ethylenediaminotetraacetic acid in flour and its products.

disodium ethylenediaminotetraacetic acid;flour products;high performance liquid chromatography;hydrophilic C18reversed-phase liquid chromatography column

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.011

O657.7；TS201.6

A

1004-4957(2017)10-1230-05

2017-05-15；

2017-07-05

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014J01057，2017J01020)；國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016IK186)

*

徐敦明，博士，研究員，研究方向：食品安全，Tel:0592-6803438，E-mail:xudm@xmciq.gov.cn