水蒸氣蒸餾法提取茜草精油抑菌活性及其機(jī)理的研究

權(quán)美平 ， 田呈瑞

（1.陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2.陜西省河流濕地生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 渭南 714000；3.渭南師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，陜西 渭南714000）

水蒸氣蒸餾法提取茜草精油抑菌活性及其機(jī)理的研究

權(quán)美平1，2，3， 田呈瑞*1

（1.陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2.陜西省河流濕地生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 渭南 714000；3.渭南師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，陜西 渭南714000）

以濾紙片及刃天青法測定受試菌抑菌圈直徑及MIC、MBC，為水蒸氣蒸餾法提取所得茜草精油的抑菌活性提供依據(jù)；另外，通過受試菌在受到精油作用后生長曲線、電導(dǎo)率及表面超微結(jié)構(gòu)的變化初步研究了精油的抑菌機(jī)理。抑菌圈、MIC和MBC結(jié)果表明：精油對(duì)G+（表面葡萄球菌）和G-（痢疾桿菌）效果較強(qiáng)；對(duì)G+（枯草芽孢桿菌）和G-（大腸桿菌）效果較弱。生長曲線、細(xì)胞膜通透性及細(xì)菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果表明：抑菌機(jī)理可能源于茜草精油能有效地抑制細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長期分裂速度，導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性的增加。

茜草；精油；抑菌活性；刃天青法

茜草（Rubia cordifolia L.）俗稱紅根草、血茜草、活血草、土丹參、血見愁等，是茜草科茜草屬多年生攀援草本植物[1]。茜草的干燥根及根莖，為傳統(tǒng)常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，名為“茜根”，列為上品。茜草自古就被作為天然染料、化妝品和食品的著色劑和藥用植物使用[2-3]，具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值。由于茜草干根及莖自古代就作為天然染料、食品的著色劑和藥用植物使用，它的化學(xué)成分、藥理和臨床作用被深入系統(tǒng)的研究[4-5]。其味苦，性寒，歸肝、心經(jīng)，具有涼血、止血、祛瘀、通經(jīng)之功效，主治吐血、衄血、崩漏、外傷出血、經(jīng)閉瘀阻、關(guān)節(jié)痹痛、跌撲腫痛等[6]；亦具抗菌[7]、抗癌[8]、增強(qiáng)免疫[9]、護(hù)肝[10]和抗氧化[11-12]等生物活性。作為一種中國傳統(tǒng)中藥材，它有著悠久的應(yīng)用歷史；而且茜草具有特殊的芳香氣味，但到目前為止還未見茜草揮發(fā)性成分精油抑菌活性的研究報(bào)道。本研究中以水蒸氣蒸餾法提取的精油對(duì)易引起的食源性疾病的幾種常見的食品腐敗菌進(jìn)行抑菌活性研究，并對(duì)茜草精油的抑菌機(jī)理進(jìn)行了初步探索，期望可為茜草這一天然植物資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

茜草干根：購于西北中藥材市場（陜西渭南南源采藥者提供），粉碎過40目篩，低溫密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

供試菌種：革蘭氏陰性菌：Escherichia coli（大腸桿菌）、Shigella dysenteriae（痢疾桿菌）、Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門氏菌）；革蘭氏陽性菌：Bacillus cereus（蠟狀芽孢桿菌）、Staphylococcus aureus（金黃色葡萄球菌）、Staphylococcus albus（表皮葡萄球菌）、Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌）：均由山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑：刃天青 （Resazurin），Sigma公司產(chǎn)品；慶大霉素（8萬單位），鄭州卓峰制藥廠產(chǎn)品；牛肉膏、蛋白胨、肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；其余所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

揮發(fā)油提取器：西安紅偉化玻儀器設(shè)備公司產(chǎn)品；Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀：熱電公司產(chǎn)品；DDS-307電導(dǎo)率儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；S-3400N掃描電子顯微鏡：日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茜草精油的提取與制備 采用常規(guī)水蒸氣蒸餾法提取茜草精油。具體操作如下：粉碎至40目的茜草干粉40 g浸泡4 h，加水500 mL，加熱回流提取至精油量不再增加，停止加熱；正己烷萃取收集合并揮發(fā)油，以無水硫酸鈉干燥，得黃色結(jié)晶片狀固態(tài)精油，-40℃保存以備用分析。精油的稀釋與準(zhǔn)備：精確稱取80 mg的揮發(fā)油，加入10 mL DMSO，配制成初始質(zhì)量濃度8 mg/mL，然后用倍半法稀釋為系列濃度，精油的濃度范圍0.0313～8mg/mL。

1.3.2 抑菌活性及機(jī)理的測定

1）抑菌圈的測定：在無菌條件下，參考高春燕等[13]的方法并略作修改。

2）刃天青法測定MIC和MBC[14-15]：將各種菌懸液調(diào)節(jié)至濃度為107CFU/mL，混勻取70 μL加入到96孔板中，無菌對(duì)照組不添加；取等量肉湯培養(yǎng)基和質(zhì)量濃度為0.02 g/dL的刃天青指示劑儲(chǔ)備液混勻，將此混勻液取100 μL加入到96孔板中；取各質(zhì)量濃度的茜草精油樣品（初始質(zhì)量濃度為8 mg/mL，以兩倍稀釋法稀釋的系列濃度）10 μL，依次加入至96孔板中，同時(shí)設(shè)置無菌對(duì)照孔（含有指示劑的混勻液）、陰性對(duì)照孔（溶劑對(duì)照，含菌種無精油）和陽性對(duì)照孔（精油以慶大霉素代替）。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)，每5～6 h觀測一次，有細(xì)菌生長的孔會(huì)逐漸由藍(lán)色變粉色，其中無菌對(duì)照孔為藍(lán)色，以發(fā)生顏色變化的前一孔為最低抑菌濃度（MIC）。最低抑菌濃度（MIC）確定后，吸取所有未變色濃度的樣品5 μL，加入到100 μL的培養(yǎng)基與刃天青指示劑貯備液中，同樣的條件培養(yǎng)24 h，仍舊不見顏色變化的管中，最小樣品濃度即為MBC。

3）茜草精油對(duì)微生物生長曲線的影響：參考高春燕等[13]的方法并略作修改。

4）茜草精油對(duì)微生物細(xì)胞膜通透性的影響[16]：取活化后的菌液濃度為107CFU/mL的菌懸液200 mL，以3 000 r/min離心15 min；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的葡萄糖溶液洗3遍，使得菌體的菌懸液與5%的葡萄糖電導(dǎo)率相近。取3個(gè)100 mL的錐形瓶，各加入上述菌懸液50 mL，分別加入1×MIC的精油1 mL，以溶劑代替提取液作空白。搖勻后，立即測定電導(dǎo)率值，記為L1。置于室溫下，每隔一定時(shí)間間隔1、2、4、6、8 h取出測定電導(dǎo)率值，記為 L2；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取一定量空白組的菌懸液，沸水浴10 min，冷卻后測定其電導(dǎo)率，記為L0；測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%葡萄糖的電導(dǎo)率，記為L0′。電導(dǎo)率的計(jì)算方法如下：

（5）茜草精油對(duì)微生物超微結(jié)構(gòu)的影響：按Kockro等人的方法并略作修改[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用DPS軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈直徑測定結(jié)果

表1 茜草精油對(duì)微生物的抑菌圈直徑（DIZ）Table 1 Diameter of inhibition zones（DIZ） of essential oil from R.cordifolia root

茜草精油、陰性對(duì)照和慶大霉素對(duì)食品中常見的7種微生物包括4種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌的抑制作用，結(jié)果見表1。

茜草精油的抑菌作用以產(chǎn)生的抑菌圈直徑（inhibitory zone diameter，IZD）包括原始濾紙片直徑大小來判斷。據(jù)文獻(xiàn)中抑菌試驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)[17]：最敏感為IZD>15 mm，中敏感15 mm≥IZD≥10 mm，低敏感9 mm≥IZD≥7 mm，無抑菌圈為不敏感。由表1可知，陽性對(duì)照的最小IZD 19.35 mm>15 mm，而陰性對(duì)照表現(xiàn)為無抑菌圈形成，可判定慶大霉素對(duì)測試的7種微生物很敏感，都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用；然而作為精油溶劑的二甲基亞砜（DMSO）對(duì)所試微生物不敏感，沒有表現(xiàn)出任何抑菌作用。茜草精油對(duì)G+菌中的金黃色葡萄球菌、蠟狀芽胞桿菌和表皮葡萄球菌的 IZD分別為 10.67、13.00 mm和14.33 mm；對(duì)G-菌中的痢疾桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的IZD分別為10.57 mm和11.33 mm；精油對(duì)這5種菌種有較好的抑菌效應(yīng)，屬于中敏感。綜合來看，就對(duì)4種G+細(xì)菌抑制作用而言，茜草精油對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果較差，而對(duì)表皮葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用；就對(duì)3種G-細(xì)菌的抑制作用而言，茜草精油表現(xiàn)出對(duì)于鼠傷寒沙門氏菌和痢疾桿菌較敏感的抑制活性，而對(duì)大腸桿菌的效果較差，可見茜草精油對(duì)不同微生物的生長的抑制作用有明顯的差異。

2.2 茜草精油抑菌活性MIC和MBC的測定結(jié)果

為了進(jìn)一步明確茜草精油的抑菌活性，刃天青法測定了茜草精油抑菌作用的最小抑菌濃度（MIC）和最小致死濃度（MBC）。MIC和MBC值越小，抑菌效果越好，說明在較低的質(zhì)量濃度下，就可以抑制微生物的生長或幾乎完全殺滅微生物。茜草精油抑菌活性的MIC及MBC結(jié)果見表2和圖1。

表2 茜草精油抑菌作用的MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of the essential oil from R.cordifolia root mg/mL

圖1 茜草精油抑菌作用的MIC/（mg/mL）Fig.1MICoftheessentialoilfromR.cordifoliaroot（mg/mL）

試驗(yàn)采用刃天青顯色法測定了茜草精油的MIC和MBC，研究表明[14，18]刃天青指示劑法與傳統(tǒng)的試管稀釋法測定MIC及MBC的結(jié)果具有良好的一致性；與稀釋法相比較，刃天青法具有操作過程耗用試劑及樣品量少，結(jié)果直觀穩(wěn)定，方法靈敏可靠的優(yōu)點(diǎn)。所以，對(duì)植物提取分離終產(chǎn)品稀少且價(jià)值較高的樣品，此方法具有重要的借鑒價(jià)值。由表2和圖1的數(shù)據(jù)可以看出，陰性對(duì)照二甲基亞砜（DMSO）對(duì)所測試的微生物未表現(xiàn)出任何抑制或殺滅作用，而陽性對(duì)照慶大霉素對(duì)測試微生物抑菌活性的MIC和MBC都是小于或等于0.062 5 mg/mL，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制和殺滅作用。茜草精油對(duì)測試微生物都起到了一定程度地抑制和殺滅的效果，抑菌活性的MIC和MBC范圍分別為0.062 5～1.000 0 mg/mL和0.125 0～4.000 0 mg/mL。茜草精油對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的MIC（0.062 5 mg/mL）比別的受試菌種的都低，這與這與本文抑菌圈研究結(jié)果一致。

2.3 茜草精油對(duì)微生物生長曲線的影響

試驗(yàn)以G+蠟樣芽胞桿菌為受試菌種測定了茜草精油對(duì)其生長曲線的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 茜草精油對(duì)微生物生長曲線的影響Fig.2 Effect of essential oil from R.cordifolia root on the growth cruve of microorganisms

微生物生長的快慢以菌懸液體系的濁度體現(xiàn)即以檢測中的吸光度值表示，吸光度值越大，說明菌體繁殖和生長的越快。由圖2可知，與正常對(duì)照組相比，培養(yǎng)液中加入茜草精油后，在測定時(shí)間內(nèi)，樣品組的吸光值均低于對(duì)照組，說明微生物的生長受到明顯的阻滯作用，而且微生物的對(duì)數(shù)生長期呈現(xiàn)縮短趨勢。茜草精油抑菌效應(yīng)的產(chǎn)生，應(yīng)與茜草精油具有能夠抑制受試菌菌體生長和分裂的能力應(yīng)該有密切關(guān)系。

2.4 茜草精油對(duì)微生物細(xì)胞膜通透性的影響

試驗(yàn)中測定了茜草精油對(duì)G+蠟樣芽胞桿菌細(xì)胞膜通透性的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 茜草精油對(duì)微生物細(xì)胞膜通透性的影響Fig.3 Effect of essential oil from R.cordifolia root on the impermeability of cell membrane of tested microorganisms

為進(jìn)一步驗(yàn)證茜草精油對(duì)于食源性病原菌的抗菌作用方式，以細(xì)菌膜的滲透性即電解質(zhì)漏滲率或稱為相對(duì)電導(dǎo)率來表征。細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障，當(dāng)細(xì)菌遇到強(qiáng)抑菌劑而使細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，菌體的保護(hù)屏障被打破，使其內(nèi)部電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中，進(jìn)而使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升。因此，菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化[19]。由圖3可知，茜草精油對(duì)菌種作用的前2 h內(nèi)，相對(duì)電導(dǎo)率的變化不顯著，隨后電導(dǎo)率的變化增幅明顯，原因可能就是源于細(xì)菌的正常細(xì)胞溶解和死亡導(dǎo)致溶液電導(dǎo)率的增加；隨著作用時(shí)間的延長，茜草精油對(duì)細(xì)胞膜逐漸產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分如K+、Ca2+、Na+等電解質(zhì)的泄露，致使菌液的電導(dǎo)率逐漸上升，這與Diao等[16]關(guān)于茴香精油對(duì)痢疾桿菌的作用機(jī)制中電導(dǎo)率的研究一致。所以，茜草精油的抑菌效果應(yīng)該與其能破壞微生物的細(xì)胞膜具有密切關(guān)系。

2.5 茜草精油對(duì)微生物超微結(jié)構(gòu)掃描電鏡的觀察結(jié)果

微生物超微結(jié)構(gòu)的觀察便于進(jìn)一步研究茜草精油抑菌活性的機(jī)理。試驗(yàn)中觀察了茜草精油處理前后微生物細(xì)胞的形態(tài)變化，掃描電鏡微生物超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果見圖4。

圖4的掃描電鏡的觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)：與對(duì)照組相比，茜草精油處理后的微生物細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)均發(fā)生了不同程度的損傷和破壞。經(jīng)茜草精油處理后，微生物細(xì)胞外層的保護(hù)性組織如細(xì)胞壁和細(xì)胞膜遭受了一定程度的損傷，所以導(dǎo)致細(xì)胞原始形態(tài)發(fā)生了巨大的變化，如發(fā)生了發(fā)生變形、破碎和斷裂（圖（b）和圖（d）），而未經(jīng)茜草精油處理的正常對(duì)照微生物細(xì)胞完整、飽滿，且表面光滑（圖（a）和（c））。茜草精油可以導(dǎo)致微生物出現(xiàn)物理性的損傷和形態(tài)學(xué)上的改變，進(jìn)而容易導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄露、受損和發(fā)生代謝紊亂和死亡。這些損傷性的變化可能成為抑制微生物生長和導(dǎo)致微生物的死亡的根本原因。

圖4 微生物掃描電鏡觀察圖Fig.4 Scanning electron microscope observations of the tested bacteria

3 結(jié)語

通過測定水蒸氣蒸餾法提取的茜草精油對(duì)不同受試菌種的抑菌圈直徑、刃天青法測定MIC和MBC，并以 MIC為基礎(chǔ)，研究了茜草精油對(duì)蠟樣芽孢桿菌的生長曲線，菌液電導(dǎo)率變化及微生物的超微結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果表明，茜草精油對(duì)G+中的表皮葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌及金黃色葡萄球菌效果較好，對(duì)G-中的鼠傷寒沙門氏菌和痢疾桿菌效果較好。通過微生物生長曲線、細(xì)菌膜通透性及微觀結(jié)構(gòu)的觀察表明，茜草精油主要縮短細(xì)菌的對(duì)照生長期而有效的抑制了細(xì)菌的增長；且抑制作用可能源于茜草精油中的抑菌活性成分作用于菌種細(xì)胞壁和細(xì)胞膜系統(tǒng)，破壞了細(xì)胞的完整性，導(dǎo)致微生物細(xì)胞內(nèi)溶物的大量損失和細(xì)胞的自溶現(xiàn)象，從而抑制微生物的生長，導(dǎo)致微生物的死亡[19]。

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Study on the Antibacterial Activity and Its Mechanism of Essential Oil from Madder（Rubia cordifolia L.）Extracted by Hydrodistillation

QUAN Meiping1，2，3， TIAN Chengrui*1
（1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，China；2.Key Lab of Ecology and Environment of River Wetland of Shaanxi province，Weinan 714000，China；3.College of Chemistry and Life Science，Weinan Normal University，Weinan 714000，China）

Diameter of inhibition zones （DIZ），MIC&MBC detection via filter paper disk and Resazurin method were investigated on essential oil from the the Rubia Cordifolia L.（REO） to provide a scientific basis for the antibacterial activity of REO.In addition，change on growth curve，conductivity and cell surface ultra-microstructure of the tested bacteria treated with REO were also studied to explore the antimicrobial mechanism.The results of DIZ，MIC&MBC showed that REO was more sensitive to G+（Staphylococcus albus） and G-（Shigella dysenteriae） than G+（Bacillus subtilis）and G-（Escherichia coli）.The results of growth curve，membrane permeability and cell ultrastructure of tested bacteria showed that antibacterial mechanism may due to inhibition split speed of bacterial exponential phase and leading to the increase inpermeability of cell membranes.

Rubia cordifolia，essential oil，antimicrobial activity， resazurin

R 284.2

A

1673—1689（2017）08—0843—06

10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.08.009

2015-06-10

渭南師范學(xué)院化學(xué)校級(jí)特色學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（14TSXK04）；2017年度陜西省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（17JK0274）。

*通信作者：田呈瑞（1955—），男，陜西周至人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事植物資源開發(fā)與利用的研究。E-mail：qmp78@163.com

權(quán)美平，田呈瑞.水蒸氣蒸餾法提取茜草精油抑菌活性及其機(jī)理的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（08）：843-848.