人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV-3/Taxol的建立及其耐藥機(jī)制研究

(開(kāi)封市祥符區(qū)第一人民醫(yī)院,河南 開(kāi)封 475100)

人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV-3/Taxol的建立及其耐藥機(jī)制研究

石動(dòng)菊

(開(kāi)封市祥符區(qū)第一人民醫(yī)院,河南 開(kāi)封 475100)

目的建立紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV-3/Taxol, 探討卵巢癌紫杉醇獲得性耐藥潛在的分子機(jī)制。方法以人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3為親本細(xì)胞，采用紫杉醇(Taxol)濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV-3/Taxol。光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡水平, 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)多藥耐藥基因以及凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。結(jié)果建立的紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV-3/Taxol對(duì)紫杉醇具有顯著耐藥性，對(duì)阿霉素及5-氟脲嘧啶(5-FU)也產(chǎn)生強(qiáng)烈的交叉耐藥，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生明顯的變化。與親本細(xì)胞相比，SKOV-3/Taxol細(xì)胞G2/M阻滯明顯低于SKOV-3，其凋亡率也顯著低于SKOV-3，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05 )，耐藥細(xì)胞株中MRP1、MAP-Tau和CDK1基因表達(dá)水平顯著提高。結(jié)論成功建立人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV-3/Taxol的基礎(chǔ)上，多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1、微管相關(guān)蛋白MAP-Tau以及細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(CDK1)基因過(guò)表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥有關(guān)。

紫杉醇；多藥耐藥；卵巢癌； SKOV-3/Taxol 細(xì)胞株；MRP1

紫杉醇(PacliTaxol,Taxol)是從紅豆杉樹(shù)皮中提取的一種抗腫瘤藥物[1]，它對(duì)大多數(shù)實(shí)體瘤尤其對(duì)晚期卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等具有顯著的抗癌活性，對(duì)卵巢癌[2，3]、子宮頸癌、肺癌和白血病等惡性腫瘤也有一定療效，但耐藥的產(chǎn)生極大地限制了其臨床療效和應(yīng)用范圍。紫杉醇的作用靶點(diǎn)是構(gòu)成細(xì)胞骨架的微管，主要通過(guò)促進(jìn)微管蛋白迅速合成微管及阻止其解聚，將腫瘤細(xì)胞阻遏在G2期和M期，從而抑制其有絲分裂，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[4]。目前紫杉醇耐藥細(xì)胞株的體外研究主要集中在乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、食管癌和肝癌等，而卵巢癌紫杉醇耐藥的體外研究較為少見(jiàn)。為此，本文擬采用濃度梯度遞增法建立紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV-3/Taxol，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以進(jìn)一步探討卵巢癌細(xì)胞中紫杉醇獲得性耐藥發(fā)生的新機(jī)制。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株

實(shí)驗(yàn)采用的SKOV-3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。SKOV-3/Taxol為本室采用紫杉醇濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立的卵巢癌耐藥細(xì)胞株，能在含紫杉醇濃度為0.7 μmol/L和1.5 μmol/L的培養(yǎng)基中長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞分別被命名為SKOV-3/Taxol 0.7和SKOV-3/Taxol 1.5。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3培養(yǎng)于含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的PRMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察方法

通過(guò)倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并照相。收集培養(yǎng)的細(xì)胞用4°C預(yù)冷的2%戊二醛固定2 h，再用0.1M二甲砷酸鈉緩沖液換液3次，每次2 h。之后用1%鋨酸4°C固定2 h，用0.1M二甲砷酸鈉緩沖液換液2次，每次15 min。接著梯度酒精脫水，環(huán)氧丙烷滲透，包埋，制備超薄切片，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

用碘化丙錠(PI)4℃避光染色30 min,300目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾后，用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)試，以488 nm為激發(fā)光源檢測(cè)細(xì)胞，用MODFIT LT 3.0軟件分析比較細(xì)胞周期分布變化。細(xì)胞凋亡檢測(cè)按美國(guó)BD公司Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)

Trizol法提取SKOV-3和SKOV-3-Taxol細(xì)胞總RNA， RT-PCR 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 2-△△CT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。

1.6 Western blot

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SKOV-3/Taxol耐藥細(xì)胞模型的建立

MTT檢測(cè)結(jié)果表明，SKOV-3/Taxol對(duì)紫杉醇具有顯著耐藥性，SKOV-3/Taxol 0.7與SKOV-3/Taxol 1.5對(duì)紫杉醇的耐藥指數(shù)分別為31.38和42.32，為高度耐藥；此外，它們對(duì)阿霉素(ADR)及5-氟尿嘧啶(5-FU)也產(chǎn)生強(qiáng)烈的交叉耐藥(見(jiàn)表1)。

表1 SKOV-3 和SKOV-3/Taxol對(duì)不同化療藥物的IC50及耐藥指數(shù)

注：1)與對(duì)照組比較，P<0.05；2)兩組比較，P<0.05

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

在倒置相差顯微鏡下觀察，可見(jiàn)對(duì)照組SKOV-3細(xì)胞株貼壁良好，細(xì)胞呈梭形或多邊形，少量圓形，胞體透亮，狀態(tài)佳；而SKOV-3/Taxol耐藥細(xì)胞株貼壁較差，細(xì)胞形狀欠規(guī)則，圓形或橢圓形細(xì)胞增多，細(xì)胞折光性差，較暗，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多。經(jīng)包埋、染色、切片后熒光顯微鏡下觀察，SKOV-3細(xì)胞大小較均一，邊界清楚，染色均勻；而SKOV-3/Taxol耐藥細(xì)胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，邊界欠清，并出現(xiàn)雙核、多核現(xiàn)象，核內(nèi)染色加深。見(jiàn)圖1。透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)親本細(xì)胞SKOV-3胞漿少，細(xì)胞核大，胞漿內(nèi)可見(jiàn)散在游離核糖體，細(xì)胞表面布滿不規(guī)則的微絨毛；而耐藥細(xì)胞SKOV-3/Taxol則胞核變小，核漿比例減小，胞漿內(nèi)空泡結(jié)構(gòu)明顯增多，游離核糖體聚集且數(shù)量增多，線粒體數(shù)量增多，細(xì)胞表面可見(jiàn)大量的小球狀隆起。見(jiàn)圖1。

11:36 2017-10-26圖1SKOV-3和SKOV-3-Taxol細(xì)胞形態(tài)(x200)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(x1 000)

2.3 細(xì)胞周期分布

相較于親本細(xì)胞SKOV-3，SKOV-3-Taxol 0.7耐藥細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少。SKOV-3-Taxol細(xì)胞的G2/M期阻滯明顯低于SKOV-3(P<0.05)，見(jiàn)圖2A。細(xì)胞凋亡結(jié)果分析本研究結(jié)果顯示經(jīng)1.5 umol/L紫杉醇處理24 h后，SKOV-3細(xì)胞產(chǎn)生非常明顯的凋亡現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞迅速增加，且不斷進(jìn)入凋亡后期的壞死階段；與此相反，SKOV-3-Taxol細(xì)胞凋亡明顯受到抑制, 其凋亡率顯著低于SKOV-3細(xì)胞(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2SKOV-3和SKOV-3-Taxol細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和和細(xì)胞周期分布圖

2.4 Real-time PCR結(jié)果分析

分別檢測(cè)親本與耐藥細(xì)胞株多藥耐藥相關(guān)基因(Mdr1、MRP1、LRP、GST-π、ToPo II)、凋亡抑制基因Bcl-2、β微管蛋白III 型(TUBB3)基因、微管相關(guān)蛋白Tau(MAP-Tau)基因、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(CDK1)基因以及TP53等10個(gè)基因mRNA表達(dá)水平。 Real-time PCR結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞相比，SKOV-3/Taxol耐藥細(xì)胞株中MRP1、MAP-Tau、CDK1以及MDR1基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平分別升高37倍、8倍、4.6倍和2倍；GST-π、LRP、TUBB3基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平下降了1-3倍，而TP53、ToPo II基因轉(zhuǎn)錄水平則無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖3。采用Western Blot結(jié)果與其mRNA的轉(zhuǎn)錄水平基本保持一致。見(jiàn)圖3。

圖3 Real Time PCR和Western Blot檢測(cè)耐藥基因的表達(dá)

3 討論

本文結(jié)果顯示建立的SKOV-3/Taxol耐藥細(xì)胞株對(duì)紫杉醇高度耐藥，且能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)，凍存或撤藥后仍能保持較高的耐藥性。細(xì)胞周期G2/M阻滯下降與細(xì)胞凋亡減少可能是卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥的機(jī)制之一，這一結(jié)果與以往的報(bào)道一致[5,6]。

P-gp 過(guò)表達(dá)被認(rèn)為是紫杉醇耐藥的常見(jiàn)機(jī)制之一[7]，MAP-Tau是近年來(lái)研究較為深入的一種影響紫杉醇敏感性的微管蛋白，Tau蛋白表達(dá)水平較高時(shí)，可導(dǎo)致紫杉醇的結(jié)合減少，從而表現(xiàn)出紫杉醇耐藥[8]。本研究發(fā)現(xiàn)SKOV-3-Taxol細(xì)胞內(nèi)MAP-Tau基因表達(dá)量提高8倍，進(jìn)一步證實(shí)了Tau蛋白表達(dá)水平與紫杉醇耐藥相關(guān)。

腫瘤多藥耐藥的產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，可能涉及多種因素和機(jī)制，但哪些因素或環(huán)節(jié)起到關(guān)鍵性作用還不是很清楚。本研究在成功建立人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV-3/Taxol的基礎(chǔ)上，證實(shí)了多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1、微管相關(guān)蛋白MAP-Tau以及細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(CDK1)基因過(guò)表達(dá)是引起卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的主要原因。

總之，成功建立人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV-3/Taxol的基礎(chǔ)上，多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1、微管相關(guān)蛋白MAP-Tau以及細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(CDK1)基因過(guò)表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥有關(guān)。

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本文編輯：周文超

R711.75

A

1671-0126(2017)05-0004-04

石動(dòng)菊，女，主治醫(yī)師，從事婦產(chǎn)科臨床工作