清熱解毒片特征圖譜的研究

(山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西 太原 030001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

清熱解毒片特征圖譜的研究

連云嵐，郝云芳，杜 娟，馮 貞

(山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西 太原 030001)

目的建立清熱解毒片特征圖譜，為評(píng)價(jià)清熱解毒片整體質(zhì)量提供依據(jù)。方法方法采用HPLC法，對(duì)清熱解毒片建立了特征圖譜，色譜柱采用自裝C18柱(日本富士填料；5μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm。結(jié)果共指認(rèn)出17個(gè)共有峰，包括處方中6味藥材。結(jié)論所建立的特征圖譜能反映清熱解毒片整體質(zhì)量狀況。

清熱解毒片；特征圖譜；HPLC

中藥指紋圖譜是指中藥經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的手段，得到的能夠標(biāo)示該中藥特征的共有峰的圖譜，是一種綜合的、可量化的鑒別手段，是當(dāng)前符合中藥特色的評(píng)價(jià)中藥真實(shí)性、穩(wěn)定性和一致性的質(zhì)量控制模式之一[1]。

清熱解毒片由生石膏、金銀花、玄參、地黃、連翹、梔子、甜地丁、黃芩、龍膽、板藍(lán)根、知母、麥冬等12味藥材組成，主要功效為清熱解毒，用于熱毒壅盛所致的發(fā)熱面赤，煩躁口渴，咽喉腫痛；流感、上呼吸道感染見(jiàn)上述證候者[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立清熱解毒片的特征圖譜，旨在評(píng)價(jià)不同企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量，盡量保證清熱解毒片從原料到工藝過(guò)程控制最終到制劑的均一穩(wěn)定

1 儀器與試藥

儀器：Agilent1260高效液相色譜儀，DAD 檢測(cè)器。

對(duì)照品：綠原酸(110753-201415，96.2%)、梔子苷(110749-201115，99.7%)、芒果苷(111607-200402，100%)、黃芩苷(110715-201318，93.3%)、連翹苷(110821-200406，100%)、哈巴俄苷(111730-200604，100%)、漢黃芩苷(112002-201501，98.8%)、黃芩素(111595-200604，100%)、漢黃芩素(1514-200001，100%)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

隱綠原酸(成都曼斯特；MUST-15011413；99.07%)，3、4-二咖啡?；鼘幩?成都曼斯特；MUST-14111411；99.05%)，3、5-二咖啡?；鼘幩?成都曼斯特；MUST-14071507；98.82%)，4、5-二咖啡?；鼘幩?成都曼斯特；MUST-14111414；99.84%)。

試藥：乙腈為色譜純；水為一級(jí)純化水；其他試劑均為分析純。

處方中12味藥材均由某藥業(yè)有限公司提供。

樣品：來(lái)源于2016年國(guó)家計(jì)劃抽驗(yàn)品種

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的考察

2.1.1 色譜柱的選擇試驗(yàn)過(guò)程中選擇以下3種不同的色譜柱：a)Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm，4.6 mm×250 mm)；b)自裝柱日本富士填料 C18(5μm，4.6 mm×250 mm)；c)Agilent ZORBAX SB-phenyl柱(5μm，4.6 mm×250 mm)。柱溫： 30℃，流速：1.0 mL/min。

比較結(jié)果，在自裝柱HPLC圖譜中有多個(gè)色譜峰且分離效果較好。綜合考慮，選用自裝柱作為指紋圖譜的色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)[3]，采用乙腈-0.4%磷酸梯度洗脫系統(tǒng)。見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用以上色譜柱及流動(dòng)相系統(tǒng)，譜圖上各個(gè)色譜峰的分離度較好，保留時(shí)間適中，故選此流動(dòng)相系統(tǒng)作為清熱解毒片的HPLC指紋圖譜檢測(cè)的流動(dòng)相系統(tǒng)。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用200～400 nm的DAD檢測(cè)器進(jìn)行掃描檢測(cè)。通過(guò)調(diào)整波長(zhǎng)觀(guān)察色譜圖發(fā)現(xiàn)，在276 nm波長(zhǎng)下的HPLC圖譜中色譜峰最多，且分離效果最好，故選定276 nm作為指紋圖譜的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 供試品溶液的制備

因清熱解毒片(膠囊)方中藥材有效成分多為苷類(lèi)，查閱相關(guān)經(jīng)文獻(xiàn)[3]，苷類(lèi)提取多采用不同濃度的甲醇或乙醇超聲提取，故采用正交設(shè)計(jì)助手(3.1版)對(duì)樣品的提取進(jìn)行三因素(提取溶劑、提取時(shí)間和溶劑量)三水平(50%甲醇、70%甲醇、甲醇；30、40、60 min；15、20、25倍)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4，5]，以黃芩苷峰面積為指標(biāo)，正交設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2～5。

表2 正交試驗(yàn)計(jì)劃表

表3 直觀(guān)分析表

表4 方差分析表

表5 交互作用表

從方差分析表看出，提取溶劑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有明顯影響，結(jié)合直觀(guān)分析和交互分析可以得出結(jié)論，采用A2B1C2條件下提取效率最高，即70%甲醇20 mL，提取30 min。

另外比較了70%甲醇和70%乙醇提取溶劑對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果無(wú)明顯差異，故從環(huán)保角度考慮，最終確定供試品制備條件為：取清熱解毒片適量，除去包衣，研細(xì)，精密稱(chēng)定0.5 g，精密加入70%乙醇20 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min(功率250W，頻率33KHz)，放冷，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 特征圖譜建立

共有峰的指認(rèn)：a)樣品測(cè)定分別采用色譜峰數(shù)目多且相對(duì)穩(wěn)定的某藥業(yè)有限公司的清熱解毒片共有色譜峰為特征峰建立對(duì)照特征圖譜。b)對(duì)照藥材的歸屬將清熱解毒片處方中除生石膏外的其余11味藥材，依清熱解毒片制法處理，并按照2.2供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備對(duì)照藥材溶液，進(jìn)樣藥材歸屬分析，結(jié)果11味藥材中有六味藥材出現(xiàn)了特征峰，分別為金銀花、梔子、知母、黃芩、連翹、玄參，其中金銀花、黃芩有幾類(lèi)群峰。c)對(duì)照品的歸屬為進(jìn)一步驗(yàn)證各峰的歸屬，將金銀花、梔子、知母、黃芩、連翹、玄參中已知化學(xué)成分(現(xiàn)有藥典收載的)的相應(yīng)對(duì)照品，如綠原酸、隱綠原酸、3,4-二咖啡?；鼘幩帷?,5-二咖啡?；鼘幩帷?,5-二咖啡?；鼘幩帷d子苷、芒果苷、黃芩苷、漢黃芩苷、連翹苷、哈巴俄苷等，進(jìn)樣分析，結(jié)果如下：連翹苷的保留時(shí)間為67.612，是連翹的特征峰；黃芩有4個(gè)峰，分別為黃芩苷(65.584)、漢黃芩苷(77.487)、黃芩素(88.136)、漢黃芩素(106.747)，其余為黃芩中的未知成分；金銀花有5個(gè)峰，分別為綠原酸(27.169)、隱綠原酸( 28.724)、3,4-二咖啡?；鼘幩?52.986)、3,5-二咖啡?；鼘幩?54.846)、4,5-二咖啡?；鼘幩?58.775)，其余為金銀花中的未知成分；芒果苷的保留時(shí)間為34.514 ，是知母的特征峰；哈巴俄苷的保留時(shí)間為74.218，是玄參的特征峰；31.409為梔子苷和龍膽苦苷的共有峰。d)清熱解毒片指紋圖譜對(duì)照?qǐng)D譜的建立由上述分析，可知對(duì)照指紋圖譜共出現(xiàn)17個(gè)特征峰，以黃芩苷作為參照峰(S峰)計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間，并按照規(guī)定其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)確定，分別歸屬到金銀花、黃芩、連翹、玄參、梔子、龍膽6味藥材，其中能夠指認(rèn)到不同藥材17個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間規(guī)定值分別為0.41(峰1)、0.44(峰2)、0.48(峰3)、0.68(峰4)、0.72(峰5)、0.76(峰6)、0.81(峰7)、0.84(峰8)、0.90(峰9)、1.00(峰S)、1.03(峰10)、1.08(峰11)、1.10(峰12)、1.13(峰13)、1.18(峰14)、1.34(峰15)、1.63(峰16)。

綜上，建立的清熱解毒片對(duì)照特征圖譜及其各峰歸屬的指認(rèn)如下(見(jiàn)圖1、表6)：

圖1 清熱解毒片對(duì)照特征圖譜

序號(hào)相對(duì)保留時(shí)間色譜峰指認(rèn)歸屬序號(hào)相對(duì)保留時(shí)間色譜峰指認(rèn)歸屬10．41綠原酸金銀花90．94，5-二咖啡?；鼘幩峤疸y花20．44隱綠原酸金銀花101黃芩苷黃芩30．48梔子苷、龍膽苦苷梔子、龍膽111．03連翹苷連翹121．08未知黃芩、甜地丁40．68未知連翹、黃芩131．1哈巴俄苷玄參50．72未知金銀花、黃芩141．13未知連翹、黃芩60．76未知金銀花、黃芩151．18漢黃芩苷黃芩161．34黃芩素黃芩70．813，4-二咖啡?；鼘幩?，5-二咖啡酰基奎寧酸金銀花171．63漢黃芩素黃芩80．84金銀花

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品(某藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1509004)溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0～0.86%，相對(duì)峰面積的RSD為0～3.36%，表明儀器系統(tǒng)精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品(某藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1509004)溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、4、8、12、16和24 h進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間(RRT)的RSD均小于3%，相對(duì)峰面積(RPA)的RSD均小于4%。表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜要求。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品(某藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1509004)溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定指紋圖譜，結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于 1%，相對(duì)峰面積RSD均小于4%。表明供試品溶液重現(xiàn)性良好，符合指紋圖譜要求。

2.4.4 耐用性試驗(yàn) 采用Agilent1260高效液相色譜儀，島津LC-20AT高效液相色譜儀；不同色譜柱：a)Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm，4.6 mm×250 mm)；b)自裝柱富士填料 C18(5μm，4.6 mm×250 mm)；c)迪馬Inertsil C8-3(5μm，4.6 mm×250 mm)；自裝柱富士C18(5μm,4.6 mm×250 mm)，均能達(dá)到良好的分離效果。

3 討論

從清熱解毒片與對(duì)照藥材的色譜圖及對(duì)照品的色譜圖比較可得：11味藥材中有六味藥材共出現(xiàn)了17個(gè)特征峰，分別為金銀花、梔子、知母、黃芩、連翹、玄參，其中金銀花、黃芩有幾類(lèi)群峰。

指紋或特征圖譜技術(shù)在中藥復(fù)方研發(fā)工藝、運(yùn)輸管理及中藥質(zhì)量的控制等方面的研究中起著關(guān)鍵性作用，該技術(shù)具有簡(jiǎn)便，高效，可靠，并且具有系統(tǒng)性、整體性、特征性和穩(wěn)定性等特征，越來(lái)越廣泛應(yīng)用。

[1] 張偉毅.中藥特征圖譜技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用[J].北方藥學(xué),2016(10)：155-156.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].2015版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3] 林遠(yuǎn)鳳，黃燕萍.HPLC法同時(shí)測(cè)定清熱解毒膠囊中6種成分的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015,21(17):67-70．

[4] 張玉杰,李明春,張 華,等.正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化鼻淵凈膠囊超臨界CO2萃取工藝條件研究[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2016(6):459-463.

[5] 楊 波,紀(jì)宏宇,吳琳華,等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選延胡索中延胡索乙素提取工藝[J].中國(guó)藥師，2017,20(2)：273-276.

本文編輯：王知平

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1671-0126(2017)05-0001-04

連云嵐，女，副主任藥師，從事中藥分析檢驗(yàn)工作