kshv-mir-k12-1-5p相關(guān)基因在卡波西肉瘤中的表達(dá)

張 靜,吳秀娟,普雄明*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院病理科,烏魯木齊 830000;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科;*通訊作者,E-mail:puxiongming@126.com)

kshv-mir-k12-1-5p相關(guān)基因在卡波西肉瘤中的表達(dá)

張 靜1,吳秀娟2,普雄明2*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院病理科,烏魯木齊 830000;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科;*通訊作者,E-mail:puxiongming@126.com)

目的 探索kshv-mir-k12-1-5p相關(guān)基因在卡波西肉瘤(KS)組織中的表達(dá)意義。 方法 通過(guò)在線miRNA靶基因軟件Mirbase、Miranda和Targetscan尋找kshv-mir-k12-1-5p的靶基因。通過(guò)GO和KEGG分析靶基因的信號(hào)通路及通路上的關(guān)鍵基因。使用免疫組化的方法檢測(cè)靶基因、關(guān)鍵基因(kshv-mir-k12-1-5p相關(guān)基因)在卡波西肉瘤組織的表達(dá)。 結(jié)果 kshv-mir-k12-1-5p的靶基因?yàn)镃DKN1A,CDKN1A信號(hào)通路為Cell cycle通路,通路下游關(guān)鍵基因?yàn)镃yclinD1、CyclinE。CDKN1A、CyclinD1、Cyclin E在腫瘤組織與瘤旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CDKN1A在卡波西肉瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率低于瘤旁組織(P<0.05),CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率高于瘤旁組織(P<0.05);在KS中CyclinD1與年齡相關(guān)(P<0.05),CyclinE與民族相關(guān)(P<0.05);在KS中CDKN1A與CyclinD1、CyclinE均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。CyclinD1與CyclinE呈正相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論 kshv-mir-k12-1-5p的相關(guān)基因:CDKN1A、CyclinD1、CyclinE表達(dá)異常在KS發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。

卡波西肉瘤; kshv-mir-k12-1-5p; CDKN1A; CyclinD1; CyclinE

卡波西肉瘤(Kaposis sarcoma, KS)是血管瘤樣結(jié)構(gòu)、梭形細(xì)胞增生的惡性腫瘤[1],臨床有4種分型:經(jīng)典型、非洲型、艾滋病病毒(AIDS)相關(guān)型及免疫抑制型。其中經(jīng)典型及艾滋病病毒相關(guān)型在我國(guó)新疆地區(qū)報(bào)告較多,主要見(jiàn)于維吾爾族、哈薩克族等少數(shù)民族?？úㄎ魅饬鱿嚓P(guān)病毒(KSHV)是KS發(fā)生的必需因素和主要因素。KSHV通過(guò)編碼的miRNA調(diào)控宿主的生存環(huán)境、宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期和沉默靶基因等諸多途徑影響感染細(xì)胞的分化狀態(tài),進(jìn)而影響宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期,從而促進(jìn)KSHV誘導(dǎo)KS發(fā)生。在既往的研究中,通過(guò)對(duì)KS miRNA差異表達(dá)譜的篩選和驗(yàn)證得出在KS中kshv-mir-k12-1-5p表達(dá)明顯上調(diào)[2]。本文從病因上研究與kshv-mir-k12-1-5p相關(guān)基因在KS的表達(dá),為研究kshv-mir-k12-1-5p對(duì)KS的調(diào)控作用做基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例來(lái)源

收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院及烏魯木齊市友誼醫(yī)院病理科卡波西肉瘤患者腫瘤和瘤旁組織40對(duì)石蠟組織,使用免疫組化方法對(duì)石蠟組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 主要試劑

試劑來(lái)源:購(gòu)自福州邁新有限公司免疫組化一抗:CDKN1A(細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶抑制劑1A)、CyclinD1(細(xì)胞周期蛋白D1)、CyclinE(細(xì)胞周期蛋白E)。

1.3 確定靶基因

通過(guò)在線miRNA靶基因軟件Mirbase,Miranda和Targetscan確定kshv-mir-k12-1-5p靶基因。Mirbase、Miranda、Targetscan網(wǎng)址如下:Mirbase: http://www.mirbase.org/,Miranda: http://www.microrna.org/microrna/home.do/,Targetscan: http://www.targetscan.org/vert-60/。

1.4 分析信號(hào)通路及關(guān)鍵基因

通過(guò) GO 和 KEGG 分析靶基因的通路及通路上的關(guān)鍵基因。GO:http://www.geneontology.org,KEGG:http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html。

1.5 免疫組化檢測(cè)

使用免疫組化方法檢測(cè)石蠟組織中kshv-mir-k12-1-5p的相關(guān)基因:靶基因(CDKN1A)、信號(hào)通路關(guān)鍵基因(CyclinD1、CyclinE)的表達(dá)情況并分析其與臨床參數(shù)的關(guān)系。

1.6 結(jié)果判斷

每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(40×10倍),每個(gè)視野500-1 000 個(gè)細(xì)胞。從以下兩方面對(duì)切片進(jìn)行計(jì)分: ① 染色強(qiáng)度: 0 分為無(wú)著色,1 分為淡黃色,2 分為棕黃色,3 分為棕褐色; ② 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù): 1 分為1%-10%,2 分為 11%-50%,3 分為 51%-75%,4 分為≥76%。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘得出最終結(jié)果，陰性(-): < 3 分,陽(yáng)性(+):≥3 分。CDKN1A、CyclinD1為腫瘤梭形細(xì)胞核陽(yáng)性著色。CyclinE為腫瘤梭形細(xì)胞核/細(xì)胞漿陽(yáng)性著色。高年資病理醫(yī)師進(jìn)行結(jié)果判定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料的差異性及相關(guān)性采用卡方檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 kshv-mir-k12-1-5p的靶基因

通過(guò)靶基因軟件確定CDKN1A基因?yàn)閗shv-mir-k12-1-5p的靶基因。

2.2 kshv-mir-k12-1-5p的信號(hào)通路及通路上關(guān)鍵基因

通過(guò)GO和KEGG分析得出kshv-mir-k12-1-5p及靶基因CDKN1A參與Cell cycle信號(hào)通路,CyclinD1、CyclinE為通路下游的關(guān)鍵基因。

2.3 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤與瘤旁組織中的表達(dá)

卡波西肉瘤與瘤旁組織中CDKN1A、CyclinD1、CyclinE的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。CDKN1A在卡波西肉瘤的陽(yáng)性表達(dá)率(30.0%)明顯低于瘤旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(75.0%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CyclinD1在卡波西肉瘤的陽(yáng)性表達(dá)率(80.0%)明顯高于瘤旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(40.0%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CyclinE在卡波西肉瘤的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于瘤旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(82.5%vs37.5%，P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤及瘤旁組織中的表達(dá)

Table1ExpressionofCDKN1A，CyclinD1，CyclinEinKSandadjacenttissue

類型nCDKN1ACyclinD1CyclinE+χ2P+χ2P+χ2P腫瘤4012(30.0)16.240.0032(80.0)13.330.0033(82.5)16.880.00瘤旁4030(75.0)16(40.0)15(37.5)

2.4 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE與卡波西肉瘤臨床參數(shù)的關(guān)系分析

分析CDKN1A、CyclinD1、CyclinE與患者性別、發(fā)病年齡、民族、臨床類型的關(guān)系。CyclinD1與年齡有關(guān)(P<0.05),CyclinE與民族有關(guān)(P<0.05,見(jiàn)表2)。

A. CyclinD1在腫瘤細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá);B. CDKN1A在腫瘤細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá);C. CyclinE在腫瘤細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá); D. CyclinD1在瘤旁組織陰性表達(dá);E. CDKN1A在瘤旁組織細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá);F. CyclinE在瘤旁組織陰性表達(dá)圖1 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中免疫組化染色 (40×10)Figure 1 Expression of CDKN1A,CyclinD1,CyclinE in KS by immunohistochemistry (40×10)

表2CDKN1A、CyclinD1、CyclinE同卡波西肉瘤臨床參數(shù)的關(guān)系

Table2TherelationshipsofCDKN1A,CyclinD1,CyclinEwiththeclinicalfeaturesofKS

因素nCDKN1ACyclinD1CyclinE+-χ2P+-χ2P+-χ2P 性別1.090.300.001.000.620.43 男35926287305 女5324132 年齡0.050.835.010.030.020.965 >4526719242224 ≤45145986113 民族0.001.000.360.554.180.04 維族351025296314 其他5233223 臨床類型0.001.001.230.271.230.27 CKS4133122 AIDS-KS361125297315

2.5 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中的相關(guān)性分析

在KS中CDKN1A與CyclinD1、CyclinE均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,見(jiàn)表3)。CyclinD1與CyclinE呈正相關(guān)(P<0.05,見(jiàn)表4)。

表3卡波西肉瘤中CDKN1A與CyclinD1、CyclinE的相關(guān)性

Table3ThecorrelationwithCDKN1AandCyclinD1,CyclinEinKS

CDKN1ACyclinD1CyclinE+-χ2P+-χ2P陽(yáng)性667.150.007754.750.029陰性262262

表4卡波西肉瘤中CyclinD1與CyclinE的相關(guān)性

Table4ThecorrelationwithCyclinD1andCyclinEinKS

CyclinECyclinD1+-χ2P陽(yáng)性2934.770.029陰性44

3 討論

卡波西肉瘤相關(guān)病毒(KSHV,即人皰疹病毒8型)[2]首先從AIDS相關(guān)型KS患者的肉瘤組織中發(fā)現(xiàn)。隨后,在各型的KS中均發(fā)現(xiàn)了KSHV的高表達(dá)。KSHV與KS的發(fā)生關(guān)系密切。KSHV致瘤過(guò)程主要發(fā)生在病毒感染的潛伏期[3]。

本文通過(guò)在線miRNA靶基因軟件確定kshv-mir-k12-1-5p的靶基因CDKN1A。通過(guò)GO和KEGG分析kshv-mir-k12-1-5p和靶基因的信號(hào)通路為Cell cycle信號(hào)通路及通路下游的關(guān)鍵基因CyclinD1、CyclinE。因此，CDKN1A、CyclinD1、CyclinE為kshv-mir-k12-1-5p的相關(guān)基因,共同參與細(xì)胞周期的調(diào)控。

細(xì)胞周期異常調(diào)控導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖,是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)。細(xì)胞周期(cell cycle)信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因CDKN1A、CyclinD1、CyclinE的異常表達(dá)和卡波西肉瘤的發(fā)生密不可分。CyclinE和CyclinDl是細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的正性重要調(diào)控因子。表達(dá)上調(diào)使G1/S轉(zhuǎn)換時(shí)間變短,促進(jìn)了細(xì)胞周期進(jìn)程,細(xì)胞增殖過(guò)度,最終細(xì)胞癌變。本實(shí)驗(yàn)中CyclinD1、CyclinE在KS中高表達(dá)?？úㄎ魅饬鼋M明顯高于對(duì)照組。CDKN1的生物學(xué)功能是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA復(fù)制;調(diào)控發(fā)育、分化等過(guò)程,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中CDKN1A陽(yáng)性表達(dá)率在卡波西肉瘤組明顯低于對(duì)照組。因?yàn)镃DKN1A是一種罕見(jiàn)突變的抑癌基因,它在KS發(fā)展過(guò)程中,逐漸失去對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用,其蛋白水平降低參與KS的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)在KS中CyclinD1與年齡相關(guān)(P<0.05);CyclinE與民族相關(guān)(P<0.05);CDKN1A與CyclinD1、CyclinE均呈負(fù)相關(guān);CyclinD1與CyclinE呈正相關(guān)。正常情況下CDKN1A的表達(dá)對(duì)停滯增長(zhǎng)起重要作用。CDKN1A表達(dá)上調(diào)可抑制CDK的活性,抑制CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物及CyclinE-CDK2復(fù)合物活性,使蛋白表達(dá)下調(diào);表達(dá)受抑。細(xì)胞不能進(jìn)入S期,導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。研究證實(shí)CyclinD1、CyclinE在多種腫瘤中出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)[10]。兩者具有協(xié)同作用,和本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相似。因?yàn)樵谀[瘤的進(jìn)展中,CDKN1A表達(dá)下調(diào),對(duì)CyclinD1、CyclinE的抑制減弱,導(dǎo)致CyclinD1、CyclinE表達(dá)失控。

本研究為kshv-mir-k12-1-5p通過(guò)信號(hào)通路調(diào)控靶基因及關(guān)鍵基因的研究做基礎(chǔ),接下來(lái)將構(gòu)建kshv-mir-k12-1-5pmimic、kshv-mir-k12-1-5p inhibitor等,轉(zhuǎn)染到卡波西肉瘤細(xì)胞株中,研究過(guò)表達(dá)或低表達(dá)kshv-mir-k12-1-5p后,采用qRT-PCR及WB檢測(cè)信號(hào)通路靶基因、關(guān)鍵基因(CDKN1A、CyclinD1、CyclinE)的mRNA和蛋白表達(dá)情況,明確kshv-mir-k12-1-5p對(duì)信號(hào)通路主要的調(diào)控作用，確定kshv-mir-k12-1-5p能否作為一個(gè)藥物靶標(biāo)。因此，先行檢測(cè)在未調(diào)控下CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在KS中的表達(dá),了解其表達(dá)的意義。

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Expressionofkshv-mir-k12-1-5p-relatedgeneinKaposi’ssarcoma

ZHANG Jing1，WU Xiujuan2，PU Xiongming2*

(1DepartmentofPathology,AffiliatedTraditionalChineseMedicineHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China;2DepartmentofDermatology,People’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion;*Correspondingauthor,E-mail:puxiongming@126.com)

ObjectiveTo explore the expression of kshv-mir-k12-1-5p-related gene in Kaposi’s sarcoma (KS) and its significance.MethodsThe kshv-mir-k12-1-5p target gene was detected through Mirbase, Miranda and Targetscan of the online miRNA target gene software. GO and KEGG were used to analyze signaling pathway and key gene in the pathway of the target gene. The expression of target gene and key gene(kshv-mir-k12-1-5p-related gene) was detected in Kaposi’s sarcoma by immunohistochemistry.ResultsThe target gene of kshv-mir-k12-1-5p was CDKN1A, CDKN1A signaling pathway was the cell cycle pathway, and the downstream key genes were CyclinD1 and CyclinE. Positive expression rate of CDKN1A in KS was lower in tumor tissues than that of adjacent tissues(P<0.05). Positive expression rates of CyclinD1,CyclinE in KS were higher in tumor tissues than that of adjacent tissues(P<0.05).Expression of CyclinD1 in KS was associated with age(P<0.05). Expression of CyclinE in KS was associated with nation(P<0.05). There was a negative correlation between the expression of CDKN1A and CyclinD1,CyclinE in KS(P<0.05).There was a positive correlation between the expression of CyclinD1 and CyclinE in KS(P<0.05).ConclusionThe expression of kshv-mir-k12-1-5p-related genes CDKN1A, CyclinD1, and CyclinE may play an important role in the occurrence and development of KS.

Kaposis sarcoma； kshv-mir-k12-1-5p; CDKN1A; CyclinD1; CyclinE

R739.5

A

1007-6611(2017)10-1044-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.014

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81660454);新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院院級(jí)課題(ZYY201702)

張靜,女,1979-12生,在讀博士,主治醫(yī)師

2017-07-10