原發(fā)性干燥綜合征患者外周血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達及臨床意義

鄭 戈，袁一夢

原發(fā)性干燥綜合征患者外周血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達及臨床意義

鄭 戈，袁一夢

目的研究原發(fā)性干燥綜合征(primary sjogren's syndrome, PSS)患者外周血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達水平及臨床意義。方法選擇本院2012年3月—2015年3月收治的50例PSS患者(觀察組)，再根據(jù)疾病活動情況及病情程度分為活動期亞組(30例)、非活動期亞組(20例)和單系統(tǒng)亞組(29例)、多系統(tǒng)亞組(21例)。選擇同期我院行體檢健康者50例作為對照組。兩組均行免疫熒光標記、流式細胞術檢測外周靜脈血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達情況；比較所有納入研究者間OX40、OX40L、PD-1、PD-L1及SPD-1的表達情況，并記錄觀察組患者治療前后上述指標的表達情況。結果觀察組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+和CD4+PD-1+及SPD-1表達均高于對照組，CD14+PD-L1+表達低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。對觀察組亞組進行分析，活動期亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+及SPD-1表達顯著高于非活動期亞組(P<0.05或P<0.01)；單系統(tǒng)亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+及SPD-1表達明顯低于多系統(tǒng)亞組(P<0.05或P<0.01)。治療前觀察組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+和CD4+PD-1+表達顯著高于治療后(P<0.05)；CD8+PD-1+、CD14+PD-L1+及SPD-1表達治療前后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論PSS患者外周靜脈血中OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的異常表達，和疾病活動情況、組織損害情況有關聯(lián)，可作為了解病情活動度和嚴重程度的檢測指標。

干燥綜合征；病情評估；OX40；OX40L；PD-1；PD-L1

原發(fā)性干燥綜合征(primary sjogren's syndrome, PSS)是一種自身免疫性疾病，主要以外分泌腺體(淚腺、唾液腺)損傷為特征，眼淚和唾液分泌減少，導致患者出現(xiàn)眼干和口干，同時會累及肺臟、腎臟和神經系統(tǒng)[1-3]。T細胞、B細胞不正常激活和PSS的發(fā)生密切相關，共刺激信號在T細胞活化過程中起著直接作用。OX40、OX40配體(OX40L)是腫瘤壞死因子超家族成員，OX40表達于CD4+T細胞表層，OX40L表達于激活的B淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞，能使T細胞增加和提供刺激信號，阻止T細胞的生成；還可使Th2細胞生成細胞因子，B細胞成熟增殖分化為漿細胞，從而導致抗體生成[4-7]。程序性死亡受體1(PD-1)和程序性死亡受體-配體1(PD-L1)是人體重要的免疫抑制分子，是CD28家族的共刺激分子，主要表達于活化T細胞的表層；PD-1在CD28家族成員中表達較多，PD-L1大部分激發(fā)于抗原提呈細胞表層，主要以B細胞和單核細胞構成，能傳遞抑制信號，降低T細胞的增長[8]。研究表明，PD-1、PD-L1共刺激信號在人體許多免疫性疾病的發(fā)展過程中起著重要的作用[9]。研究表明，可溶程序性死亡受體1(SPD-1)具有完全的細胞外端，能夠和PD-1相結合，在臨床上被認為是PD-1和程序性死亡受體-配體的阻止劑[10-11]。本研究探討PSS患者外周血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達水平和臨床意義，以期為PSS患者病情評估尋找有意義的檢測指標。

1 資料與方法

1.1納入對象及分組 選擇本院2012年3月—2015年3月收治的50例PSS作為觀察組，均符合2002年國際衛(wèi)生組織頒布的PSS診斷標準[12]，其中男2例(4.0%)，女48例(96.0%)；年齡35～65(47.51±11.51)歲。其中10例為本次入院初診者。同時選取我院體檢健康且自愿參與本研究的志愿者50例為對照組，其中男3例(6.0%)，女47例(94.0%)；年齡34～67(47.61±12.21)歲。兩組在性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

進一步將觀察組按照不同病情程度進行亞組分組：①依據(jù)2009年歐洲風濕病聯(lián)盟(EULAR)PSS活動指數(shù)評分標準將觀察組再分為活動期亞組30例和非活動期亞組20例，該評分共9個類目(全身病癥、關節(jié)病癥、淋巴結、腺體、關節(jié)、腎臟病變、肺部、外周神經病變和骨骼肌情況)12個方面，每方面分為4個檔次(不存在活動、輕微活動、中度活動和高度活動)，測評分值≥2分為活動期，<2分為非活動期。②根據(jù)器官累及情況[13]將觀察組再分為單純累及外分泌腺體亞組(單系統(tǒng)亞組)29例和多系統(tǒng)累及外分泌腺體亞組(多系統(tǒng)亞組)21例。

1.2研究方法

1.2.1OX40、OX40L、PD-1和PD-L1檢測：采集研究對象清晨空腹靜脈血3 ml，應用CD004-1流式細胞儀，采用EDTA-K2鉀鹽抗凝法檢測OX40、OX40L、PD-1和PD-L1的表達。試劑盒購自上海銳賽生物有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2SPD-1檢測：采集研究對象清晨空腹靜脈血5 ml，1500～1800 r/min離心5 min，取上清，于-40℃的冰箱中保存。采用SPD-1 ELISA檢驗試劑盒(購于上海羽朵生物科技有限公司)，嚴格按照試劑盒說明書操作。反應后采用酶標儀檢測400～500 nm位置的吸光度值。

1.3觀測指標 比較兩組及各亞組外周靜脈血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達情況；并比較觀察組患者治療前和治療后2周時各項指標表達情況。

2 結果

2.1兩組觀測指標比較 觀察組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+和CD8+PD-1+及SPD-1表達均高于對照組，CD14+PD-L1+表達明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 原發(fā)性干燥綜合征與健康對照者OX40、OX40L、PD-1、PD-L1及SPD-1表達情況比較

注：觀察組為原發(fā)性干燥綜合征患者組，對照組為體檢健康者組

2.2PSS活動期與非活動期患者觀測指標比較 PSS活動期亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+及SPD-1表達顯著高于非活動期亞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 原發(fā)性干燥綜合征活動期和非活動期患者OX40、OX40L、PD-1、PD-L1及SPD-1表達比較

2.3PSS不同系統(tǒng)累及患者觀測指標比較 PSS單系統(tǒng)亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+及SPD-1表達明顯低于多系統(tǒng)亞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 原發(fā)性干燥綜合征不同系統(tǒng)累及者OX40、OX40L、PD-1、PD-L1及SPD-1表達比較

2.4PSS患者治療前后觀測指標比較 觀察組患者治療前CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+和CD4+PD-1+表達顯著高于治療后，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CD8+PD-1+、CD14+PD-L1+及SPD-1表達治療前后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 原發(fā)性干燥綜合征患者治療前后OX40、OX40L、PD-1、PD-L1及SPD-1表達水平比較

3 討論

PSS患者血清中出現(xiàn)抗體和異常γ-球蛋白血癥的具體病理機制還未研究清楚，但相關研究認為與CD4+T細胞和B細胞不正常激活有密切的聯(lián)系[14-16]。共刺激信號在T細胞的激發(fā)進程中發(fā)揮著重要的作用，負刺激信號強度的升高能阻止人體發(fā)生反應變化的T細胞激發(fā)和增長，阻止免疫性疾病的發(fā)生[17]。OX40、OX40L超家族屬正共刺激分子，相關文獻已經證明其能夠促進T細胞的移動、增長、繁殖和分解，同時能記錄T細胞的形成，阻止T細胞死亡，并且T細胞能夠幫助B細胞的生長成熟和自身抗體的形成[18-19]。OX40和OX40L水平的明顯升高和類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthrtis， RA)、過敏性哮喘等自身免疫性疾病的存在和發(fā)展有著緊密的聯(lián)系[19-20]。近年來相關研究表明，給膠原誘導關節(jié)炎模型小鼠注射OX40單克隆抗體時，能夠阻止γ干擾素(IFN-γ)和IgG的分泌，甚至能對T細胞進行極化，對CIA小鼠模型的RA癥狀有緩解作用，提示OX40、OX40L和自身免疫性疾病有著緊密的聯(lián)系[21]。

PD-1和PD-L1是一組負共刺激分子，PD-1主要表達于激發(fā)的抗原提呈細胞(APC)表面，能夠阻止T細胞激發(fā)白細胞介素-2(IL-2)和IFN-γ的分泌，并且能引導T細胞的死亡[22]。PD-1和PD-L1信號出現(xiàn)異常時，和人體發(fā)生系統(tǒng)性紅斑狼瘡、RA、胰島素依賴型糖尿病等自身免疫性疾病有著緊密的聯(lián)系[23]。在PSS患者的唾液腺體標本中發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞中存在高表達的PD-1分子，其導管與腺泡肌上皮細胞中PD-L1高表達，并經免疫組織化學染色證實，50%以上的患者唾液腺淋巴細胞中PD-1為高表達，60%以上的患者導管與腺泡肌上皮細胞中PD-L1存在高表達，進一步提示PD-1和PD-L1的信號異常與PSS的發(fā)生和發(fā)展密切相關[24-27]。

本研究觀察PSS患者的外周靜脈血T細胞、B細胞中的OX40、OX40L、PD-1和PD-L1共刺激分子的表達情況，同時依據(jù)患者的臨床特征、疾病活動情況進行亞組分析。結果顯示：①觀察組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+和CD8+PD-1+及SPD-1表達均高于對照組，CD14+PD-L1+明顯低于對照組，說明PSS患者T細胞中的OX40、PD-1明顯上升，并且血清中的OX40L、PD-L1也顯著上升，提示4種因子和PSS的發(fā)病有著密切的聯(lián)系。②活動期亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+表達顯著高于非活動期亞組，說明上述因子水平的高低與疾病的活動情況密切相關。③單系統(tǒng)亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+表達明顯低于多系統(tǒng)亞組，說明上述因子水平的高低與PSS臟器損害情況密切相關。

本研究表示：觀察組SPD-1表達均高于對照組，非活動期亞組患者SPD-1表達較活動期亞組患者明顯降低，單系統(tǒng)亞組患者SPD-1表達明顯低于多系統(tǒng)亞組患者，可推測PSS患者分泌的SPD-1和多余的PD-L1相組合，阻止了T細胞表層的PD-1和PD-L結合，從而使激發(fā)的T細胞“躲過”了PD-1和PD-L的控制信號，使T細胞一直激發(fā)和增長，人體免疫應答持續(xù)，從而加重了PSS的免疫病理損傷。針對PSS的治療能使T細胞PD-1表達下降，使患者病情得到緩解，但SPD-1和治療效果無相關性[28-29]。本研究PSS患者治療后CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+和CD4+PD-1+表達顯著低于治療前，說明治療后能夠減少患者自身反應，阻止了T細胞的激發(fā)和B細胞的分裂，自身抗體分泌情況減少，臨床癥狀緩解。

綜上，PSS患者外周靜脈血單核細胞和淋巴細胞中OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的異常表達，和疾病活動情況、組織損害情況有關聯(lián)，提示可將OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1作為PSS的臨床免疫指標，但其病理機制還需進一步深入研究。

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ExpressionsandClinicalSignificancesofOX40,OX40L,PD-1,PD-L1andSPD-1inPeripheralBloodofPatientswithPrimarySjogren'sSyndrome

ZHENG Ge， YUAN Yi-meng

(Department of Blood Rheumatology, the First People's Hospital of Zigong City, Zigong, Sichuan 643000, China)

ObjectiveTo investigate expressions and clinical significances of OX40, OX40L, PD-1, PD-L1 and SPD-1 in peripheral blood of patients with primary Sjogren's syndrome (PSS).MethodsA total of 50 patients with PSS (observation group) admitted during March 2012 and March 2015 were divided into active period subgroup (n=30) and inactivity period subgroup (n=20) according to disease activity conditions, and single system subgroup (n=29) and multisystemic subgroup (n=21) according to active stages. Other 50 healthy people taking medical examinations at the same period were selected as control group. OX40, OX40L, PD-1, PD-L1 and SPD-1 expressions in peripheral venous blood were detected by immunofluorescence labeling and flow cytometry methods in two groups. OX40, OX40L, PD-1, PD-L1 and SPD-1 expressions were compared in groups and subgroups, and changes of the above indexes before and after treatment were recorded in observation group.ResultsIn observation group, CD4+OX40+, CD14+OX40L+, CD19+OX40L+, CD4+PD-1+and CD4+PD-1L+and SPD-1 expressions were significantly higher, while CD14+PD-L1+was significantly lower than those in control group (P<0.01). CD4+OX40+, CD14+OX40L+, CD19+OX40L+, CD4+PD-1+and SPD-1 expressions in active period subgroup were significantly higher than those in inactivity period subgroup (P<0.05 orP<0.01); CD4+OX40+, CD14+OX40L+, CD19+OX40L+and SPD-1 expressions in single system subgroup were significantly lower than those in multisystemic subgroup (P<0.05 orP<0.01). In 10 preliminary diagnosis patients in observation group, CD4+OX40+, CD14+OX40L+, CD19+OX40L+and CD4+PD-1+expressions before treatment were significantly higher than those after treatment (P<0.05); there were no significant differences in CD8+PD-1+, CD14+PD-L1+and SPD-1 expression between before and after treatment (P>0.05).ConclusionAbnormal expressions of OX40, OX40L, PD-1, PD-L1 and SPD-1 in peripheral venous blood of PSS patients relate to disease activity and tissue damage, and the expressions can be used as detection indexes for learning disease activity conditions and severe degree.

Sjogren's syndrome; Pathogenetic condition； OX40； OX40L； PD-1； PD-L1

四川省衛(wèi)生廳科研課題資助(120003)

643000 四川 自貢，自貢市第一人民醫(yī)院血液風濕科

R593.22

A

1002-3429(2017)10-0083-05

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.10.028

2017-01-12 修回時間：2017-05-14)