同型半胱氨酸對實驗性結(jié)腸炎模型中COX-2及5-LOX表達的影響

王 晶，丁少楨，胡 翠，胡 靜，劉曉昌，梅 俏，許建明

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥 230022)

◇研究簡報◇

同型半胱氨酸對實驗性結(jié)腸炎模型中COX-2及5-LOX表達的影響

王 晶，丁少楨，胡 翠，胡 靜，劉曉昌，梅 俏，許建明

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥 230022)

梅 俏(1971-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：炎癥性腸病，通訊作者，E-mail：meiqiao@hotmail.com

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一種含巰基氨基酸，是甲硫氨酸去甲基化過程中的產(chǎn)物，可通過多種途徑促發(fā)炎癥反應(yīng)，啟動由細胞免疫所介導的局部和全身慢性炎癥。研究發(fā)現(xiàn)[1]，Hcy可激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，導致多種炎癥基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥的發(fā)生。炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，發(fā)病機制目前尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者腸黏膜中，經(jīng)由5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)代謝合成白三烯(leukotrienes，LTs)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)代謝合成前列腺素(prostaglandins，PGs)的量升高。腸黏膜發(fā)生炎癥時，由COX-2合成的PGE2引發(fā)血管擴張、黏膜充血水腫及滲透性增加。5-LOX可以調(diào)節(jié)炎癥細胞的遷移浸潤，促進炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，增加腸黏膜通透性[2]。在對關(guān)節(jié)炎大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，抗關(guān)節(jié)炎藥物通過抑制NF-κB信號通路，下調(diào)5-LOX和COX-2基因表達，導致LTB4和PGE2合成減少，減輕關(guān)節(jié)炎癥[3]，提示5-LOX和COX-2受到NF-κB的調(diào)控。另外，我們發(fā)現(xiàn)IBD患者結(jié)腸黏膜中Hcy濃度明顯升高[4]，且Hcy會進一步加重結(jié)腸炎癥的病理損傷，但Hcy對IBD腸黏膜炎癥損傷的具體機制尚不明確。因此，本研究擬建立高Hcy特征的實驗性結(jié)腸炎大鼠模型，探討Hcy是否通過促進NF-κB的表達，調(diào)控5-LOX、COX-2合成LTs和PGE2水平增加，加重結(jié)腸炎癥。

1 材料

1.1實驗動物與試劑SD大鼠，SPF級，♂，體質(zhì)量(200±20)g，實驗動物許可證號：34000200000480，由安徽省實驗動物中心提供。三硝基苯磺酸(TNBS)、DL-Hcy均購于美國Sigma公司；LTs及PGE2試劑盒購于武漢新啟迪生物科技公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組 大鼠分為4組，每組8只，在室溫、光周期12 h ∶12 h條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用。A組(正常對照組)：生理鹽水灌腸+生理鹽水皮下注射；B組(TNBS模型組)：TNBS/乙醇溶液灌腸+生理鹽水皮下注射；C組(正常對照+Hcy注射組)：生理鹽水灌腸+Hcy皮下注射；D組(TNBS模型+Hcy注射組)：TNBS/乙醇溶液灌腸+Hcy皮下注射。

1.2.2高Hcy血癥模型的制備和給藥方法 參照文獻[5]，采用10%水合氯醛進行腹腔注射，經(jīng)肛門將橡膠管插入大鼠結(jié)腸內(nèi)，長度約8 cm，注入(1 ∶1)乙醇溶解的TNBS(100 mg·kg-1)溶液。對照組灌腸等體積生理鹽水。DL-Hcy溶解于生理鹽水，滴定pH至7.4，參照文獻劑量[6]，自TNBS模型制備后d 1起，皮下注射Hcy(0.03 μmol·kg-1)，每天2次，間隔8 h，連續(xù)30 d。對照組皮下注射等體積生理鹽水。

1.2.3標本采集 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，切取遠端結(jié)腸8 cm左右，沿縱軸剪開腸管，冰生理鹽水沖洗干凈后，取部分結(jié)腸進行檢測。

1.2.4ELISA法檢測大鼠結(jié)腸勻漿LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)及PGE2水平 取病變結(jié)腸組織，制備成勻漿，采用ELISA雙抗夾心法檢測其中LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)、PGE2的水平。

1.2.5RT-qPCR法檢測結(jié)腸黏膜組織5-LOX、COX-2及NF-κB mRNA表達 提取結(jié)腸黏膜組織mRNA，取出基因組DNA，合成cDNA后，按照試劑盒說明書進行加樣：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s退火，72℃延伸，40個循環(huán)。分析方法：relative quantification study，分析指標為：2-ΔΔCt。5-LOX引物序列：Forward primer: 5′-AGTTGCCTAAGAAGCTCCCA-3′； Reverse primer：5′-GCATCAATGCCATCCAGTAG -3′； 產(chǎn)物長度：133 bp。COX-2引物序列：Forward primer：5′-AATCGCTGTACAAGCAGTGG-3′；Reverse primer：5′-GCAGCCATTTCTTTCTCTCC-3′；產(chǎn)物長度：144 bp。NF-κB 引物序列：Forward primer：5′-GCCTCATCCACATGAACTTG-3′；Reverse primer：5′-CGCTTCTTCACACACTGGAT-3′；產(chǎn)物長度：120 bp。

Tab 1 Effects of Hcy on LTB4，LTC4，LTD4，LTE4 and PGE2 levels in colonic homogenate of experimental colitis rats(±s，n=8)

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsTNBS/ethanol group

2 結(jié)果

2.1Hcy對結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸勻漿中LTs和PGE2水平的影響如Tab 1所示，與正常對照組比較，TNBS模型組及正常對照組+Hcy注射組大鼠結(jié)腸勻漿中LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)及PGE2水平升高(P<0.05)。與TNBS模型組比較，TNBS模型+Hcy注射組大鼠結(jié)腸勻漿中LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)及PGE2水平明顯升高(P<0.05)，提示Hcy引起腸道炎癥介質(zhì)水平的升高。

2.2Hcy對結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜中5-LOX、COX-2及NF-κBmRNA表達的影響如Tab 2所示，與正常對照組相比，TNBS模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織5-LOX、COX-2、NF-κB mRNA的表達增加。與TNBS模型組相比，TNBS模型+Hcy注射組大鼠結(jié)腸黏膜組織5-LOX、COX-2、NF-κB mRNA的表達明顯增加(P<0.05)，提示Hcy可能通過調(diào)控NF-κB信號通路，促進5-LOX、COX-2的表達，加重腸道炎癥的發(fā)生。

Tab 2 Effects of Hcy on mRNA expressionof 5-LOX, COX-2 and NF-κB in colonic mucosaof experimental colitis rats(±s，n=8)

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsTNBS/ethanol

3 討論

本研究通過制備大鼠高Hcy血癥實驗性結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，Hcy注射組和TNBS模型組兩組大鼠結(jié)腸勻漿中的LTs和PGE2的水平均升高，大鼠結(jié)腸黏膜組織5-LOX、COX-2、NF-κB的mRNA表達升高，提示Hcy可能通過對COX-2、5-LOX、NF-κB mRNA表達的調(diào)節(jié)，引起LTs和PGE2的升高，促進腸道炎癥損傷。因此，通過降低IBD患者體內(nèi)Hcy水平，有助于減輕炎癥損傷，但是Hcy調(diào)節(jié)COX-2、5-LOX及NF-κB途徑的具體機制目前尚不明確，有待進一步的研究。

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[4] Ding S Z, Ding H, Mei Q, et al. Effect of homocysteine on the intestinal permeability by regulating ERK-MLCK signal transduction in experimental colitis rats[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(4):498-502.

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EffectsofhomocysteineonexpressionofCOX-2and5-LOXinexperimentalcolitsratmodel

WANG Jing, DING Shao-zhen, HU Cui, HU Jing, LIU Xiao-chang, MEI Qiao, XU Jian-ming

(DeptofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

同型半胱氨酸；炎癥性腸病；環(huán)氧合酶-2；5-脂氧合酶；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；白三烯；前列腺素E2

homocysteine; inflammatory bowel disease；cyclooxygenase-2；5-lipoxygenase；nuclear factor kappa B；leukotrienes；prostaglandin E2

A

1001-1978(2017)11-1627-02

R-332；R322.45；R363-332；R574.62；R977.4；R977.3；R977.6

時間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.058.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.029

2017-06-21，

2017-07-26

國家自然科學基金資助項目(No 81470809)

王 晶(1992-)，女，碩士生，研究方向：炎癥性腸病，E-mial：1653198369@qq.com；