熒光雙向電泳檢測雌雄小鼠肝組織蛋白組學的差異

戎卓娜，李慧玲，董鵬輝，樊婷婷，李 娟，趙 毅，王福金，王愛國，王靖宇

(大連醫(yī)科大學實驗動物中心，大連 116044)

研究報告

熒光雙向電泳檢測雌雄小鼠肝組織蛋白組學的差異

戎卓娜，李慧玲*，董鵬輝，樊婷婷，李 娟，趙 毅，王福金，王愛國，王靖宇*

(大連醫(yī)科大學實驗動物中心，大連 116044)

目的檢測雌雄小鼠肝組織蛋白質(zhì)組表達差異，探討肝病發(fā)生的性別差異機制。方法采用雙向熒光差異凝膠電泳(two dimension difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技術檢測C57BL/6J雌雄小鼠肝組織的蛋白質(zhì)組差異表達譜，分離并鑒定差異表達蛋白，應用Western blot進行驗證，并對差異表達蛋白進行生物信息學分析，包括蛋白功能注釋、分類分析、京都基因與基因組百科全書通路分析。結果經(jīng)雙向熒光差異凝膠電泳-圖像分析得到1767個蛋白點，其中差異倍數(shù)≥1.5(P< 0.05)的蛋白點325個。從中選擇78個差異蛋白點進行MALDI-TOF-MS鑒定，得到48種差異性表達的蛋白質(zhì)。其中，與雌鼠相比，雄鼠肝組織中高表達的蛋白有14種，低表達的蛋白有34種。選取6個差異蛋白點進行Western blot 驗證，證明了2D-DIGE結果的可靠性。GO分析結果顯示，涉及雌雄鼠肝組織中的差異蛋白在細胞組分、分子功能、生物學過程中的分布廣泛。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白涉及6條信號通路。結論C57BL/6J雌雄小鼠肝組織的差異性蛋白表達的檢測結果為研究性別差異性肝病發(fā)生的分子機制提供了基礎生物學信息和有益的線索。

肝；性別差異；蛋白質(zhì)組學；生物信息學；雙向熒光差異凝膠電泳

肝病的雄性傾向性是哺乳動物的顯著特征[1-5]，說明哺乳動物具有相似的性別差異性肝病發(fā)生機制，但其分子機制尚不清楚。近年，蛋白質(zhì)組學技術和生物信息學分析的飛速發(fā)展，為從整體、動態(tài)、定量水平研究疾病發(fā)生發(fā)展的機制提供了關鍵性技術方法和重要信息[6]。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳分析法，首次對C57BL/6J品系雌雄小鼠肝組織進行了差異蛋白質(zhì)組學檢測和相應的生物信息學分析，為以小鼠為動物模型的肝病的性別差異性發(fā)生機制研究提供基礎生物學信息。

1 材料和方法

1.1實驗動物

SPF級C57BL/6J雄性小鼠3只，9月齡，體重24～27 g，雌性小鼠3只，15月齡，體重24～27 g，小鼠的繁育飼養(yǎng)和實驗均在大連醫(yī)科大學實驗動物中心SPF區(qū)進行[SCXK(遼)2013-0003][SYXK(遼)2013-0006]。實驗動物使用與管理委員會(ICUC)批準號：L20130326。

1.2主要試劑與儀器

Cy2，Cy3，和Cy5購自英國GE Healthcare Bio-Sciences公司；二甲基甲酰胺購自美國Aldrich公司；尿素、瓊脂糖、甘油、溴酚藍、CHAPS、SDS、碘乙酰胺、過硫酸銨、TEMED、IPG凝膠(24 cm，pH3～10)購自美國Bio-Rad；蛋白酶抑制劑混合物購自瑞士Roche Applied Science；胰蛋白酶(測序級)購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；GelDocTMEZ成像儀(美國Bio-RAD)；質(zhì)譜儀(AutoFlex，德國Bruker公司)；紫外分光光度計(Nanodrop 2000)、xMark酶標儀等。

1.3實驗方法

1.3.1 組織樣本的采集和蛋白質(zhì)提取

宏觀解剖分別采集C57BL/6J雄性和雌性小鼠的肝組織，剪成約1 cm3大小的組織塊，置于冷凍管中液氮凍存。組織塊液氮研磨，加入1 mL裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，30 mmol/L Tris-Cl pH 8.5，磷酸酶抑制劑)，超聲破碎10 s， 14 000 r/min 離心30 min。用Bradford蛋白濃度測定試劑盒對蛋白濃度進行定量，并用SDS-PAGE確認。

1.3.2 DIGE實驗設計和熒光染料標記

在3只雌性或3只雄性小鼠的肝組織蛋白樣本中各取50 μg進行等量混合，分別獲得雄性(M)和雌性(F)肝組織混合蛋白樣本。雌雄肝組織混合樣本分別以Cy3和Cy5進行熒光標記，兩者再進行等量混合為內(nèi)標，以Cy2進行熒光標記。

1.3.3 雙向電泳

IPG膠條(24 cm，pH 3～10)置于IPGphor水平電泳儀(Bio-Rad)上進行水化和聚焦，取1.3.2中樣本的等量混合液進行2D-DIGE，電泳條件280 kVh(30 min內(nèi)達到250 V，1000 V穩(wěn)定1 h，5 h內(nèi)達到10000 V，10000 V維持到60 kVh)。等電聚焦結束后，IPG膠條先后在十二烷基磺酸鈉平衡液(0.5%DTT)和平衡液II(4.5%碘乙酰胺)中各平衡15 min；將平衡好的IPG膠條轉移至12%的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上端，設置功率，避光條件下進行垂直電泳，直至溴酚藍達膠底線，然后用Typhoon 9410激光共聚焦掃描儀對電泳結果進行成像，各個熒光染料激發(fā)/吸收特異波長設置分別為Cy2(488/520 nm)，Cy3(532/580 nm)和Cy5(633/670 nm)。同時取未標記的蛋白內(nèi)標樣品1 mg進行雙向電泳，具體操作同熒光染色樣本。電泳結束后，先用超敏考馬斯亮藍染色液染色，再掃描成像，用于質(zhì)譜分析。

1.3.4 圖像分析

雙向熒光差異凝膠電泳圖譜用SameSpots軟件分析，觀察蛋白的變化趨勢。同時，將一張分析過的圖像用于切膠圖像(SpotPicking)，與1 mg內(nèi)標樣品的制備膠的染色點進行匹配。選擇倍數(shù)≥1.5(P< 0.05)的斑點為差異蛋白點。

1.3.5 差異蛋白的膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定

采集差異蛋白點，經(jīng)過清洗和脫色，脫水干燥，37℃酶解15 h。收集上清，提取蛋白并凍干。將蛋白樣本復溶，點靶于MALDI金屬盤上，4700 MALDI-TOF-MS串聯(lián)飛行質(zhì)譜儀進行鑒定。

1.3.6 數(shù)據(jù)庫檢索差異蛋白名稱

應用MASCOT軟件對上述質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)在NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫進行檢索。檢索參數(shù)：種類為Mus musculus；酶為胰蛋白酶，允許1個漏切位點；肽質(zhì)量容忍差異為0.2；MS/MS容忍差異為0.3。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法驗證2D-DIGE檢測結果

RIPA裂解液提取C57BL/6J雌雄小鼠肝臟組織的總蛋白(4只/組)，Bradford試劑盒測定樣本蛋白濃度。將30 μg的蛋白樣品在12%的SDS-PAGE上進行分離、轉膜、封閉后，分別用EPHX2、CA3、FBP1、ARHGDIA(Abcam)和SCP2、Albumin(Bioworld)一抗以及HRP標記山羊抗兔(ABclonal)二抗孵育后，用ECL化學發(fā)光試劑盒(Advansta，USA)顯影。實驗重復3次，Bradford染色作為上樣內(nèi)參。

1.4生物信息學分析

用DAVID軟件(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對鑒定的差異蛋白質(zhì)進行Gene Ontology(GO)分析，對差異蛋白進行功能注釋和分類，包括Cellular component(CC)、Molecular function(MF)和Biological Process(BP)分析；以及對差異蛋白進行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)的通路富集分析。

2 結果

2.12D-DIGE圖譜和分析結果

將雌鼠和雄鼠的肝組織蛋白樣本進行熒光標記和電泳后，分別經(jīng)488、532、633 nm波長的激光進行掃描，即獲得內(nèi)標圖譜、雌鼠肝組織蛋白圖譜、雄鼠肝組織蛋白圖譜共3張，然后用SameSpots分析軟件進行分析，并將圖譜疊加(圖1)。雌雄小鼠肝組織蛋白樣本中共檢測到蛋白質(zhì)斑點1767個。

注：A：3個不同熒光標記樣品的疊加圖像；B：Cy2標記的混合蛋白樣本內(nèi)標；C：Cy3標記的雄鼠肝組織蛋白樣本；D：Cy5標記的雌鼠肝組織蛋白樣本。圖1 C57BL/6J雄鼠和雌鼠肝組織蛋白表達的雙向熒光差異凝膠電泳圖譜Note.A: The merged images of different fluorescent labeled samples; B: Cy2 labeled mixed protein samples; C: Cy3 labeled liver tissue protein samples of male mice; D: Cy5 labeled liver tissue protein samples of female mice.Fig.1 Images of gender differentially expressed proteins in C57BL/6J mouse liver tissues detected by two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis

Uniprot編號AccessionNo．相對分子量MW等電點pI蛋白質(zhì)名稱ProteinnamesP07724686477575血清白蛋白(serumalbumin，Alb)P11588207633496主要尿蛋白1(majorurinaryprotein1，MUP?1)P16015293476689碳酸酐酶3(carbonicanhydrase3，Ca3)P24270597576772過氧化氫酶(catalase，Cat)P27773566427588蛋白二硫鍵異構酶A3(proteindisulfide?isomeraseA3，PDIA3)P32020590878716固醇載體蛋白2(sterolcarrierprotein2，SCP2)P34914624746585雙功能環(huán)氧化物水解酶2(bifunctionalepoxidehydrolase2，Ephx2)P63017708272537熱休克蛋白8(heatshockprotein8，Hsp8)Q03265597156922ATP合酶亞基α(ATPsynthasesubunitalpha，ATP5A1)Q63880578215543羧酸酯酶3A羧酸酯酶3A(carboxylesterase3A，Ces3a)Q8C1961645137648氨甲酰磷酸合酶(carbamoyl?phosphatesynthase，CPS1)Q8R0Y6986465564醛脫氫酶家族1成員L1(aldehydedehydrogenasefamily1memberL1，ALDH1L1)Q921I1766737694血清鐵蛋白(serotransferrin，Trf)Q9R0N0422684517半乳糖激酶(galactokinase，Galk1)

表2 雄鼠肝組織低表達差異蛋白的質(zhì)譜鑒定結果

2.2雌雄小鼠肝臟組織中差異表達蛋白的篩選和鑒定

采用SameSpots軟件對差異蛋白點進行分析和篩選。篩選條件：蛋白質(zhì)差異在1.5倍以上(P< 0.05)。比較后共分析出325個差異點。其中，與雌鼠相比，雄鼠肝組織中高表達的蛋白點共計155個，低表達的蛋白點共計170個。對篩選出來的差異蛋白點，隨機選取78個點進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定。結果顯示，這些鑒定的所有蛋白點均獲得了較好的質(zhì)譜圖。將肽質(zhì)量指紋圖譜和MS/MS數(shù)據(jù)提交MASCOT進行在線檢索，共成功檢索出48種蛋白。其中，與雌鼠相比，雄鼠肝組織中高表達的蛋白14種(表1)，低表達的蛋白34種(表2)。

2.3鑒定結果的蛋白質(zhì)印跡驗證

在鑒定出的雌雄小鼠肝臟組織差異表達蛋白中選取EPHX2、SCP2、CA3、FBP1、ARHGDIA和Albumin 6個蛋白進行蛋白質(zhì)印跡驗證。結果如圖2所示，與雌性小鼠的肝組織相比，EPHX2、SCP2和CA3在雄性小鼠肝組織中的表達明顯升高，F(xiàn)BP1和ARHGDIA在雄性小鼠肝組織中的表達明顯降低。這些結果與2D-DIGE的鑒定結果一致，說明了2D-DIGE結果的可靠性。但是，Albumin的蛋白表達在雌雄小鼠間未見明顯差異，在2D-DIGE鑒定的78個蛋白點中，有9個點鑒定為Albumin。這表明Albumin在雌雄小鼠間可能存在轉錄剪切或翻譯后修飾的顯著差異。

2.4差異蛋白的GO分析

將所有差異蛋白進行GO分析(表3)，共涉及26條分子功能，其中包含蛋白數(shù)量最多的前10種分子功能為：poly(A)RNA結合、酶結合、脂質(zhì)結合、受體結合、催化活性、解折疊蛋白結合、ATPase活性、鈣粘蛋白結合參與細胞間粘附、泛素蛋白連接酶結合和蛋白復合物結合。共涉及28條細胞組分，其中包含蛋白數(shù)量最多的前十種細胞組分為：胞外體、細胞質(zhì)、細胞核、胞質(zhì)溶膠、線粒體、細胞外空間、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、蛋白復合物、胞外區(qū)和髓鞘。共涉及40條生物學功能，其中包含蛋白數(shù)量最多的前十種生物學功能為：運輸、凋亡過程的負調(diào)控、代謝過程、蛋白質(zhì)折疊、脂代謝過程、氧化還原過程、對藥物的反應、響應活性氧、ATP代謝過程和受體介導的內(nèi)吞作用。以上結果表明，雌雄小鼠肝臟差異蛋白在分子功能、細胞組分和生物學功能中都存在廣泛而顯著的差異。

注：1～8數(shù)字分別代表不同個體的C57BL/6J小鼠。圖2 蛋白質(zhì)印跡法驗證雌雄小鼠肝臟組織差異表達蛋白Note.1～8 numbers indicate the different individuals of C57BL/6J mice.Fig.2 Validation of the differentially expressed proteins between females and males by Western blot assay

表3 雌雄小鼠肝組織差異蛋白GO富集分析結果

表4 雌雄小鼠肝組織差異蛋白的KEGG通路數(shù)據(jù)庫富集分析結果

2.5差異蛋白的KEGG分析

對所有差異蛋白進行KEGG通路分析，共發(fā)現(xiàn)了6個有統(tǒng)計學意義的代謝通路(表4)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、氧化磷酸化、阿爾茨海默病、PPAR信號通路、帕金森病和甲狀腺激素合成。

3 討論

我們的前期研究結果表明，在Ras癌基因誘導的，以C57BL/6J為遺傳背景的肝癌小鼠動物模型中[3]，肝腫瘤的發(fā)生主要集中在雄鼠的中年階段和雌鼠的老年階段，并存在顯著的差異(肝腫瘤發(fā)生率：9月齡雄鼠為100%，15月齡雌鼠為34.62%)。由此，本研究選擇9月齡雄鼠和15月齡雌鼠作為研究對象。通過2D-DIGE分析，與雌鼠相比，雄鼠肝組織中下調(diào)的蛋白34個，上調(diào)蛋白14個，涉及廣泛的細胞生物學功能和代謝通路。

適當?shù)腞OS水平對正常細胞的生理過程具有重要的調(diào)節(jié)作用，但過量的ROS又是參與細胞病變過程的重要因素[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，三種參與ROS代謝的關鍵酶(GPX1，Prdx6，CAT)在雌雄小鼠肝組織中的表達具有顯著的差異。其中，GPX1和Prdx6在雄性C57BL/6J小鼠肝組織內(nèi)的表達較雌性小鼠顯著降低(GPX1下降5.31倍，Prdx6下降2.7倍)。GPX1是線粒體中重要的抗氧化酶，主要負責消除線粒體內(nèi)H2O2的水平，從而抵抗或阻止ROS蓄積所導致的細胞損傷[8]。Prdx6是抗氧化蛋白超家族成員之一，是具有GPX和Ca2+非依賴性磷脂酶A2雙重酶活性的蛋白。體外研究表明，小鼠表皮細胞過表達Prdx6具有抵抗氧化應激損傷的作用[9]。GPX1和Prdx6的顯著降低可能會導致雄性小鼠肝細胞中的ROS水平偏高，肝細胞易受損傷，進而有利于肝病的發(fā)生發(fā)展。另外，KEGG富集分析結果顯示，線粒體中氧化磷酸化通路發(fā)生了顯著變化，其中的相關蛋白在雄性小鼠肝細胞中普遍降低，這可能會進一步提升雄性小鼠肝細胞中的ROS水平。有趣的是，CAT在雄性C57BL/6J小鼠肝組織內(nèi)的表達較雌性小鼠顯著升高(1.6倍)。CAT主要功能是分解H2O2為H2O和O2，與SOD、POD共同組成抗氧化酶系統(tǒng)，降低細胞內(nèi)ROS水平[10]。CAT的顯著升高可能是低水平GPX1和Prdx6的代償性補充，以維持雄性肝細胞的正常ROS水平和生理功能，但具體機制尚需進一步研究。

肝臟是生物體脂質(zhì)代謝的中樞器官，而脂質(zhì)代謝紊亂又是誘發(fā)或影響肝病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[11]。本研究的KEGG通路富集分析數(shù)據(jù)表明，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的PPAR信號通路在雌雄小鼠的肝組織中具有顯著的差異，其中檢測到的差異蛋白為Scp2、ApoA1、FABP1和FABP5，與雌性小鼠相比，Scp2在雄性小鼠中上調(diào)，其他蛋白均下調(diào)。Scp2是膽固醇代謝的重要調(diào)節(jié)因子，不僅參與膽固醇的生物合成和轉化，還是膽固醇的重要轉運蛋白。Liu等研究表明，中草藥當歸可顯著下調(diào)肝組織Scp2的表達進而抑制脂肪肝的發(fā)生[12]。因而，Scp2在雄性小鼠肝組織中的顯著升高可能會導致膽固醇在雄性肝細胞中的蓄積，進而影響肝病的進展。ApoA1作為卵磷脂膽固醇?；D移酶的載脂蛋白，主要參與膽固醇由外周組織向肝臟的逆向轉運[13]。而FABP1和FABP5均為脂肪酸結合蛋白家族的成員，其中FABP5不僅可以轉運脂肪酸為細胞生長提供能量及原材料，而且可以結合和轉運各種配體，參與腫瘤生長相關的信號轉導[14]。這些脂質(zhì)代謝相關蛋白在脂肪肝及肝腫瘤中都具有重要的作用，然而，它們的顯著下降對雄性傾向性肝病病變過程的影響尚有待進一步探究。

綜上所述，本研究應用雙向熒光差異凝膠電泳技術首次檢測了C57BL/6J雌雄小鼠肝臟組織的差異性蛋白表達，為研究性別差異性肝病發(fā)生的分子機制提供了基礎生物學信息和有益的線索。

[1] Bianco T, Cillo U, Amodio P, et al. Gender differences in the quality of life of patients with liver cirrhosis related to hepatitis C after liver transplantation[J]. Blood Purif, 2013, 36(3-4): 231-236.

[2] Pan JJ, Fallon MB. Gender and racial differences in nonalcoholic fatty liver disease[J]. World J Hepatol, 2014, 6(5): 274-283.

[3] Wang AG, Moon HB, Lee MR, et al. Gender-dependent hepatic alterations in H-ras12V transgenic mice[J]. J Hepatol, 2005, 43(5): 836-844.

[4] 定明, 何允剛, 張小飛, 等.蛋白質(zhì)組學技術篩選和鑒定白化黑線倉鼠皮膚白化相關差異蛋白質(zhì)[J]. 中國實驗動物學報,2014,22(1):79-82.

[5] 李順,陳麗香,彭秀華, 等.小鼠肝癌模型研究進展[J].中國實驗動物學報,2016,24(2):213-216.

[6] Boguski MS, McIntosh MW. Biomedical informatics for proteomics[J]. Nature, 2003, 422(6928): 233-237.

[7] Holbrook NJ, Ikeyama S. Age-related decline in cellular response to oxidative stress: links to growth factor signaling pathways with common defects[J]. Biochem Pharmacol, 2002, 64(5-6): 999-1005.

[8] Thu VT, Kim HK, Ha SH, et al. Glutathione peroxidase 1 protects mitochondria against hypoxia/reoxygenation damage in mouse hearts[J]. Pflugers Arch, 2010, 460(1): 55-68.

[9] Shibata S, Shibata N, Shibata T, et al. The role of Prdx6 in the protection of cells of the crystalline lens from oxidative stress induced by UV exposure[J]. Jpn J Ophthalmol, 2016, 60(5): 408-418.

[10] Jadeja RN, Urrunaga NH, Ahmad D, et al. Data regarding M1 muscarinic receptor-mediated modulation of hepatic catalase activity in response to oxidative stress[J]. Data Brief, 2016, 6: 405-409.

[11] Cohen JC, Horton JD, Hobbs HH. Human fatty liver disease: old questions and new insights[J]. Science, 2011, 332(6037): 1519-1523.

[12] Lu X, Yuan ZY, Yan XJ, et al. Effects of Angelica dahurica on obesity and fatty liver in mice[J]. Chin J Nat Med, 2016, 14(9): 641-652.

[13] Fernandez-Miranda C, Perez-Carreras M, Colina F, et al. A pilot trial of fenofibrate for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Dig Liver Dis, 2008, 40(3): 200-205.

[14] 周玲麗, 曹驥, 李薇, 等.RNA干擾 FABP5基因?qū)θ烁伟?HepG2細胞裸鼠移植瘤生長的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(4): 603-608.

DifferentialproteomicanalysisoflivertissuesbetweenmaleandfemaleC57BL/6Jmiceby2D-DIGE

RONG Zhuo-na， LI Hui-ling*， DONG Peng-hui， FAN Ting-ting， LI Juan， ZHAO Yi， WANG Fu-jin， WANG Ai-guo， WANG Jing-yu*

(Laboratory Animal Center, Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

ObjectiveTo identify the differential proteomic expressions between the liver tissues of male and female mice, and investigate the mechanisms underlying gender differences in liver diseases.MethodsTwo-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) were used to identify the differentially expressed proteins in the liver tissues of male and female C57BL/6J mice. The differentially expressed proteins were validated by Western blot and further analyzed by bioinformatics, including Gene Ontology (GO) analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).ResultsAmong the auto-detected 1767 protein spots by 2D-DIGE, 325 protein spots were differentially expressed (|ratio|≥1.5,P< 0.05) between the liver tissues of male and female mice, in which 78 spots were randomly selected for MALDI-TOF-MS identification and finally 48 distinct proteins were obtained. Compared with females, 14 and 34 proteins were up- or down-regulated in males, respectively. Among them, 6 differentially expressed proteins were validated by Western blot which confirmed the reliability of 2D-DIGE results.GO analysis showed that the differentially expressed proteins in the liver tissues of male and female mice are associated to various cellular component, molecular function and biological process. 6 pathways were significantly different between the liver tissues of males and females depending on KEGG analysis.ConclusionsThe proteomic data and related analysis of the liver tissues of C57BL/6J mice offer crucial clues for elucidating the underlying mechanisms of different gender effects on liver diseases.

Liver; Gender difference; Proteomic; Bioinformatics; Two dimension difference gel electrophoresis, 2D-DIGE

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0016-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.004

2017-02-19

遼寧省教育廳科學規(guī)劃課題(L2014341)；國家自然科學基金(30872950)。

戎卓娜，女，碩士，研究方向：肝腫瘤發(fā)生分子機制的研究。E-mail: rongzhuona@163.com

李慧玲，女，碩士，講師，研究方向：肝腫瘤發(fā)生分子機制的研究。E-mail: 5421992@qq.com。

王靖宇，男，教授，博士生導師，研究方向：動物行為學和分子生物學。E-mail: wangjingyus@163.com。*共同通訊