扁平苔蘚皮損中缺氧誘導因子1α、血管內(nèi)皮生長因子和蛋白激酶B的表達

馮珺 白莉 張學良

037003山西大同，同煤集團總醫(yī)院皮膚科（馮珺、張學良）；山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院皮膚科（白莉）

扁平苔蘚皮損中缺氧誘導因子1α、血管內(nèi)皮生長因子和蛋白激酶B的表達

馮珺 白莉 張學良

037003山西大同，同煤集團總醫(yī)院皮膚科（馮珺、張學良）；山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院皮膚科（白莉）

目的探討扁平苔蘚皮損中缺氧誘導因子1α（HIF?1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和蛋白激酶B（P?Akt）的表達與血管形成及凋亡的關(guān)系。方法免疫組化法和TUNEL法檢測32例扁平苔蘚患者皮損和20例脂肪瘤皮膚石蠟標本HIF?1α、VEGF和P?Akt表達和細胞凋亡情況，同時用CD34標記血管內(nèi)皮細胞，計算微血管密度（MVD）。結(jié)果HIF?1α、VEGF和P?Akt在32例扁平苔蘚組皮損表皮角質(zhì)形成細胞中均有不同程度的表達（++～+++），HIF?1α表達部位為細胞核，VEGF和P?Akt表達部位為細胞質(zhì)，高于對照組HIF?1α、VEGF和P?Akt（-～++）的表達，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。扁平苔蘚組皮損處MVD為（21.27±6.54）個/高倍視野（×200），對照組MVD為（10.26±1.10）個/高倍視野（×200），兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.607，P＜0.01）。扁平苔蘚組表皮層角質(zhì)形成細胞的凋亡指數(shù)（72.81%±9.234%）顯著高于對照組（28.16%±3.464%），兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.431，P＜ 0.01）。扁平苔蘚皮損中HIF?1α、VEGF和P?Akt的表達水平間均呈正相關(guān)（r值分別為0.625，0.453，0.455，均P＜ 0.01）。HIF?1α、VEGF和P?Akt的表達與MVD均呈正相關(guān)（r值分別為0.721，0.646，0.671，均P＜ 0.01）。結(jié)論HIF?1α及其下游靶基因VEGF、P?Akt在扁平苔蘚的發(fā)病中可能起一定的作用。

扁平苔蘚；缺氧誘導因子1，α亞基；血管內(nèi)皮生長因子類；蛋白激酶類；細胞凋亡

近年來，缺氧微環(huán)境在慢性炎癥性皮膚病及皮膚腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要性備受關(guān)注。一些研究發(fā)現(xiàn)，皮損處缺氧微環(huán)境可能與銀屑病及口腔扁平苔蘚的發(fā)病有關(guān)［1?3］，但組織缺氧是否參與皮膚扁平苔蘚的研究鮮有報道。缺氧誘導因子1α（HIF?1α）是組織細胞耐受缺氧微環(huán)境的重要因子，在組織缺氧微環(huán)境下，HIF?1α表達上調(diào)，可使細胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可誘導血管生成，促進細胞的增殖，是HIF?1α的下游靶基因。蛋白激酶B（Akt）是PI3K?Akt信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵因子，是VEGF發(fā)揮作用的重要通路。本研究通過檢測扁平苔蘚皮損中HIF?1α、VEGF、P?Akt表達，并用CD34抗體標記血管內(nèi)皮細胞，計算皮損處微血管密度（MVD），再用TUNEL法檢測皮損處細胞凋亡的情況，探討組織缺氧、血管生成、角質(zhì)細胞增殖及凋亡在扁平苔蘚發(fā)病中的作用。

對象與方法

一、資料

1.對象：收集2012—2015年手術(shù)切除后經(jīng)組織病理檢查證實的扁平苔蘚石蠟標本32例，其中男15例，女17例，年齡29～65歲，平均44.5歲。取材部位：四肢25例，軀干7例，3個月內(nèi)局部及全身均未使用過糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑，臨床資料來自門診病歷。選擇同期取自我院外科皮下脂肪瘤患者20例皮膚作為對照組，取材部位為軀干或四肢，其中男10例，女10例，年齡21～67歲，平均46歲。兩組性別和年齡差異無統(tǒng)計學意義，有可比性。所有組織均制成石蠟標本備用。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

2.試劑：兔抗人HIF?1α多克隆抗體（武漢博士德生物公司）；兔抗人P?Akt（S473）多克隆抗體（美國Bioworld公司）；兔抗人VEGF單克隆抗體、即用型二步法檢測試劑盒PV6000、DAB顯色劑、TUNEL試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

二、方法

1.免疫組化法：石蠟切片脫蠟至水化，3%H2O2溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。分別滴加HIF?1（1∶50）、VEGF（原液）、P?Akt（1∶50）、CD34（原液）。PBS代替一抗作為陰性對照，再滴加二步法試劑PV6000。DAB顯色，蘇木素復染、脫水封片。TUNEL法：石蠟切片脫蠟至水化，加3%H2O2甲醛。滴加蛋白酶K工作液，37℃孵育30 min；滴加新鮮配置的TUNEL反應(yīng)液，37℃孵育60 min，并做陰性對照。滴加POD，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染、脫水封片。結(jié)果 判斷：HIF?1α、VEGF及P?Akt陽性表達，每張切片均觀察整體染色情況，在×200視野下選擇5個有代表性的區(qū)域，每區(qū)計算200個細胞。陽性細胞數(shù)計分：陽性數(shù)＜5%計0分；陽性數(shù)6%～35%計1分；陽性數(shù)36%～70%計2分；陽性數(shù)＞70%計3分。著色強度計分：不著色計0分；弱著色（淡棕黃色）計1分；強著色（明顯棕黃色）計2分。陽性分級：以上兩項相加，≤ 2為（?）；3分為（+）；4分為（++）；5分為（+++）。MVD測定方法：被染成棕黃色或棕褐色、界限清楚的內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞團簇均作為一個血管計數(shù)。每張切片在×100光鏡下挑選血管分布最高區(qū)域，在×200鏡下選擇5個視野，計數(shù)微血管個數(shù)，計算MVD值。凋亡檢測結(jié)果以胞核著棕黃色為凋亡細胞，每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），每個視野計數(shù)250個角質(zhì)形成細胞的凋亡百分比，取平均值為凋亡指數(shù)。

2.統(tǒng)計學分析：所得數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，組間比較用方差分析和t檢驗，指標間相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、免疫組化結(jié)果

HIF?1α表達定位于細胞核，呈棕黃色顆粒狀表達。在對照組表皮中HIF?1α表達弱，在扁平苔蘚皮損處HIF?1α表達于除角質(zhì)層以外的表皮全層。扁平苔蘚組皮損組織中，HIF?1α陽性表達明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。VEGF表達定位于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀表達。在對照組的表皮中VEGF表達弱，主要在基底層細胞及皮脂腺組織中表達。扁平苔蘚組中，VEGF陽性表達明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。P?Akt表達定位于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀表達。在對照組表皮中P?Akt表達弱，主要在基底層細胞及皮脂腺、汗腺組織中表達。扁平苔蘚組織中，P?Akt陽性表達明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1，圖1～3。

CD34的表達及MVD的測定，CD34在對照組及扁平苔蘚組皮損的真皮層中血管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)中均為陽性表達。扁平苔蘚皮損處MVD為（21.27±6.54）個/高倍視野（×200），對照組MVD為（10.26± 1.10）個/高倍視野（× 200），兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.607，P＜0.01）。見圖4。

二、凋亡檢測

對照組陽性細胞散在分布于顆粒層及棘層，凋亡指數(shù)為（28.16±3.464）。扁平苔蘚組凋亡細胞主要位于表皮的基底層、棘層、和部分真皮淺層浸潤的淋巴細胞，凋亡指數(shù)為（72.81±9.234）。扁平苔蘚組凋亡指數(shù)明顯高于對照組（t=8.431，P＜0.01）。見圖5。

表1 扁平苔蘚組和對照組缺氧誘導因子1α（HIF?1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、蛋白激酶（P?Akt）的表達

圖1 缺氧誘導因子1α在扁平苔蘚組和對照組的表達（×100） 1A：扁平苔蘚組棘細胞層和基底細胞層角質(zhì)形成細胞和少數(shù)真皮淺層浸潤的淋巴細胞胞核染色陽性；1B：對照組僅在少數(shù)棘層角質(zhì)形成細胞呈弱陽性表達

圖2 血管內(nèi)皮生長因子在扁平苔蘚組和對照組中的表達（×100） 2A：扁平苔蘚組棘細胞層和基底細胞層的角質(zhì)形成細胞和部分血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)呈陽性表達；2B：對照組僅在基底層角質(zhì)形成細胞胞質(zhì)呈弱陽性表達

圖3 蛋白激酶B在扁平苔蘚組和對照組的表達（×100） 3A：扁平苔蘚組棘細胞層、基底層和血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)呈陽性表達；3B：對照組僅在基底層胞質(zhì)呈弱陽性表達

三、相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)分析，在扁平苔蘚組HIF?1α與VEGF（r=0.625，P＜0.01），VEGF與P?Akt（r=0.453，P＜0.01），P?Akt與HIF?1α（r=0.455，P＜0.01）的表達呈正相關(guān)。HIF?1α、VEGF 和 P?Akt的表達與MVD均呈正相關(guān)（r值分別為0.721，0.646，0.671，P＜0.01）。

討 論

HIF?1α是機體低氧應(yīng)答時誘導基因表達和恢復細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個核心調(diào)節(jié)因子。缺氧條件下，細胞產(chǎn)生HIF?1α與靶基因中的HRE結(jié)合點結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)錄，引起一系列細胞對缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)，在保持機體的氧穩(wěn)態(tài)具有重要的病理生理學意義。目前已知HIF?1α的靶基因有60多種，通過對靶基因的調(diào)控來調(diào)節(jié)糖代謝、氧運輸、細胞的生長與凋亡［4］。已有研究表明，缺氧條件下人角質(zhì)形成細胞株HIF?1α表達增高，并誘導血管生成，促進角質(zhì)形成細胞增殖。VEGF是目前所知作用最強的促血管生成因子，與其受體結(jié)合后刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，促進新生血管形成。在低氧組織中HIF?1α可誘導VEGF表達，并產(chǎn)生相應(yīng)的生理作用，促進新生血管形成。PI3K/Akt信號通路是近年來研究較多的細胞生存通路之一，在提高細胞對缺氧的耐受性和調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡中起著重要的作用。PI3K/Akt通路由PI3K和Akt組成，Akt被磷酸化后（P?Akt）可上調(diào)HIF?1α表達，提高組織細胞對低氧環(huán)境的耐受性。

扁平苔蘚是一種慢性復發(fā)性炎癥性皮膚病，其病理學改變有毛細血管的增生，表皮角質(zhì)形成細胞的增生與調(diào)亡共存。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF?1α、VEGF和P?Akt在脂肪瘤皮膚中均呈陰性或弱陽性表達，而在扁平苔蘚皮損組織中表達明顯增高；應(yīng)用CD34標記皮損組織血管，發(fā)現(xiàn)扁平苔蘚皮損處血管數(shù)目也明顯高于脂肪瘤皮膚。研究結(jié)果提示，扁平苔蘚皮損處由于角質(zhì)形成細胞過度增殖可能導致氧需求增加和局部氧供給相對不足。扁平苔蘚皮損組織中的角質(zhì)形成細胞為適應(yīng)局部組織的低氧環(huán)境產(chǎn)生HIF?1α，可能誘導 VEGF表達，進一步激活PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵因子Akt，磷酸化的Akt（P?Akt）有可能再促使HIF?1α表達增高，促進細胞增殖，加劇局部皮損處缺氧微環(huán)境。本研究還顯示，扁平苔蘚患者皮損中HIF?1α、VEGF和P?Akt的表達與MVD值亦呈明顯正相關(guān)，提示扁平苔蘚患者皮損HIF?1α、VEGF和P?Akt的表達增高與其血管增殖密切相關(guān)。此外，扁平苔蘚皮損處因缺氧也可能通過Caspase依賴的線粒體通路促進細胞凋亡，最終使扁平苔蘚皮損處角質(zhì)形成細胞處于增殖和凋亡亢進的病理性平衡。本研究初步證明了HIF?1α、VEGF和P?Akt在扁平苔蘚的發(fā)生、發(fā)展和新血管生成中可能起到協(xié)同作用，但其具體機制還需進一步研究。

圖4 CD34在扁平苔蘚組和對照組中的表達（×100） 4A：扁平苔蘚組血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)呈陽性表達，微血管數(shù)目較多；4B：對照組微血管數(shù)目較少

圖5 細胞凋亡在扁平苔蘚組和對照組中的表達（×100） 5A：扁平苔蘚組凋亡細胞主要位于棘細胞層和基底層和部分真皮淺層浸潤的淋巴細胞中，且數(shù)量較多；5B：對照組凋亡細胞位于顆粒層及少數(shù)棘層

［1］Rosenberger C,Solovan C,Rosenberger AD,et al.Upregulation of hypoxia?inducible factors in normal and psoriatic skin［J］.J Invest Dermatol,2007,127（10）:2445?2452.DOI:10.1038/sj.jid.5700874.

［2］de CarvalhoFraga CA,Alves LR,Marques?Silva L,et al.High HIF?1α expression genotypes in oral lichen planus［J］.Clin Oral Investig,2013,17（9）:2011?2015.DOI:10.1007/s00784?013?0920?8.

［3］Ding M,Xu JY,Fan Y.Altered expression of mRNA for HIF?1alpha and its target genes RTP801 and VEGF in patients with oral lichen planus［J］.Oral Dis,2010,16（3）:299?304.DOI:10.1111/j.1601?0825.2009.01645.x.

［4］Lando D,Gorman JJ,Whitelaw ML,et al.Oxygen?dependent regula?tion of hypoxia?inducible factors by prolyl and asparaginyl hydroxylation［J］.Eur J Biochem,2003,270（5）:781?790.DOI:10.1046/j.1432?1033.2003.03445.x.

Expression of hypoxia?inducible factor 1α,vascular endothelial growth factor and protein kinase B in lichen planus lesions

Feng Jun,Bai Li,Zhang Xueliang

Department of Dermatology,General Hospital of Datong Coal Mining Group,Datong 037003,Shanxi,China（Feng J,Zhang XL）;Department of Dermatology,First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China（Bai L）

Bai Li,Email:baili@medmail.com

ObjectiveTo explore relationships of expression of hypoxia?inducible factor?1α（HIF?1α）,vascular endothelial growth factor（VEGF）and protein kinase B（P?Akt）with angiopoiesis and cell apoptosis.MethodsBiopsy specimens were collected from skin lesions of 32 patients with lichen planus and normal skin of 20 patients with lipomyoma,and subjected to paraffin embedding.Immunohistochemical staining was performed to measure expression of HIF?1α,VEGF and P?Akt,and TUNEL technique was used to detect apoptosis of keratinocytes in these paraffin?embedded tissue sections.Microvessel density（MVD）wasassessedbycountingCD34?labeledvascularendothelialcells.ResultsHIF?1α,VEGFandP?Akt were moderately or strongly expressed in lichen planus lesions,but absent or weakly expressed in normal skin of controls,and the expression of HIF?1α,VEGF and P?Akt was significantly higher in the lichen planus group than in the control group（allP＜ 0.01）.HIF?1α was mainly expressed in nuclei of keratinocytes,while VEGF and P?Akt were expressed in the cytoplasm of keratinocytes.In addition,the lichen planus group showed significantly increased MVD（21.27±6.54vs.10.26±1.10 microvessels/high?power（200 ×）field,t=5.607,P＜ 0.01）and apoptosis rate of keratinocytes（72.81% ± 9.234%vs.28.16% ±3.464%,t=8.431,P＜0.01）compared with the control group.Pearson correlation analysis showed that there were positive correlations between HIF?1α and VEGF expression,between VEGF and P?Akt expression,and between P?Akt and HIF?1α expression in the lichen planus group（r=0.625,0.453,0.455,respectively,allP＜ 0.01）,and expression of HIF?1α,VEGF and P?Akt was all positively correlated with MVD（r=0.721,0.646,0.671,respectively,allP＜ 0.01）.ConclusionHIF?1α and its downstream target genes VEGF and P?Akt may play a certain role in the occurrence of lichen planus.

Lichen planus;Hypoxia?inducible factor 1,alpha subunit;Vascular endothelial growth factors;Protein kinases;Apoptosis

白莉，Email：baili@medmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.01.005

2016?06?27）

（本文編輯：吳曉初）