Wnt5A基因過表達對黑素細胞骨架蛋白的影響

粟倩雅 林彤 周啟艷 彭霖

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所激光科

Wnt5A基因過表達對黑素細胞骨架蛋白的影響

粟倩雅 林彤 周啟艷 彭霖

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所激光科

目的探討攜帶Wnt5A全基因序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代黑素細胞后，Wnt5A表達升高對黑素細胞骨架蛋白的影響。方法培養(yǎng)原代人表皮黑素細胞，并分為3組：①空白對照組：除細胞外不加任何試劑；②陰性對照組：加入空白的去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、Opti?MEM培養(yǎng)基及Lipo3000；③Wnt5A質(zhì)粒組：加入Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、Opti?MEM培養(yǎng)基及Lipo3000。Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑素細胞，采用qPCR法檢測各組Wnt5A、Ras相關C3肉毒素底物1（Rac1）、絲狀肌動蛋白（F肌動蛋白）和β微管蛋白基因表達，Western印跡法測定Wnt5A、酪氨酸激酶受體2（ROR2）、Rac1、F肌動蛋白和β微管蛋白表達，并通過細胞免疫熒光試驗觀察細胞骨架蛋白表達情況。結(jié)果qPCR法顯示，Wnt5A質(zhì)粒組、陰性對照組和空白對照組Wnt5A mRNA及其下游基因Rac1和F肌動蛋白mRNA表達量3組間差異均有統(tǒng)計學意義（F=1 374.179、112.576、66.458，均P＜0.01），但β微管蛋白mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Wnt5A質(zhì)粒組Wnt5A、Rac1和F肌動蛋白mRNA表達量均顯著高于空白對照組及陰性對照組（P＜0.05）。Western印跡法顯示，Wnt5A質(zhì)粒組Wnt5A蛋白表達較空白對照及陰性對照明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Wnt5A質(zhì)粒組Rac1、ROR2、F肌動蛋白表達均明顯低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），但β微管蛋白表達在3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。細胞免疫熒光實驗顯示，Wnt5A質(zhì)粒組綠色（β微管蛋白）、紅色（F肌動蛋白）熒光強度與兩個對照組相比均無明顯差別，但黑素細胞體積明顯增大，樹突數(shù)目明顯增多，細胞骨架顯著改變，表現(xiàn)為F肌動蛋白強弱不一，紋理模糊，張力絲斷裂，局部呈團塊狀。結(jié)論黑素細胞Wnt5A基因表達升高可調(diào)控細胞骨架相關基因及蛋白表達，使黑素細胞體積增大、樹突增多、骨架改變，可能有利于黑素小體的輸送傳遞，參與色素沉著性疾病的發(fā)病。

黑素細胞；Wnt信號通路；細胞骨架；肌動蛋白類；微管蛋白；rac1 GTP結(jié)合蛋白質(zhì)；Wnt5A蛋白質(zhì)

在黑素瘤的發(fā)展過程中非經(jīng)典通路Wnt5A表達有所增加，且Wnt5A表達增加與黑素瘤轉(zhuǎn)移有很大關系［1］。在黃褐斑皮損中，Wnt5A、Wnt抑制因子1（WIF1）、分泌型卷曲相關蛋白 2（SFRP2）等多個Wnt通路相關蛋白表達也異常增高，其中Wnt5A在皮損黑素細胞中表達上調(diào)，提示它在黃褐斑黑素細胞生物學改變和黑素生成過程中起作用［2］。在黃褐斑組織學上，黑素細胞功能亢進，體積增大，突觸延長，部分黑素細胞的樹突甚至伸入真皮淺層，而黑素細胞數(shù)量并無明顯增加［3］。我們研究Wnt5A表達升高對黑素細胞骨架蛋白和黑素轉(zhuǎn)運的作用。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

Medium254黑素細胞培養(yǎng)基、HMGS添加劑、分離酶（Protease type IX）、Triton?X100（美國Sigma公司），Opti?MEM培養(yǎng)基、完全1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），第一鏈cDNA合成試劑盒、脂質(zhì)體3000（Lipo 3000）（美國Thermo Fisher Scientific公司），胰蛋白酶（美國Amresco公司），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），SYBR Green Master Mix（High ROX premixed）（美國 Vazyme 公司），Wnt5A/Ras相關C3肉毒素底物1（Rac1）/絲狀肌動蛋白（F肌動蛋白）/酪氨酸激酶受體2（ROR2）小鼠單克隆抗體（英國Abcam公司），β微管蛋白小鼠單克隆抗體（武漢谷歌生物科技公司），羅丹明標記的鬼比環(huán)肽（美國Cytoskeleton公司），鼠抗人β微管蛋白一抗抗體（美國Affinity Biosciences公司），F(xiàn)ITC標記的山羊抗鼠IgG二抗抗體（上海翊圣生物科技有限公司），DAPI（美國Southern Biotech公司），人GAPDH內(nèi)參引物、Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

二、人原代黑素細胞的分離與培養(yǎng)

取男童包皮環(huán)切術后多余皮膚，用分散酶作用10～14 h，分離表皮與真皮，加入0.25%胰酶，0.01%乙二胺四乙酸（EDTA）室溫下消化，1640培養(yǎng)基終止消化，棄上清液，用完全黑素培養(yǎng)基混懸。24 h后首次換液，去除未貼壁的細胞，15～20 d后培養(yǎng)細胞達到70%～80%融合時傳代純化培養(yǎng)。取第2～5代黑素細胞用于實驗。本研究通過中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，術前患者家屬或監(jiān)護人均簽署知情同意書。

三、Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒的構(gòu)建

Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司構(gòu)建，質(zhì)粒的酶切圖譜見圖1。Wnt5A基因序列參見NCBI鏈接地址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001256105.1。

圖1 Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒的酶切圖譜

四、qPCR檢測Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細胞后各基因表達

將黑素細胞接種到6孔板上，待細胞融合70%～90%時，各孔加入2 ml M254黑素細胞培養(yǎng)基。實驗設3組：①空白對照組：除細胞外不加任何試劑；②陰性對照組：加入空白的去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、Opti?MEM及Lipo3000；③Wnt5A質(zhì)粒組：加入Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、Opti?MEM及Lipo3000。陰性對照組及Wnt5A質(zhì)粒組質(zhì)粒濃度均為0.642 g/L（實際每孔加入質(zhì)粒DNA為1 μg）。轉(zhuǎn)染試劑準備如下：用121.25 μl Opti?MEM培養(yǎng)基稀釋 3.75 μl Lipo3000 試劑，充分混勻；用 121.44 μl Opti?MEM培養(yǎng)基稀釋1.56 μl質(zhì)粒DNA，然后添加2 μl P3000試劑，充分混勻。在已稀釋的Lipo3000試劑中加入稀釋的質(zhì)粒DNA，室溫孵育10～15 min。最后將DNA-脂質(zhì)體復合物加入細胞孔中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿以混勻。每組設3個復孔。培養(yǎng)48 h后提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，行qPCR實驗，擴增引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，擴增條件：50℃ 2 min；95℃ 預變性10 min；95℃變性10 s；60℃退火/延伸40 s；共40個循環(huán)。采集熒光信號；自60℃至95.0℃緩慢升溫進行熔解曲線分析。參照說明書通過相對CT法檢測Wnt5A、Rac1、F肌動蛋白和β微管蛋白基因表達。

五、Western印跡法檢測Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細胞后各蛋白表達

將黑素細胞接種到60 mm培養(yǎng)皿（底面積是6孔板單孔的2.2倍）上，各試劑按相應規(guī)模調(diào)整，分組、轉(zhuǎn)染方法同前。培養(yǎng)72 h后，按細胞全蛋白提取試劑盒方法提取細胞總蛋白，蛋白樣品加熱變性后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜，與一抗、二抗孵育，ECL發(fā)光法壓片顯色。用軟件ImageJ或Alpha Ease FC對所得條帶進行灰度分析，根據(jù)目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度比值計算相對灰度值，檢測 Wnt5A、ROR2、Rac1、F肌動蛋白和β微管蛋白的表達。

六、通過細胞免疫熒光實驗觀察Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細胞后細胞骨架及相關蛋白表達

提前數(shù)天將細胞傳代于放置有預先包被10 μg/cm2纖維連接蛋白蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中。待細胞融合60%～70%時，各試劑按相應規(guī)模調(diào)整后，分組、轉(zhuǎn)染方法同前。培養(yǎng)72 h后，浸入4%多聚甲醛液中固定細胞，0.5%TritonX?100室溫下裂解細胞后，用封閉羊血清覆蓋細胞。依次滴加100 nmol/L羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽、鼠抗人β微管蛋白一抗溶液（1∶400）、FITC標記的山羊抗鼠IgG二抗溶液（1∶200），各在37℃避光孵育30 min。用DAPI封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架及F肌動蛋白、β微管蛋白表達。

七、統(tǒng)計學方法

用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析及SNK檢驗分析各組間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、qPCR檢測Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細胞后各基因的表達

Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑素細胞后，Wnt5A質(zhì)粒組Wnt5A mRNA表達量及其下游基因Rac1和F肌動蛋白mRNA表達量均顯著高于空白對照組及陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但β微管蛋白基因表達在3組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

二、Western印跡法檢測Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細胞后各蛋白表達量

Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑素細胞后，Wnt5A質(zhì)粒組Wnt5A蛋白表達較空白對照及陰性對照明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Wnt5A質(zhì)粒組Rac1、ROR2、F肌動蛋白表達均明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。β微管蛋白表達在3組間差異無統(tǒng)計學意義。見表3，圖2。

表1 qPCR擴增引物序列

表2 qPCR檢測各組黑素細胞Wnt5A基因及其下游基因的相對表達量（±s）

表2 qPCR檢測各組黑素細胞Wnt5A基因及其下游基因的相對表達量（±s）

注：n=3。Rac1：Ras相關C3肉毒素底物1

組別Wnt5A質(zhì)粒組陰性對照組空白對照組F值P值Wnt5A 812.694±37.922 1.028±0.238 1.032±0.293 1 374.179＜0.001 Rac1 4.035±0.022 1.977±0.244 1.037±0.357 112.576＜0.001絲狀肌動蛋白2601.842±344.025 507.306±372.947 1.267±1.098 66.458 0.002 β微管蛋白0.870±0.218 0.660±0.108 1.013±0.203 2.829 0.208

表3 各組黑素細胞Wnt5A、ROR2、F?actin、β微管蛋白及Rac1蛋白條帶相對灰度值（±s）

表3 各組黑素細胞Wnt5A、ROR2、F?actin、β微管蛋白及Rac1蛋白條帶相對灰度值（±s）

注：n=3。ROR2：酪氨酸激酶受體2；Rac1：Ras相關C3肉毒素底物1

組別Wnt5A質(zhì)粒組陰性對照組空白對照組F值P值Wnt5A 0.690±0.003 0.153±0.003 0.152±0.003 3 940.029＜0.001 β微管蛋白0.688±0.014 0.687±0.010 0.688±0.010 0.030 0.971絲狀肌動蛋白0.423±0.009 0.822±0.011 0.823±0.010 1 918.495＜0.001 Rac1 0.706±0.015 0.883±0.012 0.882±0.113 233.699＜0.001 ROR2 0.707±0.015 0.936±0.119 0.935±0.119 1 287.949＜0.001

三、細胞免疫熒光實驗觀察Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細胞后細胞骨架相關蛋白的表達

Wnt5A質(zhì)粒組綠色（β微管蛋白）、紅色（F肌動蛋白）熒光強度與兩個對照組相比均無明顯差別，但細胞體積明顯增大，樹突數(shù)目明顯增多。仔細觀察紅色熒光圖，與兩個對照組相比，Wnt5A質(zhì)粒組細胞骨架有明顯改變，表現(xiàn)為F肌動蛋白紋理模糊，張力絲斷裂、強弱不一，局部呈團塊狀。見圖3。

討 論

圖2 Western印跡法檢測Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑素細胞后各組Wnt5A、ROR2、Rac1、絲狀肌動蛋白、β微管蛋白及Rac1蛋白電泳圖 ROR2：酪氨酸激酶受體2；Rac1：Ras相關C3肉毒素底物1

Wnt經(jīng)典通路主要由Wnt3A與β聯(lián)蛋白介導，影響細胞增殖、發(fā)育和組織代謝相關靶基因表達及腫瘤的發(fā)生［4］；非經(jīng)典通路通過Wnt5A、Wnt11等轉(zhuǎn)導信號，調(diào)控細胞骨架形成、細胞的極性、細胞間黏附和遷移［5］。Wnt5A可以通過非經(jīng)典途徑調(diào)控RhoGTP酶，啟動下游信號轉(zhuǎn)導，影響樹突形成相關蛋白。樹突形成相關蛋白，包括如Ras相關的 Rac1（C3肉毒素底物 1）和Cdc4（細胞周期分裂蛋白4）。樹突相關蛋白水平受RhoGTP酶調(diào)控［6］。RhoGTP酶（又稱小G蛋白）是重要的細胞內(nèi)信號分子，屬于Ras超家族，有20多種家庭成員，其中較重要的是 RhoA、Rac1 和Cdc42［7］。RhoGTP 酶對傳遞整合素介導的反應非常必要，它可以緊密調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的動力，在細胞的黏附、傳遞和遷移的過程中提供關鍵性的信號轉(zhuǎn)導［8?9］。

在進行Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代人黑素細胞的實驗過程中，我們起初按照Lipofectamine3000試劑推薦的轉(zhuǎn)染規(guī)模（2.5 μg）進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)Wnt5A質(zhì)粒組及陰性對照組轉(zhuǎn)染后6 h基本無細胞死亡，24、48、72 h后分別出現(xiàn)明顯的細胞死亡，隨轉(zhuǎn)染時間增加，細胞死亡數(shù)目增多，至72 h提取蛋白時死亡細胞達60%～70%。實驗過程中我們嘗試6 h換液、24 h換液，Wnt5A質(zhì)粒組及陰性對照組細胞死亡數(shù)目未見明顯減少，而空白組細胞數(shù)量和形態(tài)無明顯改變，考慮導致細胞死亡的原因可能是去內(nèi)毒素質(zhì)粒毒性較大，同時體外培養(yǎng)的原代人黑素細胞生存力較差，因此，我們改進了實驗條件，將質(zhì)粒的質(zhì)量減小到1.0 μg，以保證轉(zhuǎn)染后的細胞狀態(tài)，使目標蛋白能夠過表達。質(zhì)粒設計過程中，本可以在質(zhì)粒上加熒光標記，轉(zhuǎn)染后可采用熒光顯微鏡觀察，流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率，但考慮到質(zhì)粒本身的熒光顏色可能干擾后期實驗中目標蛋白的觀察，因此，沒有在質(zhì)粒上加入熒光標記。

圖3 Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代黑素細胞后免疫熒光染色（激光共聚焦顯微鏡×60） 綠色熒光標記β微管蛋白；紅色熒光標記絲狀肌動蛋白；藍色熒光標記細胞核。Wnt5A質(zhì)粒組細胞骨架有明顯改變，表現(xiàn)為絲狀肌動蛋白紋理模糊，張力絲斷裂，強弱不一、局部呈團塊狀

本研究結(jié)果顯示，Wnt5A過表達后，Rac1和F肌動蛋白基因均出現(xiàn)表達升高，但Rac1、F肌動蛋白和ROR2蛋白表達降低，β微管蛋白表達沒有明顯變化。我們推測Wnt5A可能通過Ca2+途徑或平面細胞極性（PCP）途徑，激活下游RhoGTP酶Rac1，使Rac1基因表達增加。Rac1基因參與下游通路的信號轉(zhuǎn)導，激活F肌動蛋白基因，因此被消耗，使得Rac1蛋白表達減少。細胞骨架由微絲、中間絲和微管及相關的骨架蛋白組成［10］，其中微絲主要由3類蛋白質(zhì)組成：肌動蛋白、肌球蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白。肌動蛋白有球狀單體（G肌動蛋白）和絲狀聚合體（即F肌動蛋白）兩種形式，F(xiàn)肌動蛋白為雙螺旋狀微絲，G肌動蛋白不斷地加入或脫落，使F肌動蛋白保持著聚合和解聚的動態(tài)平衡，維持細胞骨架的形態(tài)和功能［11］。F肌動蛋白減少可能是由于解聚增加，細胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重排；另一種可能是F肌動蛋白翻譯成蛋白較轉(zhuǎn)錄為mRNA晚，因此F肌動蛋白未在培養(yǎng)72 h時出現(xiàn)蛋白明顯升高，可能是細胞培養(yǎng)時間過短。β微管蛋白的mRNA和蛋白表達量均無明顯改變，但免疫熒光染色顯示熒光強度減弱，提示β微管蛋白在量上沒有改變，而是細胞的微管系統(tǒng)重新排列，促進樹突向外生長［12］，與F肌動蛋白共同使細胞胞體變大、樹突變長。

細胞免疫熒光實驗中我們發(fā)現(xiàn)，Wnt5A過表達的黑素細胞體積增大，樹突增多，骨架重排。黑素細胞位于表皮基底層，必須通過增加樹突的數(shù)量和長度才能更有效地實現(xiàn)向角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)運黑素。黑素細胞樹突的重要功能就是為黑素小體向角質(zhì)形成細胞的輸送和轉(zhuǎn)運提供一個管狀結(jié)構(gòu)［13］。我們推測，Wnt5A表達增加后，通過活化Rac1（表現(xiàn)為F肌動蛋白解聚增加，紋理模糊、不連續(xù)，局部呈團塊狀）影響細胞樹突，誘導黑素細胞內(nèi)骨架蛋白的重排，使胞體增大和樹突增多等。我們推測，胞體增大、樹突增多、骨架重排這一系列變化可共同促進黑素細胞向角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)運黑素小體，促進色素沉著。

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Effects of Wnt5A gene overexpression on cytoskeletal proteinsof melanocytes

Su Qianya,Lin Tong,Zhou Qiyan,Peng Lin
Laser Department,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Lin Tong,Email:ddlin@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the effect of Wnt5A gene overexpression on cytoskeletal proteins of melanocytes after the plasmid containing the Wnt5A gene is transfected into primary melanocytes.MethodsIn vitrocultured primary human melanocytes were divided into three groups:blank control group receiving no treatment,negative control group transfected with endotoxin?free pcDNA3.1（+）empty vector by Lipo3000 in Opti?MEM medium,Wnt5A plasmid group transfected with endotoxin?free pcDNA3.1（+）vector containing the Wnt5A gene by Lipo3000 in Opti?MEM medium.After the trans?fection,quantitative PCR（qPCR）was performed to measure the mRNA expression of Wnt5A,ras?related C3 botulinum toxin substrate 1（Rac1）,filamentous actin（F?actin）and β?tubulin,Western blot analysis to determine the protein expression of Wnt5A,receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2（ROR2）,Rac1,F?actin and β?tubulin,and an immunofluorescence assay（IFA）to observe the expression of cytoskeletal proteins.ResultsqPCR showed significant differences in the mRNA expression of the Wnt5A gene and its downstream genes Rac1 and F?actin among the Wnt5A plasmid group,negative control group and blank control group（F=1 374.179,112.576,66.458,respectively,allP＜ 0.01）,but there was no significant difference in the mRNA expression of β?tubulin among the three groups（P＞ 0.05）.Additionally,the Wnt5A plasmid group showed significantly higher mRNA expression of Wnt5A,Rac1 and F?actin compared with the blank control group and negative control group（allP＜ 0.05）.As Western blot analysis revealed,compared with the blank control group and negative control group,the Wnt5A plasmid group showed significantly higher Wnt5A protein expression（bothP＜ 0.05）,but significantly lower protein expression of Rac1,ROR2 and F?actin（allP＜ 0.05）.However,no significant difference in β?tubulin protein expression was observed among the three groups（P＞ 0.05）.IFA showed no obvious difference in the fluorescence intensity of β?tubulin or F?actin between the Wnt5A group and the two control groups,but melanocytes showed larger size and increased number of dendrites,and the cytoskeleton changed dramatically with varying fluorescence intensity of F?actin,fuzzy texture,fractured or locally clustered tonofilaments in the Wnt5A group.ConclusionThe overexpression of the Wnt5A gene in melanocytes can regulate the mRNA and protein expression of cytoskeletal proteins,make melanocytes larger and more dendritic,and cause changes in the cytoskeleton,which may facilitate the transportation of melanosomes,and participate in the occurrence of hyperpigmented diseases.

Melanocytes;Wnt signaling pathway;Cytoskeleton;Actins;Tubulin;rac1 GTP?binding protein;Wnt5A protein

林彤，Email：ddlin@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.08.009

江蘇省自然科學基金（BK2012507）

Fund program:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012507）

2016?08?01）

（本文編輯：周良佳 顏艷）