荷葉水提物對實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠脂代謝的影響及機(jī)制*

李毛毛, 黃鑫源, 梁乾坤， 李云霞， 剡 媛， 田志峰， 邱小青， 張曉文，宋 清， 李紅芳,5△

(1. 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院, 2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730000；4. 廣州市體育科學(xué)研究所， 廣東 廣州 510000； 5. 甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000)

荷葉水提物對實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠脂代謝的影響及機(jī)制*

李毛毛1, 黃鑫源1, 梁乾坤2， 李云霞2， 剡 媛2， 田志峰3， 邱小青3， 張曉文4，宋 清4， 李紅芳2,5△

(1. 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院, 2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730000；4. 廣州市體育科學(xué)研究所， 廣東 廣州 510000； 5. 甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000)

目的探討荷葉水提物的減肥降脂作用及機(jī)制。方法通過離體脂肪組織灌流實(shí)驗(yàn)觀察荷葉水提物對正常SD大鼠離體脂肪組織游離脂肪酸(FFA)釋放的影響；利用高糖高脂飲食誘導(dǎo)建立實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠模型，探討荷葉水提物給藥4周后，大鼠體重和血脂水平的變化，并采用RT-PCR和免疫組化技術(shù)對脂肪組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)和瘦素(leptin)表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)荷葉水提物可明顯促進(jìn)離體脂肪組織FFA的釋放。在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中劑量荷葉(60 mg/kg)與奧利斯他相似，可使實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠體重、血脂水平明顯下降(P<0.05)，使脂肪組織PPAR-γ和瘦素的表達(dá)明顯下降(P<0.05)。結(jié)論荷葉水提物可通過改善大鼠脂肪組織PPAR-γ和leptin的表達(dá)，促進(jìn)脂肪的動員和分解，降低肥胖大鼠體重和血脂水平，有望研發(fā)為減肥藥物。

荷葉水提物；大鼠；肥胖；PPAR-γ；瘦素

肥胖已經(jīng)成為危害全球人類健康的疾病之一。肥胖人群患糖尿病、冠心病、腎功能衰竭等疾病的風(fēng)險急劇增加[1，2]。荷葉為睡蓮科植物蓮的葉，又名蓮葉、藕葉，在我國南北方均有種植，是我國傳統(tǒng)的

中藥材之一。荷葉是一種既可食用又可藥用的降脂減肥天然植物。國內(nèi)外對荷葉的藥理藥效研究表明：荷葉具有調(diào)脂減肥、抗氧化、抑菌、降壓和保護(hù)血管內(nèi)皮等的功能[3，4]，但其減肥降脂作用機(jī)制還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究荷葉水提物對實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠體重和脂代謝水平的影響，并檢測脂肪組織游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)的釋放和脂肪組織中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)和瘦素(leptin)表達(dá)的變化，以期探討荷葉改善脂代謝的分子機(jī)制，為進(jìn)一步指導(dǎo)實(shí)踐和減肥降脂藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 荷葉提取物制備

將荷葉粉碎后，采用水提法進(jìn)行提取，提取條件為：料水比例1∶10，加熱溫度80℃，提取時間2 h。提取后過濾，將提取液濃縮，噴霧干燥，得到荷葉水取物。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

去脂肪酸小牛血清白蛋白(MP Biomedicals New Zealand Limited)； 鹽酸腎上腺素(上海喬豐制藥有限公司)；奧利斯他(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；SP 免疫組化試劑盒購(北京中杉金橋公司)；Trizol (Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)；PPAR-γ抗體(affinity Biosciences公司)；leptin 抗體(Immunoway 公司)；Leptin和PPAR-γ的引物是由生工生工生物工程股份有限公司設(shè)計。

1.3 離體實(shí)驗(yàn)

健康成年SD大鼠,體重(250±20)g,將大鼠脫臼處死,迅速剪取腹膜后脂肪組織塊，每份(300±5.0)mg， 放入 37℃的含有 0.04 g/ml 去脂肪酸小牛血清白蛋白的 Krebs 液中溫育。溫育液中可分別加入不同濃度的荷葉水提物及不同的阻斷劑， 加入的藥物容量均為600 μl。溫育過程中持續(xù)通入 95%的O2和5%CO2的混合氣體。90 min 后,吸取溫育液用一次提取比色法測定 FFA的含量[5]。實(shí)驗(yàn)共分為 5組(n=8):(1)正常對照組(0.9% NaCl)；(2)鹽酸腎上腺素組(10-6mol/L)；(3)荷葉水提物低劑量組(0.003 mg/ml)；(4)荷葉水提物中劑量組(0.01 mg/ml)；(5)荷葉水提物高劑量組(0.02 mg/ml)。

1.4 肥胖大鼠模型的建立及分組

4周齡健康SD大鼠(SPF級),體重(70±10)g, 由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后, 按體重隨機(jī)分為 2 組, 對照組：喂飼普通基礎(chǔ)飼料；模型組：喂飼高脂飼料。高脂飼料含基礎(chǔ)飼料38.5%，精煉豬油25.6%，蛋黃粉25.6%和蔗糖10.3%。每天配制1次。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水、攝食, 每周稱體重1次并記錄。 第8周末, 以模型組大鼠的體重超過對照組體重20%的作為肥胖大鼠標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)將肥胖大鼠分為荷葉水提物低劑量組(20 mg/kg,n=7)；荷葉水提物中劑量組(60 mg/kg,n=7)；荷葉水提物高劑量組(180 mg/kg,n=7)；奧利斯他組(48 mg/kg,n=6)；模型組(n=6)和正常對照組(n=6)。將荷葉水提物和奧利斯他均用生理鹽水配置為2ml的混懸液灌胃，每天給藥2次，共給藥4周。模型組及正常對照組均以等量生理鹽水灌胃。給藥期間對照組繼續(xù)飼普通基礎(chǔ)飼料，其余組給予高脂飼料喂養(yǎng)。

1.5 標(biāo)本采集

給藥4周后，禁食24 h，自由飲水，股動脈采血，室溫靜置1～2 h后，在 4℃條件下離心以 3 500～4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心 10 min，取上層清液即血清，分裝于離心管中，送至蘭州大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科測定血中總膽固醇(total cholestrol，TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)含量。取大鼠下丘腦組織和腹膜后脂肪組織用5%的福爾馬林溶液固定。取100 g左右大鼠下丘腦組織和脂肪組織用液氮速凍后，存放在80℃冰箱中。

1.6 RT-PCR方法

取大鼠脂肪組織進(jìn)行總mRNA的提取，將mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，將cDNA樣品稀釋5倍，采用promega 試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，拍照，利用Image J 軟件分析條帶的灰度值，計算相對含量。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 2 min,95℃變性5 s，leptin為58℃退火30 s,擴(kuò)增38個循環(huán)和PPAR-γ為60℃退火30 s,擴(kuò)增36個循環(huán),結(jié)束時采集熒光信號。β-actin作為內(nèi)參引物序列：上游TCCTGTGGCATCCATGAAACT，下游GAAGCACTTGCGGTGCACGAT；PPAR-γ引物序列：上游CATGCTTGTGAAGGATGCAAG，下游TTCTGAAACCGACAGTACTGACAT；leptin引物序列：TTGTCACCAGGATCAATGACATTT，下游GACAAACTCAGAATGGGGTGAAG。

1.7 免疫組化法

將下丘腦和脂肪組織的石蠟切片脫蠟和水化，PBS液沖洗5 min×3次后，3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，PBS液沖洗5 min×3次， 滴加山羊血清封閉，室溫30 min后滴加一抗(PPAR-γ為1∶200，leptin為1∶200)，4℃過夜，PBS液沖洗5 min×3次,滴加二抗,室溫孵育10 min，再以DAB顯色15 min，蘇木素復(fù)染，脫水封片。免疫組化實(shí)驗(yàn)共設(shè)7組，除上述 6 組外增加一組陰性對照組(即用 PBS 替代一抗孵育)。

1.8 統(tǒng)計方法

采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素變量的方差分析。

2 結(jié)果

2.1荷葉水提物對正常大鼠離體脂肪組織游離脂肪酸釋放的影響

與正常對照組比較，鹽酸腎上腺素可明顯促進(jìn)離體脂肪組織釋放 FFA，低濃度水提物荷葉對脂肪組織釋放 FFA 無明顯的促進(jìn)作用。中、高濃度的荷葉水提物可明顯促進(jìn)離體脂肪組織釋放FFA(P<0.01，表1)。

GroupFFACon105.53±27.86E561.48±28.98**LLL130.53±17.21LLM388.32±39.66**LLH475.38±18.57**

FFA: Free fatty acids; Con: Blank group; E: Epinephrine group; LLL: Low-concentration group of lotus leaves: LLM：Medium-concentration group of lotus leaves；LLH：High-concentration group of lotus leaves

**P<0.01vsCon group

2.2荷葉對實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠體重和血脂水平的影響

給藥后4周，奧利司他組、中劑量組和高劑量組體重均顯著下降(P<0.05,P<0.01，表2)。中劑量組和高劑量組TC、TG、LDL-C水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。中劑量組和高劑量組HDL-C水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。

2.3荷葉水提物對實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠脂肪組織瘦素表達(dá)影響

RT-PCR結(jié)果顯示,奧利司他組、低劑量、中劑量和高劑量荷葉水提物組脂肪組織leptin的mRNA的表達(dá)均顯著下降(P<0.01)。中劑量組leptin的mRNA的表達(dá)低于奧利司他組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

免疫組化結(jié)果顯示，奧利司他組、低劑量組、中劑量組和高劑量組荷葉水提物下丘腦組織leptin表達(dá)均下調(diào)(圖2)。

Tab. 2 Changes of rat weight after treated with water extract of lotus leaves(g, ±s)

Con： Blank group； M： Model group； Orl： Orlistat group； LLL： Low-concentration group of lotus leaves； LLM： Medium- concentration group of lotus leaves ； LLH： High-concentration group of lotus leaves

*P<0.05,**P<0.01vsCon group；#P<0.05,##P<0.01vsM group

Tab. 3 Changes of rat blood lipids after treated with water extract of lotus leaves(g, ±s)

Con: Blank group; M: Model group; Orl: Orlistat group; LLL: Low-concentration group of lotus leaves; LLM： Medium-concentration group of lotus leaves; LLH: High-concentration group of lotus leaves; TC: Total cholestrol; TG: Triglyceride; HDL: High density lipoprotein; LDL: Low density lipoprotein

*P<0.05,**P<0.01vsCon group;#P<0.05,##P<0.01vsM group

2.4荷葉水提物對實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠PPAR-γ表達(dá)影響

RT-PCR結(jié)果顯示,奧利司他組和中劑量組脂肪組織PPAR-γ的mRNA的表達(dá)均下調(diào)(P<0.05,圖3)。

免疫組化結(jié)果顯示，PPAR-γ主要在脂肪組織細(xì)胞核和細(xì)胞膜表達(dá)，且在各組中均有表達(dá)，其中模型組較空白組表達(dá)上調(diào)，而奧利司他組、中劑量組表達(dá)均下調(diào)(圖2)。

3 討論

脂肪被脂肪酶水解為游離脂肪酸(FFA)及甘油并釋放入血液，繼續(xù)被其他組織氧化利用，該過程稱為脂肪動員。在禁食、饑餓等狀態(tài)下，腎上腺素、去甲腎上腺素等分泌增加，激活脂肪酶，促進(jìn)脂肪動員。β3腎上腺素受體主要分布于脂肪組織中, β3腎上腺素特異性的激活導(dǎo)致FFA快速大量的釋放，對脂肪組織形態(tài)和代謝有很大的影響，從而促進(jìn)脂肪動員，起到減肥的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)荷葉水提物與腎上腺素相似可促進(jìn)離體脂肪組織釋放FFA，從而可促進(jìn)脂肪動員，可能具有一定的減肥降脂作用。

Con： Blank group； M： Model group； Orl： Orlistat group； LLL: Low-concentration group of lotus leaves; LLM： Medium-concentration group of lotus leaves; LLH: High-concentration group of lotus leaves

**P<0.01vsCon group；##P<0.001vsM group；△P<0.05vsOrli group

本研究通過給實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠灌服荷葉水提物4周，肥胖大鼠的血脂水平和體重均有顯著下降，說明荷葉水提物具有減肥的作用。

瘦素(leptin)主要由脂肪細(xì)胞分泌,同時胎盤、下丘腦和胃也可分泌瘦素，瘦素不僅在調(diào)節(jié)機(jī)體攝食和能量代謝中發(fā)揮重要作用，在神經(jīng)內(nèi)分泌、血管新生、生殖、免疫調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復(fù)、糖尿病、心血管疾病和缺血再灌注損傷等方面也發(fā)揮著重要的作用[7]。陳愉等人研究表明，leptin表達(dá)水平可以作為實(shí)驗(yàn)研究中衡量大鼠肥胖程度的一種比較穩(wěn)定可靠的指標(biāo)[8]。因此，leptin在脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平可作為衡量大鼠體內(nèi)脂肪組織含量的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,中、高劑量荷葉水提物均可使脂肪細(xì)胞leptin蛋白表達(dá)下調(diào)和leptin的mRNA水平下降，證明灌服荷葉后肥胖大鼠體內(nèi)脂肪組織減少。

Fig.2Expression levels of leptin in hypothalamus and PPAR-γ in adipose tissue(n=3)

N: Negative group； Con： Blank group； M： Model group； Orl： Orlistat group； LLL: Low-concentration group of lotus leaves; LLM： Medium-concentration group of lotus leaves; LLH: High-concentration group of lotus leaves； PPAR-γ： Peroxisome pro liferator-activated receptor gamma

Con： Blank group； M： Model group； Orl： Orlistat group； LLL: Low-concentration group of lotus leaves; LLM： Medium-concentration group of lotus leaves; LLH: High-concentration group of lotus leaves

**P<0.001vsCon group；##P<0.001vsM group;△P<0.05vsOrl group

肥胖主要是由于脂肪堆積，白色脂肪形成受多種因素調(diào)控，其中與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)和轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α(C/EBPα)關(guān)系最為密切[9]。PPAR-γ在脂肪組織中大量表達(dá)，PPAR-γ在脂肪細(xì)胞分化、成熟以及對胰島素的敏感性功能中起到關(guān)鍵作用, 其表達(dá)與脂肪細(xì)胞調(diào)節(jié)能量代謝和能量平衡有關(guān)。脂肪細(xì)胞中PPAR-γ被激活后,可誘導(dǎo)大脂肪細(xì)胞凋亡，皮下脂肪內(nèi)的前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞，小脂肪細(xì)胞數(shù)目增加,同時可使脂質(zhì)合成及甘油三酯沉積有關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)脂肪堆積，導(dǎo)致肥胖，起到影響大鼠脂代謝的功能。當(dāng)機(jī)體處于饑餓狀態(tài)時，腺苷酸環(huán)化酶(AMPK)被激活，AMPK調(diào)節(jié)葡萄糖吸收和脂肪酸代謝,以及合成和氧化脂肪酸、膽固醇、糖原和蛋白質(zhì)。激活A(yù)MPK減少脂肪合成主要通過磷酸化PPAR-γ和下調(diào)PPAR-γ的mRNA表達(dá)來完成。在體內(nèi)PPAR-γ被內(nèi)源性或外源性配體激活，例如前列腺素和羅格列酮，從而促進(jìn)脂聯(lián)素的表達(dá)和改善胰島素抵抗，因此在臨床上廣泛用于糖尿病的治療。然而這也增加了患者肥胖、心血管疾病、水腫和骨質(zhì)疏松的風(fēng)險[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中劑量荷葉水提物可使實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠脂肪組織PPAR-γ的表達(dá)下調(diào)和PPAR-γ的mRNA水平下降。

綜述所述，荷葉具有降脂減肥的功效。其作用機(jī)制可能與其作用于腎上腺素受體和PPAR-γ以及調(diào)節(jié)瘦素表達(dá)有關(guān)。

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Effectsandmechanismsoflotusleafwaterextractonlipidmetabolism
ofadultexperimentalobesityrats

LI Mao-mao1, HUANG Xin-yuan1, LIANG Qiang-kun2, LI Yun-xia2, YAN Yuan2, TIAN Zhi-feng3,QIU Xiao-qing3, ZHANG Xiao-wen4, SONG Qing4, LI Hong-fang2,5△

(1. The First Clinical Medical College of Lanzhou University, 2. Departmemt of Physiology, College of Basic Medicine,3. Functional Laboratory of Medicine, Lanzhou 730000; 4. Guangzhou Institute of Sports Science, Guangzhou 510000;5. Key Laboratory of Preclinical Study for New Traditional Chinese Medicine of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

Objective: To investigate the lipid metabolic effect and mechanism of water extract of lotus leaves(Traditional Chinese Medicine).MethodsIsolated SD rat lipid tissues were suspended in organ baths containing Krebs solution, and the effect of lotus leaf water extract on free fatty acids (FFA) release was observed; The experimental obesity rat model was established by feeding them high glucose and fat diets, then the changes of body weight and blood lipid were measured in the model rats after intragastric administration with water extract of lotus leaves for four weeks, and the expressions of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ) and leptin were examined by RT-PCR and immunohistochemical.ResultsThe ex vivo experiment showed that water extract of lotus leaves effectively promoted the FFA release from isolated lipid tissues. In vivo experiment, similarly to Orlistat, water extract of lotus leaves(60 mg/kg)markedly decreased the body weight and blood lipid of experimental obesity rats(P<0.05), and obviously reduced the expressions of PPAR-γ and leptin(P<0.05).ConclusionWater extract of lotus leaves greatly improves the expression of PPAR-γ and leptin, which can promote the lipid mobilization and dissolution, reduce the body weight and blood lipid of adult rats with experimental obesity, therefore is expected to be developed into lipid-lowering diet pills.

water extract of the lotus leaf; rats; obesity; PPAR-γ; leptin

R335

A

1000-6834(2017)05-476-05

10.12047/j.cjap.5409.2017.114

教育部大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(2014)；甘肅省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目(GZK-2015-23)；廣州市體育科學(xué)研究合作項(xiàng)目(2013)

2016-01-08

2017-07-12

△

Tel： 0931-8915092； E-mail: lihf@lzu.edu.cn