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    TGF-β參與細(xì)胞內(nèi)鈣池操縱性Ca2+內(nèi)流調(diào)節(jié)FGF23的釋放

    2017-10-31 06:17:12張冰冰楊威徐闖夏成張洪友王春仁余麗蕓
    關(guān)鍵詞:成骨細(xì)胞抑制劑組間

    張冰冰 ,楊威 ,徐闖 ,夏成 ,張洪友 ,王春仁 ,,余麗蕓

    TGF-β參與細(xì)胞內(nèi)鈣池操縱性Ca2+內(nèi)流調(diào)節(jié)FGF23的釋放

    張冰冰1,楊威2,徐闖2,夏成2,張洪友2,王春仁1,2,余麗蕓1

    (1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,大慶 163319;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院)

    為了研究TGF-β是否通過細(xì)胞內(nèi)鈣池操縱性Ca2+內(nèi)流來調(diào)節(jié)FGF23的釋放,通過TGF-β處理大鼠骨肉瘤細(xì)胞利用熒光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)FGF23和Orai1基因的表達。結(jié)果表明,與正常對照組細(xì)胞比較,TGF-β處理組FGF23與Orai1的基因表達水平顯著升高,并且Orai1和NF-κB的抑制劑能夠拮抗TGF-β的作用。表明TGF-β通過NF-κB/Orai1調(diào)節(jié)FGF23的釋放,為進一步治療慢性腎病等疾病提供依據(jù)。

    TGF-β;成纖維生長因子23;細(xì)胞內(nèi)鈣池操縱性Ca2+內(nèi)流

    成纖維生長因子23(fibroblast growth factor,F(xiàn)GF23)主要在骨組織中表達,尤其在成骨細(xì)胞中大量分泌[1]。FGF23是調(diào)節(jié)機體鈣磷代謝的核心激素之一[2],也是調(diào)控 1,25(OH)2D3形成的重要調(diào)節(jié)子,F(xiàn)GF23可分別通過抑制腎 1 α羥化酶和上調(diào)Cyp24a1 來減少 1,25(OH)2D3的形成[3],進而降低血液中 1,25(OH)2D3的含量[4-6]。 此外,F(xiàn)GF23 通過抑制腎小管對磷的重吸收,促進腎磷酸鹽的排出[4]。FGF23 缺失導(dǎo)致血液中鈣、磷和 1,25(OH)2D3的水平大幅升高,導(dǎo)致機體急速衰老,生命周期銳減,而上述現(xiàn)象很可能是由于血管鈣化引起[3]。有文獻報道NF-κB可激發(fā)UMR106細(xì)胞內(nèi)的Ca2+活性進而調(diào)節(jié)FGF23的釋放[7]。在UMR106細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的改變主要是由Ca2+池操縱性Ca2+內(nèi)流(store-operated Ca2+entry,SOCE) 來實現(xiàn)的,而膜蛋白Orai1則是SOCE的主要調(diào)控蛋白[8]。近年來有文獻報道TGF-β對成骨細(xì)胞的分化以及骨基質(zhì)特性有重要作用[9],而且TGF-β也是重要的NF-κB調(diào)節(jié)子[10]。因此,該實驗利用UMR106細(xì)胞,探究TGF-β是否介導(dǎo)NF-κB激發(fā)Orai1信號通路來調(diào)控FGF23的釋放。

    1 材料和方法

    1.1 主要試劑

    Trizol,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,SYBG real-time PCR kit均購自Inventrogen公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    大鼠骨肉瘤UMR106細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FCS的高糖DMEM培養(yǎng)基中。UMR106細(xì)胞經(jīng)1,25(OH)2D3(100 nM)預(yù)處理24 h促進FGF23的表達,之后分別添加終濃度20 ng·mL-1的TGF-β到含有或不含有Orai1抑制劑YM58483(100 nM)和NFκB的抑制劑Wogonin(100 μM)細(xì)胞培養(yǎng)基中繼續(xù)處理24 h。

    1.2.2 熒光定量RT-PCR

    細(xì)胞總RNA的提取按Trizol試劑說明書進行操作,測定mRNA濃度,取1 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA,QRT-PCR運用SYBG染料法檢測 FGF23,Orai1,NFκB65 的 mRNA 的表達水平[11]。根據(jù)GenBank中FGF23,Orai1,NFκB65和TBP mRNA序列,利用Primer5軟件設(shè)計引物。QRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)如下:SYBG10 μL,ddH2O 7 mL,上游引物(10 μM·L-1)、下游引物(10 μM·L-1)各 1 μL;cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件均為:95℃預(yù)變性3 min,95℃10 sec and 58℃30 sec,共計40個循環(huán)。

    Rat Tbp(TATA box-binding protein):

    forward(5'-3'):ACTCCTGCCACACCAGCC

    reverse(5'-3'):GGTCAAGTTTACAGCCAAGATTCA

    Rat Fgf23

    forward(5'-3'):TGGCCATGTAGACGGAACAC

    reverse(5'-3'):GGCCCCTATTATCACTACGGAG

    Rat Orai1

    forward(5'-3'):CGTCCACAACCTCAACTCC

    reverse(5'-3'):AACTGTCGGTCCGTCTTAT

    Rat NFκB p65

    forward(5'-3'):TTCCCTGAAGTGGAGCTAGGA

    reverse(5'-3'):CAGTCGAGGAAGACACTGGA

    1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用Spass19.0統(tǒng)計學(xué)軟件,分別運用t-test和ANOVA檢測方法對NFκB p65和FGF23、Orai1的轉(zhuǎn)錄水平進行顯著性分析,結(jié)果以means±SEM表示,P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TGF-β對NFκB p65轉(zhuǎn)錄水平的影響

    如圖1所示,與正常對照組相比,經(jīng)20 ng·mL-1TGF-β刺激UMR106細(xì)胞的 NFκB p65的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。

    圖1 TGF-β對NFκB p65轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.1 Effect of TGF-β on NFκB p65 transcript levels注:*,TGF-β處理組與正常對照組差異顯著

    2.2 TGF-β對Orai1轉(zhuǎn)錄水平的影響

    如圖2、圖3所示,與正常對照組相比,在20ng·mL-1TGF-β刺激下,UMR106細(xì)胞Orai1的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。分別添加Orai1抑制劑YM58483(圖2)和NFκB 的抑制劑 Wogonin(圖 3)后,TGF-β 刺激組的Orai1轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低。此外,分別添加的抑制劑YM58483和Wogonin與正常對照組相比,Orai1轉(zhuǎn)錄水平也顯著降低。

    圖2 添加Orai1抑制劑YM58483,TGF-β對Orai1轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.2 Effect of TGF-β on Orai1 transcript levels in the absence or presence of YM58483注:*,TGF-β處理組與正常對照組差異顯著#,添加YM 8483組與未添加組間差異顯著

    圖3 添加NFκB抑制劑Wogonin,TGF-β對Orai1轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.3 Effect of TGF-β on Orai1 transcript levels in the absence or presence of wogonin注:*,正常對照組與TGF-β處理組差異顯著#,添加Wogonin組與未添加組間差異顯著

    2.3 TGF-β對FGF23轉(zhuǎn)錄水平的影響

    如圖4、圖5所示,與正常對照組相比,在20 ng·mL-1TGF-β刺激下UMR106細(xì)胞FGF23的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,并且分別添加Orai1抑制劑YM58483(圖4)和 NFκB的抑制劑 Wogonin(圖 5)后,TGF-β 刺激組的FGF23的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。

    圖4 添加Orai1抑制劑YM58483,TGF-β對FGF23轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.4 Effect of TGF-β on FGF23 transcript levels in the absence or presence of YM58483注:*,TGF-β處理組與正常對照組差異顯著#,添加YM 8483組與未添加組間差異顯著

    圖5 添加NFκB抑制劑Wogonin,TGF-β對FGF23轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 Effect of TGF-β on FGF23 transcript levels in the absence or presence of wogonin注:*,正常對照組與TGF-β處理組差異顯著#,添加Wogonin組與未添加組間差異顯著

    3 討論

    FGF23是由骨組織中的成骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生的內(nèi)分泌因子,主要作用于腎組織,通過抑制腎1α羥化酶和尿磷重吸收等來調(diào)節(jié)1,25(OH)2D3的形成與活性,以及鈣磷代謝等生理作用。在慢性腎病與心損傷疾病中,F(xiàn)GF23的水平顯著升高,并且與這些病的預(yù)后不良有著直接關(guān)系[12-13]。因此,探究FGF23的生理病理機制對疾病的防治至關(guān)重要。

    根據(jù)實驗室前期研究,F(xiàn)GF23的釋放是由SOCE引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高來調(diào)節(jié)的。膜蛋白O-rai1組成了鈣釋放激活鈣通道(CRAC)的離子通道,與其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的感受器STIM1相互作用,完成細(xì)胞鈣池內(nèi)鈣離子的釋放與進入,且Orai1在UMR106細(xì)胞內(nèi)表達量相對較高,而轉(zhuǎn)錄因子 NFκB則是調(diào)節(jié)Orai1的主要信號,進而影響FGF23的釋放[7]。已有文獻報道,TGF-β可上調(diào)NFκB水平進而引發(fā)炎癥反應(yīng)[10,14]。實驗利用熒光定量RT-PCR技術(shù),首先驗證了TGF-β上調(diào)UMR106細(xì)胞的NFκB水平,通過分別添加 Orai1抑制劑YM58483和NFκB的抑制劑Wogonin,分析TGF-β對Orai1和FGF23轉(zhuǎn)錄水平的影響,最終確證了TGF-β通過介導(dǎo)NFκB上調(diào)Orai1的轉(zhuǎn)錄水平進而調(diào)控FGF23釋放這一新的信號通路。Orai1不僅是調(diào)控SOCE過程中Ca2+進入,而且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖遷移等作用,TGF-β作為NFκB的激活劑,可能通過NFκB激活Orai1信號通路啟動成骨細(xì)胞的增殖,分化等促進FGF23的釋放,從而在腎臟中發(fā)揮生理病理作用,隨著血清中FGF23含量的顯著升高加劇慢性腎病的病程發(fā)展,因此降低成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子的上述信號通路可調(diào)控FGF23的形成,為進一步治療慢性腎病等疾病提供有利證據(jù)。

    4 結(jié)論

    TGF-β可通過NFκB依賴的上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+進入的調(diào)控膜蛋白Orai1調(diào)控FGF23在成骨細(xì)胞中的分泌,為進一步探究FGF23在慢性腎臟疾病中病理作用提供有力的研究基礎(chǔ)。

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    TGF-β-sensitive Store-operated Ca2+Entry in the Regulation of FGF23 Release

    Zhang Bingbing1,Yang Wei2,Xu Chuang2,Xia Cheng2,Zhang Hongyou2,Wang Chunren1,2,Yu Liyun1
    (1.College of Life Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319;2.College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University)

    To study whether the effect of TGF-β on FGF23 mRNA expression was involved and required Ca2+entry,F(xiàn)GF23 and Orai1 mRNA were measured by real-time RT-PCR in UMR106 cells.The results showed that FGF23 mRNA expression was significantly enhanced by TGF-β treat in UMR106;conversely,an effect was abolished by Orai1 inhibitor YM58483 and NF-κB inhibitor Wogonin.Moreover,Orai1 transcript levels were significantly up-regulated by TGF-β,an effect attenuated by wogonin.It indicated TGF-β up-regulates FGF23 was released by NF-κB dependent up-regulation of Orai1 transcription,which may give strategies for new therapeutic options.

    TGF-β;FGF23;store-operated Ca2+entry

    Q25

    A

    1002-2090(2017)05-0066-03

    10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.016

    2017-03-06

    國家自然科學(xué)基金青年項目(31502133);黑龍江省科學(xué)基金面上項目(C2015043)。

    張冰冰(1984-),女,講師,德國圖賓根大學(xué)畢業(yè),現(xiàn)主要從事遺傳與基因工程方面的教學(xué)與研究。

    余麗蕓,女,教授,博士研究生導(dǎo)師,E-mail:yuliyun1227@126.com。

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