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    不同試驗(yàn)因素對口蹄疫病毒TCID50的影響

    2017-10-30 17:53:40郝志怡
    湖北畜牧獸醫(yī) 2017年10期
    關(guān)鍵詞:口蹄疫細(xì)胞

    郝志怡

    摘要:試驗(yàn)用單層法和同步法2種方法,用不同細(xì)胞密度及稀釋體系對同種口蹄疫病毒的毒價(jià)進(jìn)行了測定。結(jié)果表明,細(xì)胞密度對口蹄疫病毒毒價(jià)的測定沒有直接影響,而病毒稀釋體系越大,結(jié)果越穩(wěn)定,測得的毒價(jià)越高,且纖維細(xì)胞較倉鼠腎細(xì)胞對口蹄疫病毒更為敏感。

    關(guān)鍵詞:口蹄疫;細(xì)胞;病毒毒價(jià);滴定

    中圖分類號(hào):S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B 文章編號(hào):1007-273X(2017)010-0009-02

    口蹄疫病毒屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬,是RNA病毒中最小的一個(gè),也是最早能在組織上培養(yǎng)的病毒之一。與其他小RNA病毒相似,口蹄疫病毒在感染4~6 h后,形成的感染性病毒粒子會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞病變。在體外試驗(yàn)中,通過細(xì)胞培養(yǎng)和接種殺細(xì)胞性病毒,一段時(shí)間后用顯微鏡可觀察到細(xì)胞變圓,壞死,從瓶壁脫落等現(xiàn)象,稱之細(xì)胞病變作用。利用此種病變效應(yīng)可進(jìn)行病毒定量。

    目前,一般用滴定法測定口蹄疫滅活疫苗的毒價(jià)。在檢驗(yàn)疫苗效力時(shí),常用細(xì)胞微量中和試驗(yàn)來檢測免疫動(dòng)物體內(nèi)抗體效價(jià)的高低,從而判定疫苗效果。其中,病毒毒價(jià)的準(zhǔn)確性是中和試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。本試驗(yàn)用2種不同方法對TCID50滴定試驗(yàn)中細(xì)胞密度、病毒稀釋體系2種因素進(jìn)行研究,進(jìn)一步確認(rèn)這些因素對口蹄疫病毒TCID50的測定是否有影響,以獲得準(zhǔn)確、穩(wěn)定的口蹄疫病毒毒價(jià)測定方法,為今后的試驗(yàn)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    DMEM培養(yǎng)基,pH 7.2的PBS緩沖液,0.25%胰酶-EDTA,小牛血清,滴定用口蹄疫病毒。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出含BHK-21細(xì)胞(倉鼠腎細(xì)胞)或纖維細(xì)胞的冷凍管,37 ℃水浴1 min使其完全融化,取出細(xì)胞;將細(xì)胞接種到110 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加適量培養(yǎng)液及小牛血清,接種濃度1×109個(gè)/L,置37 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng),次日更換培養(yǎng)液,觀察生長情況。48 h后棄除舊培養(yǎng)液,用PBS緩沖液沖洗2遍,加入2 mL胰酶消化液消化2 min左右,可看到細(xì)胞像沙子一樣脫落,加10 mL含 6%的小牛血清培養(yǎng)液終止消化,用吸管吹吸細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,再加適量含 6%的小牛血清培養(yǎng)液,調(diào)整細(xì)胞濃度,繼續(xù)培養(yǎng),連續(xù)傳代。

    1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 取0.1 mL細(xì)胞懸液,加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板的蓋玻片下,顯微鏡下40倍觀察計(jì)數(shù)。當(dāng)活細(xì)胞數(shù)大于95%,用含6%牛血清DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成所需濃度。

    1.2.3 單層法

    (1)取生長良好的細(xì)胞,依細(xì)胞傳代方法,制備細(xì)胞懸浮液,用6%的DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度,以1.5×105個(gè)/mL和3.2×105個(gè)/mL加入到96 孔微量培養(yǎng)板。每孔100 μL(1.5×104個(gè)/孔、3.2×104個(gè)/孔)。

    (2)將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱,溫度(36±2) ℃, 培養(yǎng)18~24 h。經(jīng)過24 h后有70%~90%細(xì)胞融合,進(jìn)行單層滴定。

    (3)取出樣品和滴定用口蹄疫病毒,完全解凍后,振蕩樣品2~5 s,用移液器吸取0.2 mL或0.5 mL樣品到第一只試管中,振蕩后轉(zhuǎn)移0.2 mL或0.5 mL到下一管中,以此類推,直到最后一個(gè)稀釋度。

    (4)取出96孔板細(xì)胞,標(biāo)記樣品批號(hào)和稀釋度,棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液。由最稀到最濃的稀釋度順序接種,每個(gè)稀釋度接種8孔,每孔100 μL,每個(gè)稀釋度需更換槍頭。將96孔板放入(36±2) ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~6 d,直到最后判定結(jié)果。

    1.2.4 同步法 方法同“1.2.3”,區(qū)別是將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱,溫度(36±2) ℃, 靜置30~60 min,待細(xì)胞沉降吸附在細(xì)胞板上后進(jìn)行同步滴定。

    2 結(jié)果與分析

    單層法(纖維細(xì)胞)試驗(yàn)中當(dāng)細(xì)胞密度為3.2×105個(gè)/mL時(shí),病毒稀釋體系5.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價(jià)為106.375TCID50/mL;病毒稀釋體系2.0 mL時(shí)測得的口蹄疫病毒毒價(jià)為105.375TCID50/mL。當(dāng)細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL時(shí),病毒稀釋體系5.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價(jià)為106.375TCID50/mL;病毒稀釋體系2.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價(jià)為105.5TCID50/mL。

    同步法(倉鼠腎細(xì)胞)試驗(yàn)中當(dāng)細(xì)胞密度為3.2×105個(gè)/mL時(shí),病毒稀釋體系5.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價(jià)為105.625TCID50/mL;病毒稀釋體系2.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價(jià)為104.875TCID50/mL。當(dāng)細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL時(shí),病毒稀釋體系5.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價(jià)為105.25TCID50/mL;病毒稀釋體系2.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價(jià)為104.875TCID50/mL。

    3 討論

    試驗(yàn)中常用平行試驗(yàn)來減少誤差,保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性,不同細(xì)胞對口蹄疫病毒的吸附能力不同,而病毒稀釋體系的大小也會(huì)影響測定結(jié)果。本試驗(yàn)用單層法和同步法2種方法,通過用不同細(xì)胞密度及稀釋體系對同種口蹄疫病毒的毒價(jià)進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,細(xì)胞密度對口蹄疫病毒毒價(jià)的測定沒有直接影響,而病毒稀釋體系越大,結(jié)果越穩(wěn)定,測得的毒價(jià)越高,且纖維細(xì)胞較倉鼠腎細(xì)胞對口蹄疫病毒更為敏感。這一結(jié)果為以后的中和試驗(yàn)提供了依據(jù),也為測定口蹄疫疫苗抗體效價(jià)奠定了基礎(chǔ)。endprint

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