生物可降解聚對二氧環(huán)己酮材料中單體殘留的測定*

朱愛臣，馬麗霞，楊清華，劉陽，王傳棟，李俊起

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省醫(yī)用高分子材料重點實驗室，濟南250101）

1 引 言

聚對二氧環(huán)己酮（PPDO）是一種線性的生物可降解的脂肪族聚酯-醚，其分子主鏈中含有可水解的酯鍵和獨特的醚鍵，賦予了聚合物材料良好的可生物降解性、生物相容性及機械性能（即優(yōu)異的力學(xué)強度和韌性），是一種理想的生物可降解醫(yī)用材料［1-3］。PPDO可用于手術(shù)縫合線、骨科固定材料、細(xì)胞支架和藥物載體、組織修復(fù)材料等［4-8］。PPDO作為研究血管內(nèi)支架的新材料，已獲得FDA的認(rèn)證，經(jīng)批準(zhǔn)可以使用于人體，其醫(yī)用性能也已得到證實［9-10］。PPDO作為骨科固定材料，在體內(nèi)的降解過程不需要特殊酶的參與，代謝的產(chǎn)物經(jīng)過三羧酸循環(huán)后再通過呼吸道、糞便和尿液等排出體外［11-12］。

PPDO的合成多以對二氧環(huán)己酮（PDO）為原料通過開環(huán)聚合制得［13-15］，樣品可能殘留有未反應(yīng)完全的PDO單體，PDO單體雖沒有毒性，但殘留在PPDO制品中會影響PPDO的緩釋效果和機械性能。本研究以PPDO為原料，通過注射成型，加工成有一定承重作用的制品。為保障制品的機械性能，參照YY/T 0661-2008［16］標(biāo)準(zhǔn)中需要注射成型或承重的聚合物，單體殘留量不大于0.1%的要求，建立氣相色譜法，對PPDO原料進(jìn)行PDO單體殘留量的質(zhì)控檢測。目前尚未見PPDO中PDO單體殘留測試方法及殘留限度的報道。

2 儀器與試劑

Agilent 6890N型氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器（FID），美國安捷倫公司；BS210S型電子分析天平，d＝0.1 mg，德國 Sartorius公司；Spectrafuge 6c型離心機，美國Labnet公司；KQ5200B型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州博遠(yuǎn)實驗分析儀器廠。

對二氧環(huán)己酮（PDO），純度大于99%，批號201601001，惠州華陽醫(yī)療器械有限公司；聚對二氧環(huán)己酮（PPDO），A公司，批號 D160500015；聚對二氧環(huán)己酮（PPDO），B公司，批號 D4-32；二甲基甲酰胺（DMF），色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇，色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO），色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

3 方法與結(jié)果

3.1 溶液的制備

3.1.1 對照品貯備液制備 取PDO約10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用DMF溶解并定容，作為對照品貯備液。

3.1.2 對照品溶液制備 取貯備液1 mL，置10 mL容量瓶中，用DMF稀釋并定容，作為對照品溶液。

3.1.3 線性溶液 分別取對照品貯備液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL，置 10 mL容量瓶中，用 DMF稀釋并定容，作為線性溶液。

3.1.4 供試品溶液 取供試品PPDO約0.1 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加DMF適量使之溶解后，緩慢滴加甲醇，振搖，定容；取適量于離心管中，3 000 rpm離心30 min，取上清液作為供試品溶液。

3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

3.2.1 色譜條件 采用DB-624毛細(xì)管色譜柱（30.0 m×535μm×3.00μm），程序升溫（146℃保持5 min，30℃/min升溫至200℃，保持2 min），進(jìn)樣口溫度240℃，檢測器溫度250℃，分流比5：1，流速3.0 mL/min，進(jìn)樣量2μL。

3.2.2 不同色譜柱的選擇 分別以GS-TEK GsBP-5（30.0 m×320μm×0.25μm）毛細(xì)管色譜柱和Agilent DB-624（30.0 m×535μm×3.0μm）毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行試驗。采用GS-TEK GsBP-5毛細(xì)管色譜柱，單體峰對稱性差；采用Agilent DB-624毛細(xì)管色譜柱，對單體有較高的響應(yīng)值，且對稱性較好，理論塔板數(shù)和分離度均符合要求。因此，本研究選用Agilent DB-624毛細(xì)管色譜柱。

3.2.3 溶劑的選擇 PPDO在二甲基亞砜（DMSO），二甲基甲酰胺（DMF）和六氟異丙醇中均可溶解，但由于六氟異丙醇溶劑中氟的存在可能對色譜柱有一定的損傷，所以不予采用；DMSO中的雜峰對單體PDO的檢測有干擾，也不予采用；本研究選用DMF作為溶劑，不干擾單體的測定。

同時，我們對DMF的用量進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以溶液總體積10 mL為例，加DMF 2 mL時，PPDO不能完全溶解，加4 mL和6 mL DMF則可使PPDO完全溶解，但DMF用量6 mL時，甲醇量（約4 mL）又不足以將PPDO完全沉淀，故本實驗選用DMF加入量為4 mL，DMF與甲醇體積比為2∶3。

3.2.4 系統(tǒng)適用性考察 取對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣，并記錄色譜圖，PDO單體的保留時間為6.53，理論塔板數(shù)為80414，與聚合物中其他雜質(zhì)（PDO的低聚物）峰的分離度為2.399。

3.3 方法學(xué)研究

3.3.1 專屬性 分別精密量取空白溶劑a（DMF），空白混合溶劑b（甲醇和DMF的體積比為3∶2）和PDO對照品溶液c，各2μL。按“3.2.1”項下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖（見圖1）。從圖1中可看出，各溶劑對PDO單體的測定無干擾，專屬性良好。

圖1 空白溶劑DMF（a），DMF和甲醇的空白混合溶劑 （b）和PDO對照品溶液 （c）的GC色譜圖1.DMF，2.甲醇，3.PDOFig 1 GC chromatograms of blank solvent（a），blank mixed solvent（b）and the standard solution of PDO（c）

3.3.2 線性范圍 取 “3.1.3”項下的線性系列溶液按“3.2.1”項下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積。以單體濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作線性回歸。其結(jié)果見圖2，得回歸方程為：Y＝-0.62964＋1898.11848X，R＝0.9996。結(jié)果表明，PDO單體濃度在0.0239～0.1794 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 PDO的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 The standard carve of PDO

3.3.3 定量限與檢測限 取最低濃度線性溶液，加DMF逐級稀釋成一定濃度的溶液，按“3.2.1”項下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以信噪比為10∶1時作為PDO的定量限，以信噪比為3∶1時作為PDO的檢測限。測試結(jié)果顯示，PDO的檢測限濃度為0.2μg/mL，定量限濃度為0.5μg/mL。

3.3.4 精密度 精密吸取對照品溶液2μL，按“3.2.1”項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖及峰面積。計算PDO峰面積的RSD值為1.62%。

3.3.5 重復(fù)性 取同一批次樣品，平行配制6份樣品溶液，按“3.2.1”項下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積。計算PDO殘留量的平均值為0.12%，RSD值為2.16%。

3.3.6 溶液穩(wěn)定性考察 精密吸取對照品溶液，按“3.2.1”項下的色譜條件，于 0、2、5、8、12 h分別進(jìn)樣。計算PDO峰面積的RSD值為2.33%。說明對照品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.3.7 回收率 按“3.1.2”項下方法制備對照品溶液。

精密稱取 A公司的樣品 PPDO（批號為D160500015）約0.1 g，共9份，分別置于10 mL容量瓶中，分別精密加入PDO對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，每個濃度3份，各加DMF 4 mL使其溶解，然后緩慢滴加甲醇，振搖，使PPDO完全沉淀，定容，取適量于離心管中，3 000 rpm離心30 min，取上清液作為供試品溶液。

精密量取對照品溶液及供試品溶液2μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，計算PDO的回收率，結(jié)果見表1。

表1 PDO加樣回收率計算結(jié)果Table 1 Results of recovery test of PDO

3.3.8 樣品測定 分別準(zhǔn)確稱取A公司和B公司的PPDO樣品，按“3.1.2”項下方法制備對照品溶液，按“3.1.4”項下的方法制備供試品溶液，按“3.2.1”項下的色譜條件分別進(jìn)樣，并記錄色譜圖及峰面積，以外標(biāo)法計算PDO單體含量。測得A公司、B公司PPDO樣品中PDO單體含量分別為0.12%、0.05%。

4 討論

PPDO具有良好的生物相容性和生物可吸收性，并且分子鏈中含有獨特的醚鍵，使其具有良好的柔韌性，是醫(yī)療器械產(chǎn)品加工的首選生物可降解材料。合成PPDO的條件相對比較苛刻，目前國內(nèi)還沒有商業(yè)化的PPDO材料，國內(nèi)使用的PPDO材料都是購買國外進(jìn)口的原料。如果能批量生產(chǎn)合成PPDO，將對醫(yī)療器械的開發(fā)帶來很大的方便，而不管是合成PPDO還是利用PPDO加工醫(yī)療器械產(chǎn)品，都需要對原料進(jìn)行控制，而單體殘留量是一個關(guān)鍵的指標(biāo)，不僅影響醫(yī)療器械產(chǎn)品的力學(xué)性能，還會影響其體內(nèi)降解性能。

PPDO材料中殘留的PDO單體，有可能是合成原料時沒反應(yīng)的殘留單體，也有可能是加工過程或儲存過程中PPDO降解產(chǎn)生的單體殘留。因為PPDO的合成是PDO開環(huán)聚合，而PDO的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，在高溫下合成反應(yīng)是一個平衡可逆反應(yīng)，所以不可避免的會殘留PDO單體，需要后處理盡可能的降低單體殘留率；同時，PPDO是可降解的材料，在加工或儲存過程中也不可避免的會有單體殘留。所以不管是加工前還是加工后對產(chǎn)品都需要檢測PDO單體的殘留量。而目前尚無PDO單體殘留量檢測方法的報道，本研究中通過氣相色譜法建立了PPDO材料中單體PDO的測量方法。

本研究在建立PPDO材料中單體PDO的測量方法學(xué)的過程中，首先對色譜柱進(jìn)行了篩選，PDO屬于中極性成分，根據(jù)相似相容原理選擇中極性的色譜柱，通過色譜掃描發(fā)現(xiàn)非極性色譜柱GS-TEK GsBP-5的單體峰不尖銳，對稱性差，而中極性色譜柱Agilent DB-624單體響應(yīng)值高且對稱性好，所以選擇中極性色譜柱Agilent DB-624。其次是溶劑的選擇，根據(jù)PPDO和PDO單體的溶解特性，選擇DMF與甲醇的混合溶劑，除去聚合物溶液中的大分子，減少對氣相色譜儀中的襯管和色譜柱的污染，并且考慮溶劑對單體峰沒有影響。而DMF與甲醇的比例考慮既能完全溶解聚合物，又能將聚合物大分子沉淀完全，不影響測試，所以本研究選擇DMF與甲醇的溶劑體積比為2：3。最后是色譜條件的選擇，選擇程序升溫是考慮增加溶劑峰和單體峰的分離度，并且峰型對稱，無拖尾現(xiàn)象，通過多個溫度程序的摸索最后篩選實驗中程序升溫的色譜條件。色譜條件中的分流比、流速和進(jìn)樣量是根據(jù)單體峰的響應(yīng)值及出峰時間進(jìn)行多次摸索篩選的。

5 結(jié)論

本研究對生物可降解醫(yī)用材料PPDO中單體殘留的檢測方法進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，采用DB-624毛細(xì)管色譜柱，程序升溫，以DMF為溶劑，甲醇為沉淀劑，溶劑與沉淀劑的體積比為2：3對樣品進(jìn)行處理，測試PPDO原料中PDO單體的殘留，色譜系統(tǒng)的精密度和方法的重復(fù)性及專屬性良好，樣品回收率達(dá)100.3%，RSD值達(dá)1.39%。該方法簡單快捷，靈敏度高，可用于PPDO原料中單體PDO殘留的測定。