關(guān)于考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度實(shí)驗(yàn)的誤差分析與改進(jìn)

【摘要】本文對傳統(tǒng)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)濃度的方法存在的問題進(jìn)行了探討，并從減少實(shí)驗(yàn)誤差的前提下對實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn)，并使該實(shí)驗(yàn)成為設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)、操作簡便、數(shù)據(jù)可靠的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

【關(guān)鍵詞】蛋白質(zhì)濃度 比色法 考馬斯亮藍(lán)

【中圖分類號】G64 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-3089（2017）38-0248-01

考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度是生物化學(xué)中的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。

1.考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度實(shí)驗(yàn)的基本原理

考馬斯亮藍(lán)G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm處。當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，溶液變成藍(lán)色，其最大吸收峰變?yōu)?95nm，并且考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量分析的高靈敏度。

依據(jù)朗伯-比爾定律，在一定濃度范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，其關(guān)系式為：A=kbC復(fù)合物，式中，A為吸光度，k為摩爾吸光系數(shù)，b為吸收層厚度，C復(fù)合物為考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的濃度。

如下圖表格所示，取8支干凈試管，并編號0-7。其中0號試管作為空白對照；1-6號試管按下表配方依次添加各種試劑，包括不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液；7號試管裝有未知蛋白液樣品。按比例混勻后，室溫靜置3min，于波長595nm處測得8支試管的吸光度值。取0-6號試管的吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)蛋白液濃度（ug/ml）為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的摩爾吸光系數(shù)k=A/bC復(fù)合物；最后將7號試管中未知蛋白液的吸光度代入公式C復(fù)合物=A/kb，即得求得蛋白質(zhì)濃度。

2.實(shí)驗(yàn)中存在的問題

（1）該實(shí)驗(yàn)需要使用可見光分光光度計(jì)完成比色測定，學(xué)生初次使用可見光分光光度計(jì)進(jìn)行比色測定，操作技術(shù)和流程不夠熟悉，耗時(shí)較長，往往不易獲得好的數(shù)據(jù)。

（2）該實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑，例如：考馬斯亮藍(lán)溶液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白液、NaCl溶液等等，以及純水中存在著殘留蛋白質(zhì)，也會對實(shí)驗(yàn)造成干擾，影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果。

（3）該實(shí)驗(yàn)中，0號試管中沒有加入任何蛋白液，作為空白組，理論上吸光度值為零，而實(shí)際測量中，由于溶液中殘留的蛋白質(zhì)、吸收池以及儀器的系統(tǒng)誤差影響等，即使不加蛋白液，也存在著一定的可見光吸收，與朗伯-比爾定律計(jì)算公式A=kbC復(fù)合物的理論值不一致，從而造成標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制誤差。

（4）依據(jù)朗伯-比爾定律理論，溶液的濃度會導(dǎo)致定律發(fā)生偏離，即僅在一定濃度范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。

（5）在未知蛋白液的吸光度測量時(shí)，只有一個(gè)樣本，受系統(tǒng)誤差和人為誤差影響較大。

3.實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)及解決方法

（1）給可見光分光光度計(jì)配備多聯(lián)池（最好六個(gè)樣品池），待繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，僅需1次完成比色測定，大大提高檢測效率，并且6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液幾乎同時(shí)測定，可消除考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的凝集沉淀影響。

（2）該實(shí)驗(yàn)中所提到的試劑配制，例如：考馬斯亮藍(lán)溶液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白液、NaCl溶液等等，以及所用到的純水均采用重蒸水，可最大限度的降低殘留蛋白質(zhì)對本實(shí)驗(yàn)的干擾。

（3）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，以0號試管（不加入任何蛋白質(zhì)樣品）作參照，當(dāng)不加任何蛋白質(zhì)溶液時(shí)，手動設(shè)置吸光度值為零。在此基礎(chǔ)上，再測量標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（1-6號試管）和未知蛋白液的吸光度值，從而盡可能減少對標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的影響。

（4）在測定未知蛋白液的蛋白質(zhì)濃度時(shí)，可安排兩次完成。第一次測定時(shí)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知蛋白液中蛋白質(zhì)濃度的大致數(shù)值；第二次測定時(shí)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的良好線性范圍，對未知溶液作適當(dāng)?shù)南♂?，使之處于測量的最佳濃度范圍，從而獲得較為精確的數(shù)值。

（5）未知蛋白液準(zhǔn)備三份，分別測定，最后取平均值，以盡可能減小系統(tǒng)誤差和人為誤差。

作者簡介：

毛伍祥（1986-），男，博士，講師，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)。endprint