Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面法在食品專業(yè)綜合實驗教學(xué)中的應(yīng)用*

蔣 晗 趙 進 方結(jié)紅 黃光榮 李紅亮 潘家榮

（中國計量大學(xué)浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點實驗室，浙江杭州 310018）

·應(yīng)用研究·

Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面法在食品專業(yè)綜合實驗教學(xué)中的應(yīng)用*

蔣 晗**趙 進 方結(jié)紅 黃光榮 李紅亮 潘家榮

（中國計量大學(xué)浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點實驗室，浙江杭州 310018）

“食品專業(yè)綜合實驗”是學(xué)生在學(xué)習(xí)了食品學(xué)科基礎(chǔ)課程、專業(yè)基礎(chǔ)課程和專業(yè)課程，并具有了一定基礎(chǔ)理論體系和專業(yè)基本操作技能后進行的實踐性教學(xué)環(huán)節(jié)，是培養(yǎng)食品專業(yè)學(xué)生“試驗設(shè)計能力、操作能力、問題總結(jié)能力和協(xié)調(diào)交流能力”的一門專業(yè)綜合實驗課程，也是食品專業(yè)的必修課。

中國計量大學(xué)食品專業(yè)綜合實驗由學(xué)生自行組隊，每隊配備一名食品專業(yè)指導(dǎo)老師，開展時間為7周，考核形式由試驗報告、試驗表現(xiàn)和PPT展示3部分組成。它打破了傳統(tǒng)教學(xué)中試驗課程作為教學(xué)課程的補充與輔助模式，獨立成課，這在提高教學(xué)質(zhì)量，加強學(xué)生專業(yè)綜合能力和培養(yǎng)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)意識方面起到了不可替代的作用。選題由教師和學(xué)生雙向選擇，根據(jù)教師的研究方向以及學(xué)生的專業(yè)方向、未來發(fā)展方向和興趣點，共同探討試驗的選題和內(nèi)容，力求做到點面結(jié)合、基礎(chǔ)知識和專業(yè)知識有機結(jié)合，并能有效涵蓋學(xué)科的典型試驗操作與設(shè)計分析技能。

本文以食品專業(yè)綜合試驗課題“產(chǎn)乳酸菌細菌素基因工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化”為例，介紹了Plackett-Burman（P-B）設(shè)計和響應(yīng)面法在試驗設(shè)計和優(yōu)化中的應(yīng)用。該課題由6位食品專業(yè)的大四學(xué)生完成，由食品微生物技術(shù)方向指導(dǎo)老師指導(dǎo)。

本試驗所用基因工程菌pET32a（+）-plnc8 α-BL21（DE3）的前期構(gòu)建工作由指導(dǎo)老師完成，若實驗課時充分或為食品生物技術(shù)專業(yè)小組，可在指導(dǎo)老師的幫助下嘗試自行構(gòu)建。本試驗的優(yōu)化過程為：首先進行融合蛋白的誘導(dǎo)表達，以可溶性融合蛋白的含量為指標(biāo)，利用P-B試驗設(shè)計篩選出最有影響的獨立因素，然后用Box-Behnken Design（BBD）響應(yīng)面試驗找到最優(yōu)試驗參數(shù)，并對模型進行驗證，以得到基因工程菌的最優(yōu)發(fā)酵條件。

1 試驗步驟與結(jié)果

1.1 P-B設(shè)計和響應(yīng)面法的基本原理和特點

P-B設(shè)計是建立在平衡的非完全區(qū)組（Balanced incomplete block）基礎(chǔ)上的，通過N個試驗（N為4的倍數(shù)）來分析N-1個變量的兩水平試驗設(shè)計方法。和傳統(tǒng)的單因素試驗相比，可以利用最少的試驗次數(shù)，快速有效地在眾多考察因素中列出重要性排名，找出主要影響因素。

響應(yīng)面法是通過具有代表性的局部各點進行試驗，回歸擬合全局范圍內(nèi)因素與結(jié)果的函數(shù)關(guān)系，建立模型，取得各因素的最優(yōu)水平值。和傳統(tǒng)的正交試驗相比，可以通過建模，在整個區(qū)域獲得試驗因素和響應(yīng)目標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系式，以獲得變量的最優(yōu)組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。

P-B設(shè)計和響應(yīng)面法是近年來國際上較常用的理論優(yōu)化方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品工藝配方設(shè)計和工藝條件優(yōu)化等領(lǐng)域。

1.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達

融合蛋白的誘導(dǎo)表達采用常規(guī)方法。目標(biāo)蛋白特異性條帶通過SDS-PAGE電泳檢驗，利用Photoshop CS6軟件分析灰度值確定蛋白含量。通過上述試驗，發(fā)現(xiàn)每升培養(yǎng)基產(chǎn)可溶性融合蛋白約4 mg，產(chǎn)包涵體蛋白約26 mg，由此可見，大部分融合蛋白經(jīng)誘導(dǎo)表達后，以包涵體的形式存在。經(jīng)查閱文獻，發(fā)現(xiàn)在原核表達的過程中，當(dāng)重組蛋白在宿主系統(tǒng)中高水平表達時，可能因為蛋白折疊太快，而折疊過程中所需要的酶或輔助因子供應(yīng)不足，無法形成正確的次級鍵，從而形成包涵體。包涵體無論在誘導(dǎo)表達還是進一步分離純化時，步驟都比可溶性蛋白要復(fù)雜繁瑣，純化成本也高。故結(jié)合文獻和實驗室蛋白誘導(dǎo)表達經(jīng)驗，利用P-B試驗設(shè)計法和BBD響應(yīng)面試驗對基因工程菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期得到最大量的可溶性融合蛋白。

1.3 P-B設(shè)計法

根據(jù)前期試驗，確定P-B試驗設(shè)計的因素和水平（表1），評價指標(biāo)為PLNC8α可溶性融合蛋白的濃度。

表1 P-B試驗設(shè)計因素水平及編碼

在本研究采用的方法和條件下，采用Minitab軟件對可溶性融合蛋白誘導(dǎo)表達的P-B試驗結(jié)果（下頁表2）進行方差分析。從方差分析結(jié)果（表3）可以看出，影響PLNC8α可溶性融合蛋白產(chǎn)量的因素重要性排序為：IPTG濃度>初始pH>IPTG誘導(dǎo)溫度>IPTG誘導(dǎo)時間>裝液量>搖床轉(zhuǎn)速。其中，取排名前三的因素IPTG濃度、初始pH和IPTG誘導(dǎo)溫度進行響應(yīng)面分析，以確定其所對應(yīng)的最優(yōu)水平。IPTG誘導(dǎo)時間、裝液量和搖床轉(zhuǎn)速的確定根據(jù)效應(yīng)的正負和節(jié)約成本的原則，參考相關(guān)文獻中關(guān)于可溶性蛋白表達的一般條件，將其控制為IPTG誘導(dǎo)時間12 h；裝液量：5 mL/250 mL；搖床轉(zhuǎn)速160 r/min進行試驗。

表2 PLNC8α的P-B試驗設(shè)計與響應(yīng)值表

表3 PLNC8α的P-B試驗分析結(jié)果方差分析

1.4 響應(yīng)面法

根據(jù)P-B試驗結(jié)果，選取初始pH、IPTG濃度和IPTG誘導(dǎo)溫度3個因素為自變量，PLNC8α可溶性融合蛋白的濃度為響應(yīng)值，利用BBD響應(yīng)面設(shè)計法對以上3個條件進行進一步優(yōu)化，試驗因素及編碼水平見表4。

表4 BBD響應(yīng)面設(shè)計試驗因素和編碼水平

在設(shè)定的方法和條件下，利用Design-Expert軟件對PLNC8α的BBD響應(yīng)面試驗結(jié)果（下頁表5）進行方差分析及二次多項回歸擬合（下頁表6），得到PLNC8α可溶性融合蛋白產(chǎn)量對IPTG濃度、初始pH和IPTG誘導(dǎo)溫度的多元回歸模型：

Y=22.5+1.075A+0.25B+0.7C-0.35A×B+0.1A× C-0.05B×C-1.63A2-0.15B2-0.48C2，

其中，Y為最大響應(yīng)值的預(yù)測值；A、B、C分別為IPTG濃度、初始pH、IPTG誘導(dǎo)溫度的編碼值。

該二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2=0.985 7，表明僅1.43%的變異不能由此模型解釋；回歸模型P值（prob>F）=0.000 4，表明模型是顯著的，失擬項P 值為0.261 7，表明失擬不顯著，模型沒有失擬現(xiàn)象。由模型可得，理論上當(dāng)IPTG誘導(dǎo)濃度為0.46 mmol/L，初始pH為7.34，誘導(dǎo)溫度為19.36℃時，預(yù)測的最大響應(yīng)值為22.97 mg/L。為驗證試驗結(jié)果，將誘導(dǎo)溫度修正為19℃，在該條件下進行重復(fù)試驗，結(jié)果為23.04 mg/L±0.92 mg/L，與預(yù)測值接近，證明模型有效。PLNC8α的交互影響響應(yīng)面見下頁圖1。由圖1可形象地看出各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響。經(jīng)過優(yōu)化，可溶性融合蛋白產(chǎn)量從優(yōu)化前的每升培養(yǎng)基產(chǎn)4 mg提升到23.04 mg±0.92 mg，效果顯著。

2 試驗教學(xué)效果分析

通過本綜合試驗，學(xué)生能掌握P-B設(shè)計和響應(yīng)面方法的基本原理及操作方法。對于第一次接觸的同學(xué)，指導(dǎo)老師在P-B試驗因素的選擇上給予重點指導(dǎo)。P-B試驗中，需對每個因素選擇合適水平，盡量涵蓋該因素允許的最大空間。這就需要有經(jīng)驗的指導(dǎo)老師，根據(jù)前期試驗基礎(chǔ)并結(jié)合相關(guān)文獻，與同學(xué)們一起選出因素并確定因素的水平范圍。同時，在試驗中需要規(guī)范每位同學(xué)的試驗操作，避免因其他因素影響使試驗結(jié)果失真。同理，在利用P-B試驗選出關(guān)鍵因素后，響應(yīng)面的編碼水平選擇也需指導(dǎo)老師把關(guān)。學(xué)習(xí)Design-Expert軟件的使用。整個試驗完成后，學(xué)生對P-B設(shè)計和響應(yīng)面方法從理論到應(yīng)用已十分熟悉，同時也掌握了試驗數(shù)據(jù)的處理方法和統(tǒng)計分析方法。在整個試驗過程中，6位同學(xué)需查閱資料，設(shè)計試驗方案，統(tǒng)籌安排，提高試驗設(shè)備利用率，及時處理試驗數(shù)據(jù)，提交試驗報告，并進行PPT答辯，通過實訓(xùn)，學(xué)生的試驗設(shè)計能力、操作能力、問題總結(jié)能力和協(xié)調(diào)交流能力均得到提高，學(xué)生的試驗規(guī)范性也得到了提高，這些為畢業(yè)論文的設(shè)計以及畢業(yè)后從事相關(guān)工作打下了良好的基礎(chǔ)。

表5 PLNC8αBBD響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表6 PLNC8α的回歸方程方差分析

圖1 PLNC8α的交互影響響應(yīng)面圖

加強師生良性互動，讓學(xué)生有更多機會進入科研實驗室鍛煉。在本實驗教學(xué)過程中，以學(xué)生為主體，指導(dǎo)老師采用啟發(fā)式教學(xué)和討論式教學(xué)，以多種方法和形式啟發(fā)引導(dǎo)學(xué)生自主學(xué)習(xí)，獨立分析、思考和解決問題，指導(dǎo)老師起到引領(lǐng)方向和答疑解惑的作用。試驗中，因涉及到的發(fā)酵條件變量較多，指導(dǎo)教師應(yīng)開放科研實驗室以開展工作，并積極鼓勵本科生就試驗細節(jié)問題請教科研實驗室的研究生，以形成良性互動。

鼓勵指導(dǎo)教師將最新的科研項目提煉成食品專業(yè)綜合實驗教學(xué)內(nèi)容。若食品專業(yè)綜合實驗項目采用每年固定的題目，更新少、增補慢，會影響教師的指導(dǎo)積極性以及學(xué)生的試驗設(shè)計興趣。若指導(dǎo)教師每年更新綜合實驗的題目，又需耗費大量精力。因此鼓勵指導(dǎo)教師結(jié)合自身科研項目，提煉出適合學(xué)生的綜合實驗教學(xué)內(nèi)容。從而使教師指導(dǎo)學(xué)生更專業(yè)，也愿意投入更多精力。學(xué)生不僅可以從專業(yè)綜合實驗中得到鍛煉，而且還能提高學(xué)習(xí)和科研興趣。同時，學(xué)生們集思廣益也能為指導(dǎo)老師的科研項目提供新思路。

3 結(jié)語

本項目作為食品專業(yè)綜合實驗教學(xué)內(nèi)容之一，充分考慮到綜合實驗的完整性，從融合蛋白的誘導(dǎo)表達這一基礎(chǔ)實驗入手，到提出問題、設(shè)計系列優(yōu)化方案等均需要更高要求的綜合性和研究探索性試驗，都取得了良好的教學(xué)效果。一方面，學(xué)生通過該試驗，全面掌握了P-B設(shè)計和響應(yīng)面優(yōu)化方法，今后可舉一反三應(yīng)用在食品工藝、質(zhì)量控制、安全檢測等需要條件優(yōu)化的試驗中。同時了解和掌握基因工程菌構(gòu)建、蛋白誘導(dǎo)表達、大腸桿菌培養(yǎng)、SDS-PAGE電泳等專業(yè)試驗技能和常用儀器的使用方法，拓寬了學(xué)生的專業(yè)視野，提高了學(xué)生的專業(yè)綜合能力，為今后進一步深造和從事相關(guān)工作打下了基礎(chǔ)。另一方面，試驗內(nèi)容提煉于指導(dǎo)老師的最新科研項目，具有一定的科研探索性和趣味性，學(xué)生能夠在指導(dǎo)老師的帶領(lǐng)下主動提出問題，分析問題和解決問題，為學(xué)生科研能力和專業(yè)綜合素養(yǎng)的提高提供幫助，達到了食品專業(yè)人才培養(yǎng)的效果，為食品專業(yè)相關(guān)實驗教學(xué)改革提供參考與借鑒。

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Application of plackett-burman design and response surface methodology in the food speciality comprehensive experiment teaching*

JIANG Han*ZHAO Jin FANG Jiehong HUANG Guangrong LI Hongliang PAN Jiarong
（China jiliang university key laboratory of marine food quality and hazard controlling technology of Zhejiang province，Zhejiang Hangzhou 310018，China）

為實現(xiàn)食品專業(yè)綜合實驗選題和內(nèi)容點面結(jié)合、基礎(chǔ)知識和專業(yè)知識有機結(jié)合，有效涵蓋學(xué)科方向的典型試驗操作與試驗設(shè)計分析的目標(biāo)，設(shè)計了課題“產(chǎn)乳酸菌細菌素基因工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化”，將近年來廣泛應(yīng)用于食品工藝條件優(yōu)化等領(lǐng)域的理論優(yōu)化方法Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面法應(yīng)用到食品專業(yè)綜合實驗教學(xué)項目中，優(yōu)化基因工程菌的發(fā)酵條件，以期得到最大量的可溶性融合蛋白。食品專業(yè)學(xué)生通過此項專業(yè)綜合實驗訓(xùn)練，可熟練掌握該優(yōu)化方法，并可應(yīng)用在食品工藝、質(zhì)量控制、安全檢測等需要條件優(yōu)化的試驗方案中。該項目可為食品專業(yè)相關(guān)實驗教學(xué)改革提供參考與借鑒。

Plackett-Burman設(shè)計；響應(yīng)面法；食品專業(yè)綜合實驗教學(xué)

To achieve the aims of proper combination of basic and professional knowledge,effective coverage of the typical experimental operation,designing and analysis skills of subject content,and make experimental subject selection and content integrate point with face.The subject of"optimization of fermentation conditions of lactic acid bacteria bacteriocin-producing genetically engineered bacteria"has been designed.The plackett-burman design and response surface methodology were used to obtain the maximum yields of soluble fusion proteins.According to the training,food science undergraduates can be familiar with the optimization methods and can apply the optimization methods to experiments including food technology,quality control and safety detection and so on.This project can provide references for experimental teaching reform of food speciality.

plackett-burman design；response surface methodology；food comprehensive experiment teaching

TS210.1

A

1673-6044（2017）02-0010-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.02.005

浙江省高校實驗室工作研究項目（YB201654）。

**蔣晗，女，1987年出生，2017年畢業(yè)于浙江工商大學(xué)食品科學(xué)專業(yè)，實驗師。

2017-04-11