腹腔注射給藥Ghrelin對(duì)小鼠神經(jīng)再生的影響*

趙志紅

(天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300350)

腹腔注射給藥Ghrelin對(duì)小鼠神經(jīng)再生的影響*

趙志紅

(天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300350)

目的 探討腹腔注射給藥Ghrelin對(duì)小鼠海馬神經(jīng)再生的影響。方法 本研究將小鼠隨機(jī)分為Ghrelin組及對(duì)照組，兩組均腹腔注射相同劑量BrdU (100 mg/kg, 早晚各1次，連續(xù)5天),目的用來(lái)標(biāo)記海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)(Subgranular Zone，SGZ)增生的細(xì)胞。處理組小鼠給予腹腔注射Ghrelin(80 μg/kg, 一天一次，連續(xù)8 d)，而對(duì)照組注射等量的生理鹽水。1周后進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果 BrdU 免疫陽(yáng)性(BrdU+)細(xì)胞在海馬齒狀回中廣泛表達(dá); Ghrelin處理組BrdU+細(xì)胞數(shù)顯著多于生理鹽水對(duì)照組(t=3.43，P<0.01)。結(jié)論 腹腔注射Ghrelin(80 μg/kg)促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)再生。

Ghrelin ；BrdU；海馬；神經(jīng)再生

Ghrelin是一種肽類激素，由28個(gè)氨基酸構(gòu)成，起初被發(fā)現(xiàn)是從鼠的胃中分離出的，且其受體為生長(zhǎng)激素促泌素受體(GHSR)[1]，多肽類Ghrelin由胃內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生及分泌[2]，隨后釋放到全身體循環(huán)發(fā)揮相應(yīng)的效應(yīng)。迄今為止，GHS-R1a是發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)有功能的Ghrelin受體，這種典型的受體，即G蛋白偶聯(lián)的7-跨膜受體，最開始是在垂體和下丘腦中表達(dá)[3]。此外， GHS-R1a也在海馬齒狀回也有高度表達(dá)，大量研究已經(jīng)證實(shí)，Ghrelin影響垂體激素的分泌、食欲、代謝、胃腸功能系統(tǒng)。但關(guān)于Ghrelin對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響的研究幾乎未涉及過(guò)，本研究將探討腹腔注射給藥Ghrelin對(duì)小鼠海馬神經(jīng)再生的影響。

1 材料和方法

1.1材料

該實(shí)驗(yàn)選用的小鼠，為成熟雄性小鼠(C57/Bl6)，2～3個(gè)月，體重約25～30 g，在北京維通利華公司購(gòu)買。小鼠生活的環(huán)境：室溫(22±1)℃，濕度 (40%±5%)，且24 h晝夜循環(huán)飼養(yǎng)，飲水和進(jìn)食自由。

1.2重要試劑與相關(guān)儀器

Ghrelin：由美國(guó)phoenix公司提供，用0.9%鹽水配成300 μM溶液，并凍存于80 ℃，當(dāng)使用時(shí)再稀釋所需濃度。BrdU：購(gòu)買于美國(guó)sigma公司， 直接用0.1 MPBS溶液配成100 mg/kg。一抗：BrdU抗體(Rat)，美國(guó)ABD公司產(chǎn)品， (11)二抗：Alexa Fluor 488 chicken anti-Rat，美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；封閉用羊血清、甘油、Triton-X-100、PBS緩沖液由上海試劑一廠產(chǎn)品。CM-1900冰凍切片機(jī)(Leica，德國(guó))；LSM高靈敏度激光共聚焦顯微鏡(Zeiss, Jena， 德國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組 將小鼠隨機(jī)分為Ghrelin組及對(duì)照組，每組20只，兩組均腹腔注射相同劑量BrdU(100 mg/kg，早晚各1次，連續(xù)5天),目的用來(lái)標(biāo)記海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)(Subgranular Zone，SGZ)增生的細(xì)胞。處理組小鼠給予腹腔注射Ghrelin(80 μg/kg, 一天一次，連續(xù)8天)，而對(duì)照組注射等量的生理鹽水。

1.3.2取材及標(biāo)本制備 將小鼠用8%水合氯醛溶液(400 mg/kg)充分麻醉后，開胸，充分暴露心臟，將針頭從心尖刺入左心室，快速灌注生理鹽水，待雙肺變白換為4%多聚甲醛溶液，灌注30 min后斷顱取腦，置于4%多聚甲醛溶液中24 h。然后把腦組織轉(zhuǎn)移至30%蔗糖中，浸泡約24～48 h，用包埋液把小鼠腦包埋好，放置到振動(dòng)式切片機(jī)固定好，制作為50 μm厚度的水平面腦片，背側(cè)海馬的腦片全部收藏(24～32張)，分為4套，每套6～8張腦片，后置于24孔板里，并放置4 ℃冰箱保存。各只小鼠挑選1套腦片，行免疫熒光染色。

1.3.3免疫熒光染色步驟 對(duì)所選腦片采用漂染法，并行免疫熒光染色。操作步驟如下：將腦片用0.1 MPBS漂洗3次，后轉(zhuǎn)到1 N鹽酸(HCl)孵育半小時(shí)，該過(guò)程在45 ℃水浴鍋進(jìn)行，目的是使DNA變性(將其雙鏈打開)，轉(zhuǎn)到0.1 MPBS漂洗3次，每10 min漂洗一次，后將所有腦片置于封閉液中孵育1 h，目的是減輕或消除一些非特異性反應(yīng)，本次之后不漂洗，后轉(zhuǎn)到一抗溶液[BrdU (Rat 1∶500)](由封閉液配制)，再孵育48～72 h，該過(guò)程需避光并在4 ℃搖床進(jìn)行，使腦片充分接觸；轉(zhuǎn)到0.1 M PBS漂洗3次，每10 min漂洗一次；再轉(zhuǎn)至封閉液配制的二抗溶液中，該過(guò)程在常溫即可，但需錫箔紙包裹，且避光孵育2 h，轉(zhuǎn)到0.1 MPBS漂洗3次，每10 min漂洗一次；將腦片轉(zhuǎn)到載玻片上，需較暗的環(huán)境下進(jìn)行，后避光晾干，滴上含甘油的保護(hù)液，用蓋玻片封閉，最后將處理好的腦片全部置于4 ℃冰箱內(nèi)備用；用熒光共聚焦顯微鏡掃描計(jì)數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1BrdU+細(xì)胞在海馬齒狀回表達(dá)

箭頭所示綠色信號(hào)為BrdU+細(xì)胞，見圖1，兩組熒光免疫組化結(jié)果顯示，BrdU+細(xì)胞在海馬齒狀回均廣泛表達(dá)(200倍)。

2.2兩組BrdU+細(xì)胞數(shù)比較

Ghrelin處理組BrdU+細(xì)胞數(shù)(202.91±11.83)與生理鹽水對(duì)照組(157.20±6.17)比較，見圖2，差異有顯著意義(t=3.43，P<0.01)。

圖1 兩組BrdU+細(xì)胞的表達(dá)

圖2 兩組BrdU+細(xì)胞數(shù)比較

3 討 論

海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)(subgranular zone，SGZ)神經(jīng)元具有干細(xì)胞特點(diǎn)，即自我更新和多向分化等潛能，因此被稱為神經(jīng)干細(xì)胞(adult neural stem cell，ANSC)。在嚙齒動(dòng)物中，SGZ的細(xì)胞再生功能自始至終存在，但是并隨著年齡的增加而逐漸減弱[4]。本研究結(jié)果揭示了海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞具有再生能力，同時(shí)證明了Ghrelin促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)再生。5-溴脫氧尿核苷(5’-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU)，一種胸苷類似物，參與細(xì)胞有絲分裂DNA合成，且同內(nèi)源性胸苷相互競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合到DNA中。研究顯示，BrdU一旦結(jié)合到DNA中，就持續(xù)存在，而且隨著細(xì)胞有絲分裂逐步傳遞給下一代。應(yīng)用特異性的抗體作用于已固定的的腦組織，發(fā)現(xiàn)在幾天，幾周，幾個(gè)月，或是幾年之后仍可檢測(cè)BrdU標(biāo)記的神經(jīng)元[5]。通常來(lái)說(shuō)，小鼠腹腔注射BrdU，可通過(guò)血腦屏障，這是關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞再生相關(guān)研究的金標(biāo)準(zhǔn)。BrdU標(biāo)記可以檢測(cè)到神經(jīng)再生中增生細(xì)胞[6-8]。在嚙齒類動(dòng)物中，SGZ每天都會(huì)產(chǎn)生許多新生的神經(jīng)元，通常在給藥BrdU三天后，BrdU標(biāo)記的新生神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高峰，其后新生神經(jīng)元隨時(shí)間推移因凋亡逐漸減少。狹義神經(jīng)再生是指成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元的分化。廣義神經(jīng)再生除了該項(xiàng)內(nèi)容，還包括另一階段即新形成的神經(jīng)元的存活，本研究證實(shí)了腹腔給藥 Ghrelin促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)再生。但外源性Ghrelin是否可以保護(hù)腦缺氧缺血而造成的細(xì)胞死亡，仍需進(jìn)一步研究。倘若可以提高神經(jīng)元存活，又是通過(guò)何種機(jī)制呢，需進(jìn)一步研究探討。

記憶功能障礙相關(guān)性疾病與海馬神經(jīng)元病態(tài)有密切關(guān)系，相對(duì)比較常見的是與缺血性腦損傷及癲癇等疾病。相關(guān)研究顯示，在缺血性腦損傷中，記憶力減退及認(rèn)知功能障礙可由海馬神經(jīng)元缺失或退化引起。常見的生長(zhǎng)因子，比如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，可直接作用于海馬新神經(jīng)元再生，或者間接途徑通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)作用而提高海馬新生神經(jīng)元存活[9]。而另一些研究證明，在癲癇后出現(xiàn)的記憶損害與神經(jīng)再生也有相關(guān)聯(lián)系，即抑制海馬神經(jīng)再生[10-11]。腹腔注射Ghrelin促進(jìn)海馬齒狀回的神經(jīng)再生，然而海馬神經(jīng)損害可以被缺血性腦損傷及癲癇所誘發(fā)，綜上所述，給藥Ghrelin刺激海馬神經(jīng)再生，這一促進(jìn)效應(yīng)在提高認(rèn)知能力以及抑制神經(jīng)元缺失或凋亡等方面都起著重要作用，這一說(shuō)法好像合乎情理，但仍需進(jìn)一步研究探討核實(shí)。

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Effects of intraperitoneal injection of Ghrelin on neural regeneration in mice

ZHAO Zhi-hong

(Dept.of Neurology,Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300350,China)

Objective:To explore the effect of intraperitoneal injection of Ghrelin on hippocampus neurogenesis.Methods： Mice were randomly divided into Ghrelin group and control group.Both groups were given intraperitoneal injection of equal BrdU (100 mg/kg, twice a day, continuous injection of 5 days) to mark proliferating cells of the hippocampal dentate gyrus Subgranular Zone(SGZ). Ghrelin was given intraperitoneal injection (80 μg/kg, once a day, continuous injection of 8 days), the control group mice were offered same volume normal saline. After 1 week, both were immunohistochemical analysis.Results：BrdU-immunopositive cells widely expressed in the hippocampal dentate gyrus, the number of BrdU+ cells observed in Ghrelin treatment groups were significantly much more than that in control groups(t=3.43，P<0.01).Conclution：Our results indicated that intraperitoneal injection of Ghrelin (80 μg/kg) induced neurogenesis in hippocampus.

Ghrelin;BrdU;hippocampus;neurogenesis

趙志紅(1985—)，女，天津人，醫(yī)師，碩士，主要從事神經(jīng)內(nèi)科工作。

R741

A

1004-7115(2017)10-1126-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.10.015

2017-08-18)