含不同比例自體血冷心臟停搏液對未成熟心肌線粒體結(jié)構(gòu)及術(shù)后心功能的影響*

孟保英 張 青 潘曉蘭 丁以群 王元祥 彭 樂

(深圳市兒童醫(yī)院心血管外科，廣東 深圳 518026)

含不同比例自體血冷心臟停搏液對未成熟心肌線粒體結(jié)構(gòu)及術(shù)后心功能的影響*

孟保英 張 青 潘曉蘭 丁以群 王元祥 彭 樂

(深圳市兒童醫(yī)院心血管外科，廣東 深圳 518026)

目的 探討含不同比例自體血冷心臟停搏液對體外循環(huán)下未成熟心肌線粒體結(jié)構(gòu)及術(shù)后心功能的影響。方法 年齡≤1Y,體重≤10 kg,體外循環(huán)心臟直視手術(shù)患兒220例，隨機分成HTK液灌注組(A組，n=20)、改良ST.Tomas液灌注組(B組,n=50)，4∶1含自體血停搏液組(C組,n=50)，1∶1含自體血停搏液組(D組,n=50)，1∶4含自體血停搏液組(E組,n=50)，透視電鏡觀察心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)改變，采用彩色多普勒超聲儀及無創(chuàng)心功能檢測儀評估術(shù)后心功能改變。結(jié)果 A組心肌線粒體評分及術(shù)后1 h左心室射血分數(shù)(LVEF)、CI明顯高于其他組(P<0.05)，E組心肌線粒體評分及術(shù)后1 h LVEF、CI高于其他三組(P<0.05)，C、D組心肌線粒體評分及術(shù)后1h LVEF、CI無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 1∶4含自體血心臟停搏液對未成熟心肌保護優(yōu)于其他含血心臟停搏液。

心臟病/先天性；心臟停搏液；線粒體；心??；心功能

隨著心外科技術(shù)不斷發(fā)展，低體重、小年齡嬰幼兒心臟直視手術(shù)在臨床廣泛開展，未成熟心肌保護越來越受到人們的重視。臨床上嬰幼兒心臟直視手術(shù)中使用的心臟停搏液大多為晶體停搏液及含血停搏液，但仍有心肌損傷的情況。近年來，我中心研究證實4∶1含自體血冷心臟停搏液對未成熟心肌保護優(yōu)于冷血停博液和晶體停搏液，但是仍然存在的心肌損傷，因此本研究擬探討不同比例含自體血冷心臟停搏液對未成熟心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)及術(shù)后心功能的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料

選取2015年5月到2016年5月在我院收治的非紫紺先天性心臟病患兒220例，均行體外循環(huán)心臟直視手術(shù)，其中男125例，女95例；年齡7 d～10 M，平均(5.3±0.5)M；體重1.8～10 kg，平均(5.3±0.4)kg。隨機分成HTK液灌注組(A組，男12例，女8例)、改良ST.Tomas液灌注組(B組, 男27例，女23例)，4∶1含自體血停搏液組(C組, 男26例，女24例)，1∶1含自體血停搏液組(D組, 男28例，女22例)，1∶4含自體血停搏液組(E組, 男29例，女21例)。術(shù)前所有患兒心功能分級無顯著性差異(美國紐約學(xué)會(NYHA)心功能分級標準[1]分級)。術(shù)前無肺炎及其他疾病，肝腎功能正常。

1.2方法

1.2.1體外循環(huán) 醫(yī)院倫理委員會通過，監(jiān)護人知情同意后實施。同一組醫(yī)生、麻醉師、體外循環(huán)師合作完成。采用STOCKER V人工心肺機、TERUMO膜式氧合器，采用淺低溫(30 ℃～33 ℃)，紅細胞壓積(HCT)0.23～0.28。阻斷升主動脈，不同組別分別經(jīng)主動脈根部灌注相應(yīng)的心臟停搏液,體外循環(huán)中90%患兒未給于超濾。體外循環(huán)時間38～117 min，平均(68.2±4.2)min，主動脈阻斷10～73 min，平均(34.3±3.9)min。

1.2.2心臟停搏液制備及灌注方法 A組：采用德國克勒化學(xué)制藥生產(chǎn)的成品HTK，(CUSTODIOL,規(guī)格500 ml/瓶)，灌注量30 ml/kg，灌注時間3～5 min,灌注壓力60～100 mmHg,只灌注一次。B組：按照改良ST.Tomas液配方配制，灌注量20 ml/kg，灌注時間1～2 min,灌注壓力60～100 mmHg,只灌注一次。C組：體外循環(huán)開始前，經(jīng)主動脈根部停跳針快速抽取自體血液，抽血時間約30～50 s，保持動脈收縮壓≥40 mmHg，自體血抽取完畢后，經(jīng)主動脈插管補充血容量以維持循環(huán)穩(wěn)定，按血液：晶體4∶1比例配制4∶1自體血冷心臟停搏液，K+濃度20 mmol/L，將配制的4∶1自體血心臟停搏液浸入冰屑液中，制成4 ℃冷停搏液備用，灌注量30 ml/kg，灌注時間1～3 min,灌注壓力40～60 mmHg,每45 min灌注一次。D組：經(jīng)主動脈根部灌注針抽取自體血，按血液：晶體1∶1比例快速抽取血液，K+濃度20 mmol/L，其余制備及灌注同C組。E組：經(jīng)主動脈根部按血液∶晶體1∶4比例快速抽取血液，K+濃度20 mmol/L，其余制備及灌注同C組。

1.2.3觀察指標及測定方法

1.2.3.1心肌超微結(jié)構(gòu) 體外循環(huán)開始前5 min自右心耳取材，主動脈開放后5 min 自右心房切口處取材，分別取大小約1 mm×1 mm×1 mm心肌組織塊，用濾紙拭干，迅速置于10%戊二醛磷酸緩沖液中固定，丙酮酸脫水、環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片(50～100 μm)，經(jīng)3%的醋酸鈾—枸櫞酸鉛染色后，置透射電子顯微鏡(H7650，日本日立公司)下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)，參照Flameng評分標準對線粒體進行評分[2]：0級：線粒體結(jié)構(gòu)正常，充滿顆粒；1級：線粒體結(jié)構(gòu)正常，但顆粒缺乏；2級：線粒體腫脹，基質(zhì)透明；3級：線粒體嵴分裂，伴基質(zhì)透明和濃度；4級：線粒體嵴分裂，線粒體內(nèi)膜和外膜完整性缺失。其中0級為5分，以此類推，4級為1分。

1.2.3.2LVEF及CI測定 入院后第2天清晨及術(shù)后1 h、6 h鎮(zhèn)靜睡眠狀態(tài)下，采用SIEMENS Acuson Sequoia 512型，探頭頻率6.0 MHZ，Simpson法測定左心室射血分數(shù)LVEF[3]。體外循環(huán)結(jié)束后1 h、6 h采用無創(chuàng)血流動力學(xué)動態(tài)監(jiān)測心臟指數(shù)(CI)(采用德國CSM-3000無創(chuàng)血流動力學(xué)檢測系統(tǒng)監(jiān)測)。

2 結(jié) 果

2.1一般結(jié)果

所有組患兒無死亡。室顫發(fā)生率、低心排發(fā)生率及自動復(fù)跳率5組均無差別(P>0.05)，無統(tǒng)計學(xué)差異。C組自動復(fù)跳時間較其他組短，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 A組、B組復(fù)跳率及正性肌力藥物依賴性比較

注：與A組比較,aP>0.05；與C組比較,cP<0.05。

2.2心肌透射電鏡觀察

所有組體外循環(huán)前組心肌組織超微結(jié)構(gòu)顯示肌膜下大部分心肌肌原纖維大多排列整齊，肌漿網(wǎng)未見增生、擴張，局部線粒體堆積，未見明顯異常線粒體；肌間質(zhì)未見特殊病理改變。主動脈開放5 min后，A組肌節(jié)及肌纖維仍清晰，線粒體輕度腫脹，但是仍富含顆粒，無空泡化。B組線粒體明顯腫脹，出現(xiàn)明顯脫顆?，F(xiàn)象及灶性空泡化，伴基質(zhì)透明及濃縮，線粒體嵴分裂。E組線粒體輕度腫脹，部分輕度脫顆?，F(xiàn)象。C及D組線粒體出現(xiàn)明顯腫脹，部分出現(xiàn)脫顆粒及輕度灶性空泡化，伴基質(zhì)透明及濃縮。 五組線粒體Flameng評分中A組高于其他四組，B組線粒體評分最低，E組線粒體評分高于C及D組(P<0.05)，C及D組線粒體評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。五組心肌線粒體Flameng評分，見表2及圖1～10。

表2 五組不同時點心肌線粒體Flameng評分比較

注：各組與術(shù)前比較,aP<0.05；與A組比較，bP<0.05;與C組比較,cP>0.05。

表3 不同時點各組LVEF比較

注：與A組術(shù)前及術(shù)后6 h比較，aP>0.05; 與A組術(shù)后1 h比較，bP<0.05; 與E組術(shù)后1 h比較，eP<0.05;C組與D組術(shù)后1 h 比較，cP>0.05;各組術(shù)后1 h與術(shù)前比較，dP<0.05。

表4 不同時點各組CI比較

注：術(shù)后1h各組與A組CI比較，aP<0.05， E組與其他三組CI比較，bP<0.05; D組與C組CI比較，cP>0.05;術(shù)后6 h各組與A組比較，dP>0.05。

圖1、2 A組體外循環(huán)前、后(20KX)

圖3、4 B組體外循環(huán)前、后(20KX)

圖5、6 C組體外循環(huán)前、后(20KX)

圖7、8 D組體外循環(huán)前、后(20KX)

圖9、10 E組體外循環(huán)前、后(20KX)

2.3不同時點各組LVEF及CI比較

各組術(shù)前及術(shù)后6 h LVEF比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后1 h各組LEVF較術(shù)前均有不同程度下降，其中A及E組LVEF較其他組下降程度小，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，C組及D組LVEF比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后1 h A組及E組CI較其他各組較高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；C組及D組CI比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后6 h各組CI比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。(見表3、4)

2.4術(shù)后隨訪

五組均無死亡，術(shù)后隨訪1個月～1年，心臟畸形矯正滿意，心功能分級無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討 論

未成熟哺乳動物、新生兒和嬰幼兒的心肌稱為未成熟心肌[4-5]。隨著外科及體外循環(huán)技術(shù)的不斷發(fā)展，先天性心臟病的手術(shù)治療逐漸趨于低年齡及極低體重化，因此對于未成熟心肌的保護研究受到廣泛關(guān)注。未成熟心肌的能量充足、心肌收縮力弱、耗能少、抗氧化及抗氧化基能力強等特點，其心肌功能恢復(fù)也較快，這就決定了未成熟心肌保護方法明顯不同于傳統(tǒng)上的成熟心肌[6]。我中心自2005年采用自體血冷心臟停搏液，已證實其優(yōu)于晶體液和含血心臟停搏液，但是仍存在心臟直視手術(shù)后不同程度的心肌細胞損傷[7-8]。故我們通過調(diào)整心臟停搏液中自體血成分比例，探討其對未成熟心肌保護作用。

HTK液具有以下特點：低鈉微鈣，使得心臟在較低的鉀離子濃度下停搏在舒張期；擁有強大的組氨酸/組氨酸鹽緩沖系統(tǒng)，可防止細胞腫脹，避免心肌組織發(fā)生細胞內(nèi)、外的酸中毒；為缺血的心肌提供能量[9-10]。改良ST.Tomas晶體心臟停搏液為仿細胞外高鉀停搏液，不能提供氧和營養(yǎng)物質(zhì)，且缺乏酸堿平衡和膠體的緩沖，反復(fù)灌注加重心肌水腫。含自體血停搏液增加膠滲壓，而且其中含有大量葡萄糖、游離脂肪酸等，為心肌代謝提供高能量物質(zhì)，有豐富的緩沖物質(zhì)，紅細胞攜帶氧，可使心臟停搏于有氧的環(huán)境中，心臟停搏期間仍可以進行氧化，利于線粒體形態(tài)及功能的保護和ATP的保存[11-12]。而且自體血為術(shù)中現(xiàn)配制，其不含庫血保存液，避免血細胞破損導(dǎo)致的高鉀影響灌注液配制的可能，故自體血配制心臟停搏液優(yōu)于庫血。但是含血停搏液冠狀動脈毛細血管堵塞且含有炎性介質(zhì)和白細胞，亦會導(dǎo)致心肌細胞缺血再灌注損傷，導(dǎo)致線粒體損傷及ATP含量下降。但是含自體血停搏液中不同的血液比例，可以使得停搏液中血細胞比例得到調(diào)整，可以使得含血停搏液的優(yōu)點盡可能發(fā)揮，而減輕堵塞毛細血管等缺點。本研究證實HTK組及1∶4含自體血心臟停搏液組心肌線粒體評分較其他組高，術(shù)后LVEF及CI 亦較其他組高，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，充分說明較其他組停搏液利于未成熟心肌細胞保護。但是鑒于HTK液價格昂貴，且灌注后對血液稀釋較嚴重，對臨床推廣困難，而1∶4自體血冷心臟停搏液價格低廉，易于配制，臨床易于推廣。

本研究認為1∶4含自體血心臟停搏液對未成熟心肌具有一定保護作用，在嬰幼兒心臟直視手術(shù)中值得推廣和應(yīng)用。

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Effects of different proportions of autologous blood cardioplegia on mitochondrial structure and postoperative cardiac function in immature myocardium

MENG Bao-ying ZHANG Qing PAN Xiao-lan DING Yi-qun WANG Yuan-xiang PENG Le

(Shenzhen Children's Hospital,Shenzhen 518026,China)

Objective:To observe the effect of cold self-blood cardioplegia with different ratio to the mitochondrial ultrastructure parameters and heart function after opening cardiac operation by cardiopulmonary bypass(CPB). Methods：220 infantile patients with congenital heart disease underwent operation by CPB were randomized into five groups according to the different of cardioplegia solution group: HTK solution group (n=20,A group),ST.Thomas solution group(n=50,B group),cold blood cardioplegia with ratio 4∶1(n=50,C group),cold blood cardioplegia with ratio 1∶1(n=50,D group), cold blood cardioplegia with ratio1∶4(n=50,E group).The hear tissue of right atrial was collected five minutes before CPB and five minutes after aortic declamping. The heart tissue was withdrawn for homogenate.The myocardial ultrastructure were analyzed.LEVF were examined before 1d and after 1 h、6 h of operation.CI were examined after 1 h and 6h of operation.Results：Compared with five groups,the Flameng score of mitochondrial ultrastructure of A and E groups was higher than other groups(P<0.05). The Flameng score of mitochondrial ultrastructure had no significant differen between C and D groups(P>0.05).LVEF and CI of A and E groups afer 1 h of operationwas was higher than other groups(P<0.05).LVEF and CI afer 1h of operation had no significant differen between C and D groups(P>0.05). Conclusion：The cold self-blood cardioplegia with ratio 1∶4 was useful to the immature myocardial profection underwent opening cardiac operation by CPB in infant.

heart disease/congenictal;cardioplegia;Mitochondria;Myocardium;heart function

深圳市科技計劃資助項目(項目編號：JCYJ20150403100317074)。

孟保英(1978—)，女，陜西渭南人，主任醫(yī)師，碩士，主要從事臨床體外循環(huán)心肌保護工作。

R725.4

A

1004-7115(2017)10-1088-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.10.003

2017-07-16)