張家口壩上地區(qū)人群環(huán)氧合酶-2基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病的相關(guān)性

鄒建平，張建軍，馬曉雁，王志恒，李林臣，劉素芳

(1.張家口市第一醫(yī)院急診科，河北 張家口 075000；張家口市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 張家口 075000；2.張家口市萬全中醫(yī)院外科，河北 張家口 076250)

張家口壩上地區(qū)人群環(huán)氧合酶-2基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病的相關(guān)性

鄒建平1，張建軍1，馬曉雁1，王志恒1，李林臣2，劉素芳3

(1.張家口市第一醫(yī)院急診科，河北 張家口 075000；張家口市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 張家口 075000；2.張家口市萬全中醫(yī)院外科，河北 張家口 076250)

目的 分析張家口壩上地區(qū)人群環(huán)氧合酶-2(COX-2)基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病的關(guān)系。方法 選取2015年6月至2017年1月于張家口壩上地區(qū)居住10年以上的居民200例為研究對象，其中健康者100例作為對照組，胃癌患者100例作為胃癌組，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)對兩組進(jìn)行基因分型，然后經(jīng)非條件性Logistic回歸分析COX-2基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs3218625與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果 對照組和胃癌組的年齡＜65歲者比例分別為55.0%及58.0%，男性比例分別為70.0%及74.0%；連續(xù)或偶爾吸煙者比例為47.0%及54.0%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；對照組和胃癌組COX-2 SNP rs3218625基因型為GG的比例分別為93.0%及89.0%；基因型為GA的比例分別為5.0%及10.0%；基因型為AA的比例分別為2.0%及1.0%，基因型為(AG+AA)的比例分別為7.0%及11.0%；經(jīng)非條件性Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，COX-2基因SNP rs3218625與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，且基因型GA出現(xiàn)頻率越高，胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高(OR=2.463，P=0.021)。結(jié)論 張家口壩上地區(qū)人群COX-2基因多態(tài)性可能會增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其中SNP rs3218625位點(diǎn)GA出現(xiàn)頻率是胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。

環(huán)氧合酶-2；單核苷酸多態(tài)性；胃癌；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全世界范圍內(nèi)所有惡性腫瘤的第4位。早期預(yù)防是避免胃癌發(fā)生的關(guān)鍵，通過了解胃癌在分子水平上的發(fā)病機(jī)制，可判定易感人群，進(jìn)而為制定胃癌個體化防治的可行性對策提供一定的理論支持[1-3]。在導(dǎo)致胃癌的代謝酶基因中，環(huán)氧合酶-2(COX-2)的作用最為突出，已經(jīng)成為當(dāng)前胃癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，人類基因組中存在大量單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其是不同個體間疾病易感性、敏感性、表型等的遺傳基礎(chǔ)[4-5]。目前基于SNP的相關(guān)研究，已成為多基因復(fù)雜性狀疾病遺傳學(xué)分析的最為常用及有效的方法。以往研究表明，COX-2基因的啟動子區(qū)某些SNP可使其表達(dá)上調(diào)，使其攜帶者易患食管癌、胃癌和其他相關(guān)的消化系統(tǒng)癌癥疾病或其他人類癌癥，并與腫瘤細(xì)胞的增生、分化、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-7]。張家口壩上地區(qū)地處高原，其氣候與生活習(xí)慣與其他地區(qū)相比具有一定的特殊性及差異性，本地胃癌患病率居高不下。本研究旨在從分子水平上揭示張家口壩上地區(qū)人群中調(diào)控生成COX-2的SNP與胃癌發(fā)病的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月至2017年1月于張家口壩上地區(qū)居住10年以上的居民200例為研究對象。其中100例經(jīng)胃鏡檢查及病變部位活檢確診的胃癌患者作為胃癌組，排除繼發(fā)病例與復(fù)發(fā)病例；既往有消化性潰瘍性疾病者；伴有其他惡性腫瘤或嚴(yán)重性疾病者。另100例健康者作為對照組，對照組健康者要求無癌癥家族史和慢性胃病史等。

1.2 方法

1.2.1 外周血提取基因組DNA 分別采集胃癌組與對照組血樣2 mL，經(jīng)抗凝處理，離心取細(xì)胞沉淀，加入人紅細(xì)胞裂解液300 mL，3 min后離心30 s沉淀白細(xì)胞，加入35μL蛋白酶K，于50℃作用3 h，然后采用氯仿抽提法提取DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)檢測COX-2基因SNP rs3218625G/A多態(tài)性 PCR擴(kuò)增引物序列：primer1：5'-CTATGGGCAGAGAGAAGGAG-3'；primer2：5'-AGCTTGCATGACCAGAACCC-3'；PCR反應(yīng)體系均為50 μL：MgCl23.0μL，dNTPs 4.0μL，上下游引物各4.0μL，DNA聚合酶10 U，模板50 ng，10×Buffer 5.0μL，雙蒸餾水補(bǔ)至50 μL。擴(kuò)增條件：95℃，5 min；94℃，30 s，52.4℃，30 s，72℃，30 s，共 40 個循環(huán)，72℃，7 min。PCR產(chǎn)物以Taq限制性內(nèi)切酶酶切，酶切體系：PCR產(chǎn)物10μL，酶10 U，10×Buffer Tango 3.0μL，雙蒸餾水補(bǔ)至30μL，水浴37℃過夜。30 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果，另選取10%樣本進(jìn)行重復(fù)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；COX-2基因SNP rs3218625與胃癌發(fā)病的關(guān)系采用Logistic回歸分析，并用優(yōu)勢比和95%可信區(qū)間表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的一般資料比較 兩組受檢者的年齡、性別、吸煙史及萎縮性胃炎家族史等方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的一般資料比較[例(%)]

2.2 COX-2 SNP rs3218625基因PCR產(chǎn)物酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果 采用限制性內(nèi)切酶MSPⅠ對各個基因型COX-2 SNP rs3218625基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物為200 bp與182 bp的為GG基因型。酶切產(chǎn)物為382 bp、182 bp、200 bp的為GA型，酶切產(chǎn)物只有200 bp的為AA型，見圖1。

2.3 兩組受檢者COX-2 SNP rs3218625基因型的分布及其與胃癌的關(guān)系 COX-2 SNP rs3218625有3種基因型分別為GG、GA、AA，其在對照組與胃癌組中的頻率分別為93.0%，5.0%，2.0%及89.0%，10.0%，1.0%，兩組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律。經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，COX-2基因SNP rs3218625與胃癌的發(fā)生相關(guān)，其中GA基因型攜帶者胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯升高(P＜0.05)，見表2。

圖1 SNPrs3218625PCR產(chǎn)物酶切后電泳圖(胃癌組)

表2 兩組COX-2 SNP rs3218625基因型的分布及其與胃癌的關(guān)系

3 討論

河北地區(qū)胃癌患病率46.29/10萬，胃癌的發(fā)生與遺傳、飲食和環(huán)境有關(guān)，且其中具有胃癌家族史人群的患病率是正常健康人群的3倍。目前有關(guān)張家口地區(qū)人群胃癌發(fā)生相關(guān)危險(xiǎn)因素方面的研究還未見報(bào)道。COX-2基因是腫瘤患者靶向治療的候選基因之一，其過度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的過度增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，COX-2基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[8-9]。另外，張子房等[10]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中COX-2基因的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織；國外研究也證實(shí)，胃癌發(fā)病至轉(zhuǎn)移期間COX-2基因均呈高表達(dá)狀態(tài)，COX-2基因異常高表達(dá)與胃癌進(jìn)展過程中腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、侵襲及轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)[11]。國外研究報(bào)道，COX-2基因與胃癌發(fā)生、發(fā)展具有重要關(guān)聯(lián)，是相關(guān)研究的候選基因，且目前靶向COX-2治療惡性腫瘤[12]，如食管癌、結(jié)腸癌等消化道腫瘤的研究已深入開展，并已取得一定的成效，COX-2基因有望成為預(yù)防、治療惡性腫瘤的基因靶點(diǎn)，成為今后腫瘤防治的研究方向。

本研究在進(jìn)一步從遺傳水平上研究胃癌患者COX-2高表達(dá)的原因。COX-2基因表達(dá)可刺激血管生成因子表達(dá)增多，促進(jìn)淋巴管、微血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長提供必需營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)提供了重要通道；COX-2基因表達(dá)還可增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶活性，提高腫瘤細(xì)胞與外基質(zhì)蛋白的黏附能力，利于浸潤、轉(zhuǎn)移及侵襲等惡性生物學(xué)行為的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)胃癌等惡性腫瘤的進(jìn)展；COX-2還可使腫瘤血管生成、胃黏膜厚度增加和疏松化、降低機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的局部免疫[13]。COX-2基因的啟動子區(qū)某些SNP可使基因表達(dá)上調(diào)，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。胃黏膜損傷、胃潰瘍、胃癌或癌前損傷患者病變組織中COX-2 mRNA及COX-2蛋白表達(dá)量顯著升高，對胃癌的發(fā)生中具有一定的作用[14]。COX-2基因包含10個外顯子及9個內(nèi)含子，SNP rs3218625位于第10外顯子，其G＞A改變導(dǎo)致氨基酸Gly轉(zhuǎn)變?yōu)锳rg，使該位點(diǎn)酶活性明顯增加[15]。此外，已有研究報(bào)道，COX-2基因SNP rs3218625 G＞A這一多態(tài)性與中國人群食道癌的發(fā)生密切相關(guān)，其中AG基因型可明顯增加食道癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[16]。因此本研究以COX-2基因的SNP rs3218625 G＞A為研究位點(diǎn)，并與本地域人群一般資料相結(jié)合，從分子遺傳水平分析胃癌患者COX-2高表達(dá)的原因。本研究結(jié)果顯示，COX-2 SNP rs3218625有3種基因型分別為GG、GA、AA，其在對照組及胃癌組中的頻率分別為93.0%、5.0%、2.0%及89.0%、10.0%、1.0%，兩組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律，經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，COX-2基因SNP rs3218625與胃癌的發(fā)生相關(guān)，其中GA基因型攜帶者胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯升高，與相關(guān)研究[17]結(jié)果相似，可能是由于SNP rs3218625 G＞A的改變導(dǎo)致了Arg的產(chǎn)生，使得酶活性增高，由于COX-2基因編碼區(qū)SNP不同，導(dǎo)致不同個體對環(huán)境中致癌物的敏感性不同，AG基因型可增大酶活，增強(qiáng)機(jī)體對對環(huán)境中致癌物的敏感性，因而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，張家口壩上地區(qū)人群COX-2基因SNP rs3218625與胃癌發(fā)生密切相關(guān)，其中SNP rs3218625基因型GA是胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。

[1] Sang HK,Choi SI,Won KY,et al.Distinctive interrelation of p53 with SCO2,COX,and TIGAR in human gastric cancer[J].Pathology Research&Practice,2016,212(10):904-910.

[2]Saberi S,Talebkhan Y,Esmaili M,et al.The amplification of gastric cancer risk by carrying multiple functional SNPs in inflammation-associated cytokine genes[J].Helicobacter,2014,19(Suppl.1):93.

[3]伍冬梅,李春鳴.Bcl-2、Bax在胃癌及胃癌前病變中的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,37(2):201-203.

[4] Lu X,Chen F,Liu X,et al.Detection and clinical significance of COX-2 gene SNPs in gastric cancer[J].Cell Biochemistry and Biophysics,2015,72(3):1-4.

[5]Melo CFVD,Gigek CO,Silva JND,et al.Association of COX2,gene hypomethylation with intestinal type gastric cancer in samples of patients from northern Brazil[J].Tumor Biology,2014,35(2):1107.

[6]陳美霓,郭浩,郭巍,等.COX-2蛋白和VEGF-C蛋白在胃癌和非胃癌黏膜病變組織中的表達(dá)及臨床意義[J].海南醫(yī)學(xué),2015,26(18):2671-2674.

[7]Lu X,Chen F,Liu X,et al.Detection and clinical significance of COX-2 gene SNPs in gastric cancer[J].Cell Biochemistry and Biophysics,2015,72(3):657-660.

[8]彭丹若.Lgr5、CD44v6、COX-2及Ki-67在胃癌組織中的表達(dá)及意義[D].遵義:遵義醫(yī)學(xué)院,2014.

[9]He W T,Liu T,Tang X F,et al.The COX-2-765 G＞C polymorphism is associated with increased risk of gastric carcinogenesis in the Chinese Hui ethnic population[J].Asian Pacific Journal of Cancer PreventionApjcp,2014,15(9):4067.

[10]張子房,唐煒,尹江濤.環(huán)氧化酶-2、p53和Bcl-2在胃癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2009,6(17):12-15.

[11]Vanrees BP,Saukkonenk,RistimakiA,et al.Cyclooxygenase-2 expression during carcinogenesis in the human stomach[J].International Journal of Clinical and Experimental Pathology,2002,196(2):171-179.

[12]GasParini G,Longo R,Samriento R,et al.Inhibitors of cyelooxygenase-2:a new class of anticancer agents[J].Lancet Oncology,2003,4(10):605-615.

[13]呂曉君,毛曉韻,李錦毅,等.利用組織芯片技術(shù)研究COX-2在胃癌中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系[J].世界華人消化雜志,2006,14(6):550-556.

[14]黃冠男,姜相君.單核苷酸多態(tài)性與胃癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J].國際消化病雜志,2014,34(3):201-202,214.

[15]高芳,魯林,秦金東,等.COX-2基因多態(tài)性與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)[J].腫瘤防治研究,2015,42(5):470-473.

[16]文靜,任孟軍,譚偉.亞洲人群環(huán)氧化酶-2基因多態(tài)性與胃癌關(guān)聯(lián)性的系統(tǒng)性回顧與Meta分析[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,41(6):609-613.

[17]陶梅,張玲霞,宋瑛,等.陜西地區(qū)環(huán)氧化酶-2基因的多態(tài)性、螺桿菌感染與胃癌易感性的關(guān)系[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(1):17-21.

Correlation of COX-2 genetic polymorphisms with incidence of gastric cancer in Bashang area of Zhangjiakou.

ZOU Jian-ping1,ZHANG Jian-jun1,MA Xiao-yan1,WANG Zhi-heng1,LI Lin-chen2,LIU Su-fang3.1.Emergency Department,the First Hospital of Zhangjiakou,Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,the First Hospital of Zhangjiakou,Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA;3.Wanquan Hospital of TCM,Wanquan 076250,Hebei,CHINA

Objective To explore the correlation of cyclooxygenase-2(COX-2)genetic polymorphisms with incidence of gastric cancer in Bashang area of Zhangjiakou.Methods A total of 200 residents who lived in Bashang area of Zhangjiakou for more than 10 years were selected from Jun.2015 to Jan.2017,including 100 healthy people(control group)and 100 patients with gastric carcinoma(gastric carcinoma group).Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism technique(PCR-RFLP)was applied to analyze the genetic typing of the two groups,and the correlation of single nucleotide polymorphism(SNP)rs3218625 of COX-2 with the risk of gastric cancer was analyzed by non-conditional logistic regression.Results The two groups showed no statistically significant difference in the proportion of subjects with age＜65 years(55.0%in the control group vs 58.0%in gastric carcinoma group),the proportion of males(70.0%vs 74.0%),and the proportion of subjects with continuous or occasional smoking history(47.0%vs 54.0%),P＞0.05.The proportion were 93.0%in the control group and 89.0%in gastric carcinoma group for GG of SNP rs3218625,5.0%and 10.0%for GA,2.0%and 1.0%for AA,and 7.0%and 11.0%for(AG+AA).Non-conditional logistic regression showed that COX-2 SNP rs3218625 was closely related with incidence of gastric cancer(OR=2.463,P=0.021).The higher the frequency of GA,the higher the risk of gastric cancer.Conclusion The COX-2 genetic polymorphisms can increase the risk of gastric cancer in Bashang area of Zhangjiakou,and the frequency of GA in SNP rs3218625 locus is a risk factor for gastric cancer.

Cyclooxygenase-2(COX-2);Single nucleotide polymorphism(SNP);Gastric cancer;Polymerase chain reaction(PCR)

R735.2

A

1003—6350（2017）19—3112—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.006

河北省2016年張家口市科學(xué)技術(shù)局與地震局項(xiàng)目(編號：1621049D)

鄒建平。E-mail：zoujianping17@163.com

2017-04-26)