干擾linc00152抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與侵襲

羅冬冬，彭 彪，羅愛萍，胡 骕，趙海林，李 丹

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科1、肝膽外科2，廣東 廣州 510095)

干擾linc00152抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與侵襲

羅冬冬1，彭 彪1，羅愛萍2，胡 骕1，趙海林1，李 丹1

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科1、肝膽外科2，廣東 廣州 510095)

目的 觀察干擾linc00152的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的增殖與侵襲情況。方法 培養(yǎng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，將U251細(xì)胞分為觀察組和對(duì)照組，觀察組轉(zhuǎn)染linc00152-shRNA，對(duì)照組轉(zhuǎn)染control-shRNA，采用qRT-PCR法檢測(cè)兩組U251細(xì)胞中l(wèi)inc00152 mRNA的表達(dá)，采用MTT法觀察兩組細(xì)胞增殖能力，侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果 qRT-PCR結(jié)果顯示，觀察組U251細(xì)胞中l(wèi)inc00152的mRNA表達(dá)量為(0.313±0.020)，明顯少于對(duì)照組的(1.017±0.082)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；MTT結(jié)果顯示，觀察組的U251細(xì)胞的OD值為(0.444±0.032)，少于對(duì)照組的(0.679±0.052)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組穿過基質(zhì)膠的U251細(xì)胞數(shù)量為(66.9±9.1)，明顯少于對(duì)照組的(146±12.2)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中敲低linc00152能抑制細(xì)胞的增殖與侵襲。

膠質(zhì)瘤；linc00152；增殖；侵襲

人腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，其中惡性膠質(zhì)瘤約占60%。手術(shù)結(jié)合放、化療是腦膠質(zhì)瘤治療的主要手段[1]。雖然目前隨著腫瘤治療研究的發(fā)展，腦膠質(zhì)瘤的診斷和治療不斷進(jìn)步，但其中位生存期仍沒有明顯提高，仍然只有手術(shù)后的9～12個(gè)月。因此，通過現(xiàn)代分子生物學(xué)手段闡明腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找腦膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)志物以及潛在的基因治療靶點(diǎn)，以便對(duì)膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行早期診斷、提高膠質(zhì)瘤患者療效、改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的突破口。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，不但在正常生理過程中發(fā)揮重要作用，而且也參與人類疾病如癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，已經(jīng)成為近期深入研究的熱點(diǎn)課題[2]。linc00152是lncRNA中的一個(gè)成員之一，有研究報(bào)道，linc00152在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)并且與腫瘤的發(fā)展及患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)[3]，然而其在膠質(zhì)瘤的作用至今仍未見報(bào)道。本研究觀察了干擾linc00152的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的生長(zhǎng)與侵襲情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，linc00152-shRNA與control-shRNA由Invitrogen公司設(shè)計(jì)構(gòu)建，RNA抽提試劑盒購(gòu)于Applied Biosystems公司，MTT粉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Transwell小室購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 linc00152-shRNA轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組 培養(yǎng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，將U251細(xì)胞分為觀察組與對(duì)照組，按2 mL細(xì)胞懸液/孔接種于6孔板中，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)50%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。觀察組轉(zhuǎn)染linc00152-shRNA，對(duì)照組轉(zhuǎn)染control-shRNA。用滅菌無酶水稀釋linc00152-shRNA與control-shRNA質(zhì)粒干粉，按說明配制成100 pmol/L溶液質(zhì)粒備用。用不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋5 μ L的lipofecta-min2000，兩者分別混勻并室溫孵育5 min后加入6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 消化上述兩組細(xì)胞，取200 μL即5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后取出加20 μL MTT液/孔，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出加150 μL二甲基亞礬(DMSO)液/孔，低速振蕩10 min，選擇波長(zhǎng)為570 nm，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室中鋪加適量基質(zhì)膠稀釋液，過夜并成膜。在上述兩組細(xì)胞中分別取100μL即含1×105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞稀釋液接種至Transwell小室的上室，取500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液加至Transwell小室的下室，放置在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出來，用棉簽擦棄小室上腔殘存的細(xì)胞，滴加磷酸鹽緩沖液(PBS)輕洗兩遍，再放置在4%多聚甲醛中浸泡5 min，以固定小室背面細(xì)胞，結(jié)晶祡染色背面細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）液洗，倒置，晾干。光學(xué)顯微鏡下觀察并攝相，隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組U251細(xì)胞中l(wèi)inc00152的表達(dá)比較 qRT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組U251細(xì)胞中l(wèi)inc00152的mRNA表達(dá)量為(0.313±0.020)，與對(duì)照組的(1.017±0.082)比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.987，P＜0.01)。

2.2 兩組U251細(xì)胞增殖能力比較 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的U251細(xì)胞的OD值為(0.444±0.032)，與對(duì)照組的(0.679±0.052)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.215，P＜0.05)。

2.3 兩組U251細(xì)胞侵襲能力比較 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組穿過基質(zhì)膠的U251細(xì)胞數(shù)量為(66.9±9.1)，與對(duì)照組的(146±12.2)比較，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.318，P＜0.01)，見圖1。

圖1 linc00152-shRNA對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲能力的影響（×100）

3 討論

近年來基因組研究證明幾乎所有的人類基因組都轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生大量的非編碼RNA[2]，廣泛參與人體生理、病理活動(dòng)。lncRNA在腫瘤中的差異性表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并且可能是腫瘤預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，因此具有極為重要的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值，有望成為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物及治療的分子靶點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)與膠質(zhì)瘤相關(guān)的多個(gè)lncRNA中有l(wèi)ncRNA ZEB1-AS1和SPRY4-IT1可作為膠質(zhì)瘤的預(yù)后分子，并且能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[3]；LincRNA MALAT1可通過抑制ERK/AKT信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)與侵襲[4]；LincRNA NEAT1通過調(diào)控miR-499B-5P/C-Met軸調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。這些lncRNA與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖、復(fù)發(fā)、診斷治療及預(yù)后均有著一定的相關(guān)性。隨著對(duì)IncRNA功能研究的不斷深入，IncRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究雖取得了矚目的成果，然而大多數(shù)lncRNA的研究仍處于起始階段，其生物學(xué)功能及分子調(diào)控機(jī)制不明。前期研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)linc00152在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)。為進(jìn)一步明確linc00152在人膠質(zhì)瘤中的作用，本次研究首先通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將linc00152-shRNA轉(zhuǎn)于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中，以敲低該細(xì)胞中l(wèi)inc00152的表達(dá)水平。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)觀察組linc00152的mRNA水平較對(duì)照組均明顯下調(diào)，提示轉(zhuǎn)染成功。接下來進(jìn)一步采用MTT法、侵襲實(shí)驗(yàn)明確其對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251增殖與侵襲的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中敲低linc00152后，細(xì)胞的增殖明顯下降。而侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中敲低linc00152后，細(xì)胞的侵襲作用亦明顯減弱。

綜上所述，在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中敲低linc00152能抑制細(xì)胞的增殖與侵襲，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本項(xiàng)目以前期的重要發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，將進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、臨床標(biāo)本等方面深入研究linc00152在膠質(zhì)瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)、耐藥中的作用，為鑒定膠質(zhì)瘤耐藥、復(fù)發(fā)及預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物以及開發(fā)提高膠質(zhì)瘤化療敏感性的治療方法奠定基礎(chǔ)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1]Wang HX,Xu T,Jiang Y,et al.The challenges and the promise of molecular targeted therapy in malignant gliomas[J].Neoplasia,2015,17(3):239-255.

[2]Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CACancer J Clin,2011,61(4):212-236.

[3]Lv QL,Hu L,Chen SH,et al.A long noncoding RNA ZEB1-AS1 promotes tumorigenesis and predicts poor prognosis in glioma[J].International Journal of Molecular Sciences,2016,17(9):1431.

[4]Han Y,Wu Z,Wu T,et al.Tumor-suppressive function of long noncoding RNA MALAT1 in glioma cells by downregulation of MMP2 and inactivation of ERK/MAPK signaling[J].Cell Death&Disease,2016,7(3):e2123.

[5]Zhen L,Yunhui L,Hongyu D,et al.Long noncoding RNA NEAT1 promotes glioma pathogenesis by regulating miR-449b-5p/c-Met axis[J].Tumour Biology,2016,37(1):1-11.

Interference with linc00152 can inhibit glioma cell growth and invasion.LUO Dong-dong1,PENG Biao1,LUO

Ai-ping2,HU Su1,ZHAO Hai-lin1,LI Dan1.Department of Neurosurgery1,Department of Hepatobiliary Surgery2,Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA

Objective To observe the growth and invasion of human glioma cell line U251 interfered with linc00152.Methods Cultured glioma U251 cells were divided into the observed group and the control group.The observed group was transfected with linc00152-shRNA,and the control group was transfected with control-shRNA.The expression of linc00152 mRNA in U251 cells of the two groups was detected by quantitative reverse transcription-PCR(qRT-PCR)method.Tetrazolium-based colorimetric(MTT)assay was used to observe the proliferation ability of cells in the two groups.The invasive ability of the two groups cells was detected by invasion assay.Results QRT-PCR results showed that the expression of linc00152 mRNA of U251 cells in the observed group was(0.313±0.020),which was significantly lower than(1.017±0.082)in the control group(P＜0.01).MTT results showed that the OD value of U251 cells in the observed group was(0.444±0.032),which was significantly less than(0.679±0.052)in the control group(P＜0.05).Invasion assay results showed that the number of U251 cells passing through the matrix glue in the observed group was(66.9±9.1),which was significantly less than(146±12.2)in the control group(P＜0.01).Conclusion The knockdown of linc00152 in human glioma cell line U251 can inhibit cell proliferation and invasion.

Glioma;Iinc00152;Proliferation;Invasion

R730.264

A

1003—6350（2017）19—3097—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.001

廣東省廣州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目；廣州醫(yī)科大學(xué)科研基金（編號(hào)：2015C39）

羅冬冬。E-mail：865656249@qq.com

2017-03-26)