混合型雞馬立克病的鑒別及綜合診斷

孫青松 ， 劉志剛 ， 劉明遠(yuǎn) ， 李國江

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點實驗室 ， 吉林 吉林 132101 ；3.安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ， 安徽 安慶 246011 ； 4.吉林大學(xué)人獸共患病研究所教育部重點實驗室 ， 吉林 長春 130062)

混合型雞馬立克病的鑒別及綜合診斷

孫青松1,2， 劉志剛3， 劉明遠(yuǎn)4， 李國江1,2

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點實驗室 ， 吉林 吉林 132101 ；3.安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ， 安徽 安慶 246011 ； 4.吉林大學(xué)人獸共患病研究所教育部重點實驗室 ， 吉林 長春 130062)

為了對吉林某土雞養(yǎng)殖場發(fā)生大規(guī)模的腫瘤性疾病進(jìn)行診斷，經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀檢查、病理剖檢及組織學(xué)觀察，初步診斷為禽白血病和雞馬立克??；進(jìn)行實驗室鑒別診斷，設(shè)計特異性引物，利用PCR方法，經(jīng)過BLAST序列比對，實驗結(jié)果確定該病為雞的馬立克病，而且同時表現(xiàn)出4種混合型的臨床癥狀。

雞馬立克病 ； 混合型 ； 鑒別 ； 綜合診斷

雞馬立克病(MD)是一種雞的高度接觸性淋巴組織增生性傳染病，以外周神經(jīng)、性腺、虹膜、各種內(nèi)臟器官、肌肉和皮膚的單核性細(xì)胞浸潤和腫瘤形成為特征，引起該病的病原為皰疹病毒馬立克氏病毒(MDV)。馬立克病根據(jù)發(fā)病的部位可分為內(nèi)臟型、神經(jīng)型、眼型和皮膚型，其中又以內(nèi)臟型死亡率最高，臨床上常見混合性感染的病例。

馬立克病常用的檢測方法有臨床癥狀檢查、病理解剖學(xué)分析以及瓊脂擴(kuò)散試驗等。近年來，該病的分子生物學(xué)診斷技術(shù)也取得了一定的進(jìn)展。PCR診斷技術(shù)包括實時PCR、定量PCR、致瘤株特異性PCR、多重PCR等新技術(shù)為該病的流行病學(xué)調(diào)查、病毒在各組織器官的分布以及與其他腫瘤病毒多重感染的診斷等作出了貢獻(xiàn)[1-2〗。

2016年4月吉林某土雞養(yǎng)殖場發(fā)生大規(guī)模的腫瘤性疾病，經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查、臨床觀察、病理解剖以及實驗室檢驗，確定該病為雞的混合型馬立克病。

1 流行病學(xué)調(diào)查

某土雞散養(yǎng)場引種3 000只，自2月齡開始發(fā)病，開始少量死亡，后來陸續(xù)發(fā)病死亡，母雞死亡率大于公雞，至4月齡已死亡1 245只，死亡率41.5%，發(fā)病期間曾使用過多種抗生素和抗病毒中藥進(jìn)行治療，效果不理想。據(jù)養(yǎng)殖戶介紹此批雞種購自不同的農(nóng)戶，來源比較分散，有的農(nóng)戶引種時已注射過馬立克病毒疫苗，有的農(nóng)戶則未免疫該疫苗。

2 臨床癥狀和病理剖檢

病雞精神委靡，食欲不振，羽毛松亂，常扎堆，拉黃白色稀糞，雞冠顏色發(fā)紺(見中插彩版圖1A)；多數(shù)雞表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)肢體癱瘓，并有“劈叉狀”姿勢，臥于一側(cè)，手觸摸病雞脫水，極度消瘦(見中插彩版圖1B)；部分雞只肉髯、雞冠部分有小米粒至黃豆大小的白色或黃色腫瘤結(jié)節(jié)，眼睛出現(xiàn)渾濁發(fā)白(見中插彩版圖1C)；翻開羽毛，在背部、腹部及大腿肌肉的皮膚處亦有腫瘤結(jié)節(jié)(見中插彩版圖1D、1E)。

病理剖檢可見多種臟器出現(xiàn)腫瘤，腫瘤多呈結(jié)節(jié)性，形狀不規(guī)則，數(shù)量不等，大小不一，略突出于臟器表面，灰白色，切面呈脂肪樣。有腫瘤的臟器主要集中在心臟(見中插彩版圖1F)、脾臟(見中插彩版圖1G)、腺胃(見中插彩版圖1H)、肝臟(見中插彩版圖1I)、腸道及肌胃等處。部分病例肝臟腫大，外觀似“啃咬狀”，表面不具有結(jié)節(jié)性樣腫瘤，呈灰白色壞死灶，向臟器里面凹陷，肝臟表面凹凸不平(見中插彩版圖1I)。腸道內(nèi)膜增生，可見大小不等腫瘤性結(jié)節(jié)。腺胃外觀不規(guī)則，切開后可見不同大小的結(jié)節(jié)(見中插彩版圖1H)。

3 病理組織學(xué)檢查

采取病變部位制作石蠟組織切片，H.E.染色后，顯微鏡下觀察組織的病理學(xué)變化。結(jié)果顯示，皮膚下聚集大量淋巴樣的細(xì)胞及中央壞死灶(見中插彩版圖2A)，腺胃黏膜下及復(fù)管腺浸潤大量的腫瘤細(xì)胞(見中插彩版圖2B)，肝組織間腫瘤細(xì)胞局灶性分布(見中插彩版圖2C)，脾臟內(nèi)腫瘤細(xì)胞聚集成團(tuán)，中央出現(xiàn)壞死灶(見中插彩版圖2D)，腸黏膜下層可見大量的腫瘤細(xì)胞浸潤(見中插彩版圖2E)，腎間質(zhì)散在大量的腫瘤細(xì)胞(見中插彩版圖2F)。

4 實驗室檢驗

無菌取病雞的肝臟、脾臟等器官進(jìn)行處理后提取基因組，用設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的引物如下(鑒于是腫瘤性疾病，所以同時對白血病病毒進(jìn)行了PCR檢測)：MDV-F：5′-ATGCGATGAAAGTGCTATGGAG-3′，MDV-R：5′-ATCCCTATGAGAAAGCGCTTGA-3′，ALV-F：5′-GGATGGTGGCTGACTGTGT-3′，ALV-R：5′-CGAACCAAAGGTAACACACG-3′。

擴(kuò)增體系為50 μL，其中去離子水28.5 μL，5×Primestar-DNA聚合酶緩沖液10 μL，dNTP 4 μL，primer 1和primer 2各1μL，模板DNA 5 μl，Primestar-DNA聚合酶0.5 μL；擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后取PCR產(chǎn)物4 μL，在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，按照回收試劑盒說明書對產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，可得到一條314 bp的目的條帶，MDV呈陽性(圖3)，白血病病毒結(jié)果為陰性；測序結(jié)果顯示，經(jīng)BLAST比對后證實檢測到的病毒為MDV(gb[HQ149526.1])。

圖3 馬立克病毒PCR檢測結(jié)果

5 討論

在雞群中，淋巴細(xì)胞白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥及馬立克病均可引起腫瘤的發(fā)生，雖然自20世紀(jì)60年代末火雞皰疹病毒疫苗用于生產(chǎn)后，已使得馬立克病的發(fā)生得到了一定控制[3]，但由于馬立克病病毒毒力的不斷增強(qiáng)以及疫苗免疫不當(dāng)?shù)仍颍沟妹庖唠u群中的馬立克病仍時有暴發(fā)，這給該病的防治又帶來了新的挑戰(zhàn)。目前，防治馬立克病的重要措施仍是科學(xué)使用疫苗，而保持良好的環(huán)境衛(wèi)生和培育抗馬立克病的新品系雞群也具有重要作用。疫苗接種后，最早7 d后才能產(chǎn)生堅強(qiáng)的免疫保護(hù)力，在接種后到產(chǎn)生免疫保護(hù)力之前應(yīng)特別注意嚴(yán)防環(huán)境污染，以免造成雞群早期感染馬立克病病毒強(qiáng)毒而造成發(fā)病[4]。馬立克病病毒主要是通過水平傳播，尚無垂直傳播的有力證據(jù)[5]，因此，防止環(huán)境的病毒污染，避免雛雞早期感染最為重要，除定期消毒外，執(zhí)行雞群“全進(jìn)全出”飼養(yǎng)模式也很必要。防治馬立克病的同時，加強(qiáng)對其他免疫抑制性疫病的檢測和防治，可以更好地提高疫苗的免疫效果。

本次雞馬立克病的暴發(fā)可能有以下原因：第一個重要原因就是育雛雛雞來源于不同的養(yǎng)殖戶，疫苗接種不統(tǒng)一，而且個別養(yǎng)殖戶可能會忽視免疫疫苗的程序，或者免疫方法不當(dāng)沒有起到免疫保護(hù)的作用，這樣就會極大增加了該病的發(fā)病率。二是此次暴發(fā)的馬立克病同時表現(xiàn)了內(nèi)臟型、神經(jīng)型、眼型和皮膚型4種混合感染，這種現(xiàn)象并不多見，其中又以內(nèi)臟型死亡率最高，推測該病原毒株可能為強(qiáng)毒株，毒力強(qiáng)，致病作用明顯，而且傳播可能更迅速。三是由于飼養(yǎng)管理不到位，疫病防范意識差，導(dǎo)致該病的發(fā)生。因此應(yīng)加強(qiáng)該病的防疫工作，選擇合適的疫苗和科學(xué)合理的免疫程序，此外，對于大部分散養(yǎng)戶來說，選擇合適的種源也至關(guān)重要。

本次病例是雞馬立克病4種臨床發(fā)病型的混合，4種癥狀同時出現(xiàn)這是并不多見的。疫病發(fā)生后，快速準(zhǔn)確的診斷可以幫助養(yǎng)殖場確定最佳的治療或處理方案，最大程度的減少養(yǎng)殖戶的損失，本文通過流行病學(xué)調(diào)查，臨床病理變化觀察，實驗室檢驗等方法對該病暴發(fā)進(jìn)行了鑒別診斷，為臨床生產(chǎn)解決實際問題提供借鑒和參考，從而有效的防控馬立克病的發(fā)生。

[1] 丁家波.馬立克氏病病毒pp38基因及其上游雙向啟動子的生物學(xué)特性[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[2] 龔振華，胡國明，蔣文明,等.我國馬立克氏病研究進(jìn)展[J].中國動物檢疫，2012，29 (7)：63-65.

[3] Gong Z, Zhang L, Wang J,etal. Isolation and analysis of a very virulent Marek’s disease virus strain in China[J]. Virol J，2013, 5(10): 155.

[4] Tian M，Zhao Y，Lin Y,etal. Comparative analysis of oncogenic genes revealed unique evolutionary features of field Marek’s disease virus prevalent in recent years in China[J]. Virol J， 2011, 8: 121-131.

[5] Geerlig S H, Quan Z S, Suurl,etal. Efficacy and safety of cell associated vaccines against Marek′ s disease virus grown in a continuous cell line from chickens[J]. Vaccine, 2008, 26(44)：55-56.

IdentificationandComprehensiveDiagnosisofHybridChickenMarek’sDisease

SUN Qing-song1,2， LIU Zhi-gang3， LIU Ming-yuan4， LI Guo-jiang1,2

(1.Jilin Agricultural Science and Technology University，Jilin 132101, China;2.Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province， Jilin 132101, China;3.College of Life Sciences，Anqing Normal University，Anqing 246011，China；4.Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonoses , Jilin University，Changchun 130062，China)

A big-scale neoplastic diseases broke out in Jilin native farms, and we preliminarily diagnosed the disease as Marek’s disease or Avian leukosis by epidemiological survey, clinical examination, pathologic autopsy and histological observations. And then we confirmed that the disease was Chicken Marek’s disease by laboratory diagnosis using PCR. Meanwhile the disease showed the clinical symptoms of 4 kinds of hybrids.

Marek’s Disease ； Hybrid ； Identification ； Comprehensive Diagnosis

LI Guo-jiang

S858.31

A

0529-6005(2017)08-0029-03

2016-10-28

吉林市科技發(fā)展計劃資助項目(20166034)；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院博士啟動基金項目(吉農(nóng)院合字2015第243號)；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子基金項目(吉農(nóng)院合字2016第Z01號)；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校級重點學(xué)科培育項目(吉農(nóng)合字2015第X055號)

孫青松(1982-)，男，講師，博士,主要從事動物疫病方面的研究，E-mail：sqswjy@163.com 劉志剛(1984-)，男，講師，碩士，主要從事動物疾病防治的研究，E-mail：xiaozhubingbingxue@ 163.com

注：劉志剛與孫青松對本文具有同等貢獻(xiàn)

李國江，E-mail：jlliguojiang@126.com