• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    運(yùn)動(dòng)對成長期骨骼肌神經(jīng)源性誘導(dǎo)因子Agrin及其受體MuSK表達(dá)的影響

    2017-10-22 11:46:10安楠
    關(guān)鍵詞:成長期周齡發(fā)育

    安楠

    國家體育總局運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所(北京 100061)

    神經(jīng)肌肉連接(neuromuscular junction,NMJ)是完成神經(jīng)肌肉間信號傳遞、實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn),NMJ的發(fā)育從胚胎期開始,在出生后的一段時(shí)間內(nèi)完成結(jié)構(gòu)和功能的成熟。迄今為止,Agrin-MuSK信號通路是已知最清晰的誘導(dǎo)NMJ發(fā)育的信號途徑。Agrin即集聚蛋白,1990年McMahan提出位于NMJ間隙的神經(jīng)源性因子Agrin對誘導(dǎo)NMJ分化、促進(jìn)n型乙酰膽堿受體(n-AchR)聚集和穩(wěn)定起重要作用。Agrin在腦組織、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、肌纖維和Schwann細(xì)胞中都有表達(dá),但僅神經(jīng)元表達(dá)的異構(gòu)體具有高度特異的nAchR聚集活性[1]。Agrin經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突釋放后結(jié)合于肌細(xì)胞膜,在此與其受體結(jié)合,可以使n-AchR亞基酪氨酸發(fā)生磷酸化,這可能是誘導(dǎo)n-AchR聚集的關(guān)鍵[2]。肌特異性受體酪氨酸激酶(muscle sPecific ki?nase,MuSK)則是一種跨膜n-AchR耦聯(lián)酪氨酸激酶,選擇性地由發(fā)育中的骨骼肌細(xì)胞表達(dá)并聚集在突觸后膜上,1995年由Valenzuela等分離。MuSK能被Agrin快速磷酸化,研究已證實(shí)它是Agrin受體復(fù)合物的重要組成成分[3]。只有當(dāng)MuSK被Agrin激活后,才啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致一系列蛋白磷酸化,促使 n-AchR發(fā)生聚集,這一過程受正反饋調(diào)節(jié)[4]。

    Agrin和MuSK對NMJ的發(fā)育和運(yùn)動(dòng)功能成熟起重要作用。研究表明,上述過程是在運(yùn)動(dòng)因素的誘導(dǎo)下,由神經(jīng)元和肌細(xì)胞同時(shí)釋放因子,交互信號,共同誘導(dǎo)完成的[5]。已知運(yùn)動(dòng)可以促使NMJ形態(tài)增大、結(jié)構(gòu)成分增多、突觸傳遞功能增強(qiáng),以適應(yīng)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷增加的需要[6];另一方面,肌肉廢用后 NMJ也出現(xiàn)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上的退化,機(jī)制尚不清楚[7]。關(guān)于NMJ發(fā)育和成熟的機(jī)制一直是國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn),研究大部分集中在有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制方面[8],而對NMJ在出生后早期的發(fā)育規(guī)律以及運(yùn)動(dòng)因素的調(diào)控作用關(guān)注不多。本研究從體育科學(xué)的角度出發(fā),研究Agrin及MuSK在成長期的表達(dá)規(guī)律及其在運(yùn)動(dòng)干預(yù)下的變化,可以有助于解釋NMJ的發(fā)育過程及運(yùn)動(dòng)促進(jìn)NMJ發(fā)育的機(jī)制,對于早期發(fā)展運(yùn)動(dòng)能力有一定的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

    1 對象和方法

    1.1 研究對象

    出生18天的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠130只,體重50.1±6.9 g,購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(軍)2009-018,大鼠飼養(yǎng)和取材均在國家體育總局體育科學(xué)研究所SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行,動(dòng)物使用許可證號:SYXK(京)2011-030。

    實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對照組、運(yùn)動(dòng)組和懸吊組,其中對照組50只,運(yùn)動(dòng)組和懸吊組各40只。對照組常規(guī)飼養(yǎng),3周齡時(shí)取材10只。運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),運(yùn)動(dòng)負(fù)荷從8 m/min、20 min/d開始,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間交替增加,至8周齡時(shí)達(dá)42 m/min、60 min/d,每天運(yùn)動(dòng)1次,每周運(yùn)動(dòng)6天。懸吊組采用尾部懸吊造成后肢懸空去負(fù)荷,設(shè)置懸吊組的目的是為了減少大鼠日常活動(dòng)對神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)刺激。各組在飼養(yǎng)至4周齡、5周齡、6周齡、8周齡時(shí)分別取材10只,按0.3 ml/100 g體重劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉,迅速分離出腓腸肌于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗,濾紙吸干,置液氮速凍待測。

    1.2 研究方法

    應(yīng)用熒光定量PCR法(RT-PCR)測定Agrin及其受體MuSK轉(zhuǎn)錄水平;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定MuSK蛋白水平。

    1.2.1 RT-PCRT

    所有引物均先由GNEBANK查詢mRNA序列,用Primer軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),上海生工生物工程有限公司合成(見表1)。

    表1 Agrin和MuSK引物序列

    提取組織RNA:取腓腸肌組織0.1g,迅速加入液氮研磨至粉末狀;加入1 mlMylab通用型RNA快速提取試劑充分混合,室溫放置成溶液,加入50 μl無RNase水,溶解RNA。加氯仿0.25 ml,13000 rpm離心5 min,取上清750 μl,加等體積異丙醇-20℃沉淀核酸,離心取沉淀,75%乙醇洗滌,加DEPC水溶解。用DN?ase I消化樣品RNA中的DNA(見表2),電泳可見5S、18S、28S的清晰條帶。

    表2 DNA消化步驟

    反轉(zhuǎn)錄(25 μl反應(yīng)體系):取RNA樣品3 μg,加Oligo Dt T18(50M)2.5 μl,加 DEPC 水至 25 μl,混勻。70℃ 5 min,立即冰浴,然后在反應(yīng)體系中依次加入 5×buffer 8 μl,dNTP(10 mM)4 μl,RNase Inhibitor(MBI)1 μl,混勻,37℃ 5 min;再加入M-MuLV(MBI)2 μl,于42℃ 60 min,70℃ 10 min。

    PCR檢測:向PCR管中分別加入不含染料2′qP?CR TaqMix 12.5 μl,10 μM 各基因正反向引物混合物0.5 μl,對應(yīng)的cDNA各1 μl,其中一管不加模板用作陰性對照,各管補(bǔ)加水至25 μl?;靹颍糜赟LAN熒光定量PCR儀中。95℃ 5 min,55℃ 15 s,65℃ 35 s(熒光檢測),40循環(huán),獲得擴(kuò)增曲線。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入公式計(jì)算2-△△Ct值進(jìn)行相對定量計(jì)算。

    1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

    稱取一定重量的腓腸肌組織,加入液氮研磨成粉末,加入對應(yīng)體積的0.1 MPBS制成10%組織勻漿,二次凍融破膜,混勻,5000 rpm離心5 min,取上清液。按產(chǎn)品說明6次倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,取標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品各100 μl,加入酶標(biāo)孔底部,混勻,覆膜,37℃ 120 min;棄去液體,每孔加檢測溶液 A100 μl,37℃ 60 min;棄去液體,洗板2 min×3次,每孔加檢測溶液B100 μl,37℃ 60 min;棄去液體,洗板2 min×5次;每孔加底物溶液90 μl,37℃避光30 min,每孔加入終止液50 μl,終止反應(yīng);立即在酶標(biāo)儀上450 nm波長讀取各孔OD值。

    1.3 主要儀器和試劑

    Takara TP600型梯度PCR儀(日本);SLAN雙通道熒光定量PCR儀(上海);JY-SP-B型電泳槽(北京);JY02S型凝膠紫外分析儀(北京);Mylab通用型RNA快速提取試劑盒(美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司,中國);MMuLV反轉(zhuǎn)錄酶:200μ/μl,F(xiàn)ermentas(MBI公司,美國);RNase Inhibitor:40μ/μl,F(xiàn)ermentas(MBI公司,美國)。大鼠組織MuSK試劑盒(UCL.co美國);酶標(biāo)儀(北京)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Multivariate Analysis檢驗(yàn)周齡和運(yùn)動(dòng)因素對指標(biāo)影響的顯著性,0ne-way ANOVA比較均值差異顯著性,顯著性水平取P<0.05,非常顯著性水平取P<0.01。

    2 結(jié)果

    2.1 成長期及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌Agrin及MuSK mRNA相對表達(dá)量

    表3顯示,周齡因素和運(yùn)動(dòng)干預(yù)對Agrin mRNA表達(dá)水平均有顯著影響(P<0.01)。正常發(fā)育下,Agrin mRNA在4周齡組較3周齡組表達(dá)減少(P<0.01),5周齡再次出現(xiàn)表達(dá)高峰(P<0.01),之后降低(P<0.01),至8周齡時(shí)未檢測到表達(dá);運(yùn)動(dòng)干預(yù)下,運(yùn)動(dòng)組和懸吊組5~8周齡的Agrin mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)均高于對照組的趨勢(P<0.01)。

    表3 成長期及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌Agrin mRNA相對表達(dá)量(n=8)

    表4顯示,周齡因素和運(yùn)動(dòng)干預(yù)對MuSK mRNA表達(dá)水平均有顯著影響(P<0.01)。正常發(fā)育下,MuSK mRNA在4周齡時(shí)表達(dá)水平顯著低于3周齡組(P<0.01),5周齡時(shí)未檢測到表達(dá),6周齡以后再次出現(xiàn)表達(dá)增多(P<0.01),且持續(xù)到8周齡(P<0.05);運(yùn)動(dòng)干預(yù)下,運(yùn)動(dòng)組MuSK mRNA表達(dá)水平在5周齡時(shí)顯著高于對照組(P<0.01),其他周齡組與對照組無顯著差異;懸吊組MuSK mRNA表達(dá)水平在各周齡組均顯著低于同齡對照組(6周齡P<0.05;4周齡、8周齡均P<0.01)。

    表4 成長期及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌MuSK mRNA相對表達(dá)量(n=8)

    2.2 成長期及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌MuSK蛋白水平

    表5 顯示,MuSK蛋白水平與其mRNA水平變化規(guī)律基本一致;在運(yùn)動(dòng)干預(yù)下,各周齡運(yùn)動(dòng)組MuSK蛋白水平均顯著高于對照組(5周齡、6周齡、8周齡均P<0.05);懸吊組MuSK蛋白水平則在各周齡組均呈現(xiàn)出低于同齡對照組的趨勢(4周齡P<0.05)。

    表5 成長期及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌MuSK蛋白水平(n=8,U/L)

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)源性誘導(dǎo)因子Agrin及其受體MuSK在成長期骨骼肌的表達(dá)具有一定的時(shí)間規(guī)律:Agrin mRNA在出生4周齡較3周齡表達(dá)水平顯著下降(P<0.01),MuSK作為其受體,在出生4周后mRNA表達(dá)水平下降(P<0.01),根據(jù)以往文獻(xiàn),推測Agrin在大鼠出生后3周齡(離乳)以前具有一次表達(dá)高峰。Agrin廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),對各類神經(jīng)組織的分化成熟均具有重要作用,已證明Agrin在其他神經(jīng)組織中的表達(dá)具有一定的時(shí)間規(guī)律性,并且這種規(guī)律與該神經(jīng)組織的功能發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)。有研究觀察Agrin在成長期大鼠大腦皮層中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Agrin在發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)程度不同,總體表現(xiàn)為,Agrin在出生時(shí)表達(dá)很低,隨后迅速上升,出生第1周時(shí)達(dá)高峰,以后隨著發(fā)育的成熟Agrin表達(dá)逐漸降低,4周齡時(shí)大腦皮層中Agrin的表達(dá)接近于成年水平[4]。從NMJ發(fā)育的時(shí)間進(jìn)程分析,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)源性Agrin的最早表達(dá)時(shí)間應(yīng)該與胚胎期n-AchR(N型乙酰膽堿受體)的表達(dá)時(shí)間平行,即當(dāng)神經(jīng)末梢生長接觸到肌纖維表面時(shí),Agrin與MuSK結(jié)合,開始誘導(dǎo)肌纖維膜上廣泛表達(dá)的n-AchR聚集,功能性突觸連接在數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)中建立,Agrin在這一時(shí)期的表達(dá)水平最高,隨著n-AchR的聚集完成,Agrin表達(dá)水平開始下降,這一過程一直延續(xù)到出生以后[4]。由于NMJ主要在大鼠出生后3~4周內(nèi)完成nAchR亞基向成熟型和多神經(jīng)支配向單神經(jīng)支配轉(zhuǎn)換的重要過程,因此可以推論出生后至3周齡(離乳)是NMJ成熟的第一個(gè)重要階段,Agrin及其受體MuSK在這個(gè)階段出現(xiàn)表達(dá)高峰以配合這個(gè)過程。

    本研究還發(fā)現(xiàn),Agrin及其受體MuSK在大鼠5周齡后再次出現(xiàn)顯著的表達(dá)高峰,分析顯示這個(gè)峰值與周齡因素非常顯著相關(guān)(P<0.01)。大鼠5周齡相當(dāng)于青春期階段,已知n-AchR胚胎型γ-亞基在5周齡后的表達(dá)也有顯著增加[9],Agrin在同一時(shí)期的表達(dá)增高可能與誘導(dǎo)γ-n-AchR表達(dá)增多有關(guān),這個(gè)過程是與運(yùn)動(dòng)功能的增強(qiáng)相適應(yīng)的。Agrin作為誘導(dǎo)n-AchR排列和聚集的重要因子,可能誘導(dǎo)NMJ在青春期進(jìn)一步發(fā)育成熟。NMJ在青春期出現(xiàn)的發(fā)育高峰以神經(jīng)肌肉功能完善為主要過程,而結(jié)構(gòu)成分增長并不顯著,提示Agrin及其受體MuSK在此階段的表達(dá)增加可能更多地引起輔助蛋白合成的增加,通過提高NMJ結(jié)構(gòu)成分的排列密度,使運(yùn)動(dòng)終板上n-AchR的分布更加集中,從而適應(yīng)青春期逐漸過渡到成年期的運(yùn)動(dòng)需要。關(guān)于這一點(diǎn)還需要更多實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持。

    關(guān)于運(yùn)動(dòng)干預(yù)對Agrin和MuSK表達(dá)的影響,本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)的增多和減少都可以促進(jìn)Agrin更多地表達(dá)(P<0.01);但對于MuSK,只有運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促使其表達(dá)增加,抑制運(yùn)動(dòng)則會(huì)減少其表達(dá)。運(yùn)動(dòng)和懸吊作為運(yùn)動(dòng)刺激增強(qiáng)和減弱的兩個(gè)相反的方面,對NMJ神經(jīng)肌肉信號傳遞具有一定的調(diào)節(jié)作用。在NMJ功能發(fā)育的敏感期,運(yùn)動(dòng)需求的改變能夠迅速通過某種途徑將功能調(diào)整的信號傳遞到NMJ,進(jìn)而通過神經(jīng)肌肉之間的信號交換,引起突觸前、后成分的改變。一些由神經(jīng)和肌肉釋放的營養(yǎng)因子參與了這個(gè)過程,結(jié)果使NMJ結(jié)構(gòu)排列更加密集,從而提高神經(jīng)肌肉信號傳遞的效率。由于NMJ在發(fā)育成熟后其結(jié)構(gòu)成分的代謝率并不很高,提示成年后NMJ對運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)主要是通過電生理特性的改變實(shí)現(xiàn)的[10]。懸吊是神經(jīng)肌肉活動(dòng)減弱的過程,本研究中在運(yùn)動(dòng)減弱的情況下Agrin的表達(dá)也升高,這可能是機(jī)體為保持NMJ的結(jié)構(gòu)完整通過維持或提高自發(fā)性神經(jīng)肌肉沖動(dòng)而出現(xiàn)的一種代償反應(yīng)。結(jié)合MuSK的蛋白水平變化表明,減少運(yùn)動(dòng)時(shí)雖然機(jī)體試圖代償,但仍然會(huì)引起Agrin受體蛋白水平的降低,從而降低NMJ功能;同時(shí)也從相反的角度說明,日?;顒?dòng)作為一種運(yùn)動(dòng)刺激,同樣可以起到維持神經(jīng)肌肉功能的作用,但顯然運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的效果更為顯著。

    MuSK作為肌細(xì)胞膜上NMJ發(fā)育調(diào)節(jié)因子復(fù)合物的重要成分,其蛋白水平可以在一定程度上反映NMJ發(fā)育調(diào)控的程度。已知MuSK具有常規(guī)的受體絡(luò)氨酸激酶(RTK)特征,即含有1個(gè)信號肽,一個(gè)大的胞外域,1個(gè)跨膜域和1個(gè)胞漿域,其胞外域常常含有9個(gè)或10個(gè)氨基酸的插入,可能是由于MuSK mRNA被選擇剪輯而形成,這一胞外域結(jié)構(gòu)將與Agrin反應(yīng),使MuSK被快速磷酸化,從而介導(dǎo)nAchR的聚集[2]。近年來的研究不斷提出,MuSK對于肌纖維運(yùn)動(dòng)終板的發(fā)育影響更大,MuSK基因缺失鼠的肌細(xì)胞幾乎喪失所有突觸后分化的特征,n-AchR等蛋白成分不再聚集在NMJ處,而是均勻地分布在肌細(xì)胞表面,幾乎完全看不到n-AchR的聚集現(xiàn)象,提示肌細(xì)胞膜上的MuSK是比Agrin更關(guān)鍵的因子。從本研究測定的MuSK蛋白水平看,其隨周齡的變化基本與mRNA水平的變化趨勢一致,且運(yùn)動(dòng)組MuSK蛋白水平在各周齡組均顯著高于對照組(P<0.01),說明運(yùn)動(dòng)刺激能夠通過某種途徑影響MuSK的蛋白水平。在MuSK轉(zhuǎn)錄以后,運(yùn)動(dòng)刺激可能作為外因引起MuSK發(fā)生重要的蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換過程,將Agrin對NMJ發(fā)育的誘導(dǎo)信號向下傳遞。也就是說,MuSK的最終作用不僅受其轉(zhuǎn)錄水平影響,更與功能調(diào)節(jié)及修飾后的蛋白水平有關(guān),運(yùn)動(dòng)則可能是這個(gè)過程的主要決定因素,Ca2+和鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CaM)也可能參與了這個(gè)過程[11,12]。有研究顯示,低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(Low Density Lipoprotein Receptor-related Pro?tein,LRP)可能表達(dá)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元上,作為Agrin的直接受體參與調(diào)控[13],有學(xué)者提出Agrin-LRP4-MuSK是以兩分子四聚體的“8字環(huán)”形式存在,起到信息交互作用[14]。LRP4可能通過結(jié)合Agrin并激活MuSK,既促進(jìn)Agrin的簇集作用,又與MuSK結(jié)合成復(fù)合物做為突觸前分化的退行性信號,發(fā)揮雙向作用調(diào)節(jié)NMJ形成[15];后續(xù)在肌無力患者體內(nèi)陸續(xù)檢出抗LRP4抗體也進(jìn)一步證明了這一論點(diǎn)[16,17];LRP4在Agrin及MuSK受體復(fù)合物中可能起核心作用[18];載脂蛋白E(ApoE)作為大多數(shù)LRP4的配體,也可能在LRP4調(diào)控神經(jīng)組織發(fā)育中發(fā)揮作用[19,20]。關(guān)于運(yùn)動(dòng)干預(yù)下Agrin及其受體MuSK究竟如何受LRP4的調(diào)節(jié),以及是否通過Ca2+CaM及ApoE作用,尚需更深入的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。

    4 結(jié)論

    綜上所述,成長期骨骼肌Agrin及其受體MuSK的表達(dá)具有一定的時(shí)間規(guī)律,在大鼠出生3~4周(離乳)呈現(xiàn)減少趨勢,至5~6周(青春期)前后再次出現(xiàn)表達(dá)高峰,MuSK蛋白水平表現(xiàn)相應(yīng)的變化;在此期間進(jìn)行適當(dāng)負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促使Agrin及其受體MuSK更多地表達(dá),特別能使肌纖維膜上MuSK蛋白水平升高,這可能作為一種機(jī)制,促進(jìn)NMJ在成長期的發(fā)育,具體調(diào)控過程有待進(jìn)一步研究。

    猜你喜歡
    成長期周齡發(fā)育
    渝州白鵝剩余采食量測定及其與飼料利用效率相關(guān)性狀的相關(guān)分析
    申鴻七彩雉血液生化指標(biāo)和肌內(nèi)脂肪含量的測定及其相關(guān)性分析
    AB創(chuàng)新醫(yī)療科技企業(yè)成長期策略與思考
    中國市場(2021年34期)2021-08-29 03:25:48
    寧都黃公雞睪丸質(zhì)量與不同周齡第二性征的回歸與主成分分析
    孩子發(fā)育遲緩怎么辦
    中華家教(2018年7期)2018-08-01 06:32:38
    碳會(huì)計(jì)或?qū)㈤_啟“成長期”
    小微企業(yè)在成長期最容易忽略的8個(gè)財(cái)務(wù)管理問題
    商(2016年29期)2016-10-29 08:59:01
    褐殼蛋雞
    刺是植物發(fā)育不完全的芽
    中醫(yī)對青春發(fā)育異常的認(rèn)識(shí)及展望
    午夜两性在线视频| 很黄的视频免费| 国产男靠女视频免费网站| 99国产精品一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产激情欧美一区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美成狂野欧美在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 91成年电影在线观看| 亚洲中文av在线| 成人免费观看视频高清| 久久精品国产清高在天天线| 嫩草影视91久久| 亚洲成av人片免费观看| 久久九九热精品免费| 99久久国产精品久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 精品第一国产精品| 亚洲色图综合在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 少妇 在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 91字幕亚洲| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲中文av在线| 男女下面插进去视频免费观看| 久久九九热精品免费| 国产区一区二久久| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲午夜理论影院| 一级黄色大片毛片| 色哟哟哟哟哟哟| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲国产精品sss在线观看| 一级毛片女人18水好多| 真人做人爱边吃奶动态| 成人国产综合亚洲| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲自拍偷在线| 乱人伦中国视频| 国产真人三级小视频在线观看| 1024香蕉在线观看| 十八禁网站免费在线| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久精品成人免费网站| 真人一进一出gif抽搐免费| av片东京热男人的天堂| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产又爽黄色视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 性色av乱码一区二区三区2| 天天添夜夜摸| 一二三四在线观看免费中文在| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久精品国产综合久久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 色播亚洲综合网| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品电影一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 九色亚洲精品在线播放| 88av欧美| 久99久视频精品免费| 日日夜夜操网爽| 纯流量卡能插随身wifi吗| 深夜精品福利| 无人区码免费观看不卡| 亚洲第一电影网av| 精品福利观看| 嫩草影视91久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美中文综合在线视频| 久久影院123| 天堂√8在线中文| 久久中文看片网| 亚洲全国av大片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久久国产a免费观看| 男女下面插进去视频免费观看| tocl精华| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲在线自拍视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 午夜两性在线视频| 色在线成人网| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲av熟女| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 大码成人一级视频| 亚洲av成人一区二区三| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 老司机福利观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲人成电影观看| 99国产精品99久久久久| 91成人精品电影| 满18在线观看网站| 亚洲av电影不卡..在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美黄色片欧美黄色片| 女警被强在线播放| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美激情 高清一区二区三区| www.www免费av| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 黄色片一级片一级黄色片| 久久久久国内视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产亚洲欧美98| 亚洲欧美精品综合久久99| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美久久黑人一区二区| 成人欧美大片| 99国产精品99久久久久| 国产亚洲精品一区二区www| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲精品国产区一区二| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产真人三级小视频在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 在线免费观看的www视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 一夜夜www| 桃红色精品国产亚洲av| 黄色片一级片一级黄色片| 久久久国产成人精品二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 日本vs欧美在线观看视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 91成年电影在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 两性夫妻黄色片| 最新在线观看一区二区三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| netflix在线观看网站| 91在线观看av| 亚洲专区国产一区二区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 9热在线视频观看99| 亚洲一区二区三区色噜噜| 身体一侧抽搐| 91字幕亚洲| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久久久人人人人人| 涩涩av久久男人的天堂| 91成人精品电影| 国产在线观看jvid| 亚洲国产看品久久| 亚洲激情在线av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 黑丝袜美女国产一区| av超薄肉色丝袜交足视频| 丝袜人妻中文字幕| 桃红色精品国产亚洲av| 久9热在线精品视频| 人人妻人人澡人人看| 精品久久蜜臀av无| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美乱码精品一区二区三区| av电影中文网址| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产熟女xx| 亚洲国产精品合色在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 成人国产综合亚洲| 老汉色∧v一级毛片| 男人舔女人的私密视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 91成年电影在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 男人操女人黄网站| 欧美成人免费av一区二区三区| 正在播放国产对白刺激| 可以在线观看毛片的网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 在线观看免费视频日本深夜| 此物有八面人人有两片| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久精品影院6| av超薄肉色丝袜交足视频| 首页视频小说图片口味搜索| 色综合婷婷激情| 国产成人欧美| 99热只有精品国产| 日韩大码丰满熟妇| 99久久综合精品五月天人人| 国产亚洲精品av在线| 18禁观看日本| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久午夜亚洲精品久久| 中文字幕最新亚洲高清| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一区福利在线观看| 国产成人精品无人区| 婷婷丁香在线五月| 老司机深夜福利视频在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 成人亚洲精品一区在线观看| 日韩有码中文字幕| 国产亚洲精品一区二区www| 日本欧美视频一区| 久99久视频精品免费| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产午夜福利久久久久久| 欧美日韩乱码在线| 国产99久久九九免费精品| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 一级a爱视频在线免费观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 精品国产亚洲在线| 欧美日韩乱码在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 久热这里只有精品99| 麻豆国产av国片精品| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 丰满的人妻完整版| 精品国产一区二区久久| 亚洲中文字幕日韩| 满18在线观看网站| 热re99久久国产66热| 在线观看一区二区三区| 精品国产一区二区久久| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲精品粉嫩美女一区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品电影一区二区在线| 这个男人来自地球电影免费观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 黄色视频不卡| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 最好的美女福利视频网| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲专区字幕在线| 久久久精品欧美日韩精品| 最新美女视频免费是黄的| 搡老岳熟女国产| 国产国语露脸激情在线看| 国产视频一区二区在线看| 国产精品av久久久久免费| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲伊人色综图| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 黑人操中国人逼视频| 久久人妻熟女aⅴ| 国产亚洲av嫩草精品影院| 黄片播放在线免费| 色哟哟哟哟哟哟| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 99精品在免费线老司机午夜| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 午夜福利免费观看在线| 国产国语露脸激情在线看| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲少妇的诱惑av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 午夜免费激情av| 脱女人内裤的视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人精品在线电影| 中文字幕av电影在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品二区激情视频| 香蕉国产在线看| 亚洲色图综合在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品免费久久久久久久清纯| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 看黄色毛片网站| 一a级毛片在线观看| 午夜福利在线观看吧| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲av美国av| 久久久久久久久免费视频了| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 男人舔女人下体高潮全视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| www.自偷自拍.com| 女警被强在线播放| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 日本 欧美在线| 看黄色毛片网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 最新在线观看一区二区三区| 国产乱人伦免费视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 1024视频免费在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 97人妻天天添夜夜摸| 黄色女人牲交| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产激情久久老熟女| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 在线免费观看的www视频| 一级,二级,三级黄色视频| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 好男人在线观看高清免费视频 | 国产成人免费无遮挡视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 淫秽高清视频在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| netflix在线观看网站| 91成人精品电影| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 岛国在线观看网站| 久久亚洲精品不卡| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美成人午夜精品| 国产午夜精品久久久久久| 黄色片一级片一级黄色片| 色综合婷婷激情| 免费少妇av软件| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩大尺度精品在线看网址 | 亚洲人成电影观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲 国产 在线| 国产成人精品久久二区二区91| 美女扒开内裤让男人捅视频| 一级黄色大片毛片| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| av片东京热男人的天堂| 亚洲电影在线观看av| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲人成伊人成综合网2020| 超碰成人久久| 啦啦啦免费观看视频1| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| bbb黄色大片| 咕卡用的链子| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| av在线天堂中文字幕| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品一区二区精品视频观看| 免费看a级黄色片| 日本a在线网址| 亚洲avbb在线观看| 在线观看66精品国产| 国产一卡二卡三卡精品| 久久九九热精品免费| 99精品在免费线老司机午夜| 自线自在国产av| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产成人欧美在线观看| 手机成人av网站| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美成狂野欧美在线观看| 脱女人内裤的视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 黄色视频,在线免费观看| 精品久久蜜臀av无| 免费无遮挡裸体视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 欧美日本中文国产一区发布| a级毛片在线看网站| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲在线自拍视频| 韩国精品一区二区三区| 国产成人影院久久av| 欧美最黄视频在线播放免费| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品乱码久久久久久99久播| 成人亚洲精品av一区二区| www.自偷自拍.com| 大香蕉久久成人网| 午夜激情av网站| 国产亚洲精品久久久久5区| 看片在线看免费视频| 日韩欧美三级三区| 日本三级黄在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品电影一区二区在线| 久久久久国内视频| 欧美日韩精品网址| av视频在线观看入口| 国产亚洲精品一区二区www| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费高清在线观看日韩| 国产精品一区二区在线不卡| 国产三级在线视频| tocl精华| 天天一区二区日本电影三级 | 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲自拍偷在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲五月天丁香| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲片人在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美乱色亚洲激情| 天堂√8在线中文| 色av中文字幕| 自线自在国产av| www.www免费av| 9热在线视频观看99| 色综合站精品国产| 级片在线观看| 国产在线观看jvid| 人人妻人人澡人人看| 国产精品亚洲美女久久久| 男女床上黄色一级片免费看| √禁漫天堂资源中文www| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品久久视频播放| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 男女床上黄色一级片免费看| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| а√天堂www在线а√下载| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国语自产精品视频在线第100页| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品永久免费网站| 国产成人系列免费观看| 婷婷丁香在线五月| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲午夜理论影院| 电影成人av| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产精品亚洲美女久久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 丁香欧美五月| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美日韩精品网址| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲少妇的诱惑av| 黄色丝袜av网址大全| 啦啦啦 在线观看视频| 一本大道久久a久久精品| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲全国av大片| 精品午夜福利视频在线观看一区| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲av片天天在线观看| 日本 欧美在线| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 精品乱码久久久久久99久播| 91在线观看av| 中国美女看黄片| 男人舔女人的私密视频| 亚洲avbb在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一区二区三区精品91| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品久久电影中文字幕| 啦啦啦 在线观看视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| svipshipincom国产片| 国产黄a三级三级三级人| 日韩国内少妇激情av| 午夜免费激情av| av天堂在线播放| 高清在线国产一区| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产精品1区2区在线观看.| 99精品久久久久人妻精品| 国产又爽黄色视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 制服丝袜大香蕉在线| 又紧又爽又黄一区二区| x7x7x7水蜜桃| 两个人免费观看高清视频| 国产精品野战在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 午夜a级毛片| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 中文亚洲av片在线观看爽| 免费不卡黄色视频| 国产一卡二卡三卡精品| av电影中文网址| 国产成人精品无人区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 又紧又爽又黄一区二区| 99riav亚洲国产免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产av又大| 国产午夜福利久久久久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 久久热在线av| 88av欧美| 免费在线观看日本一区| 深夜精品福利| 看免费av毛片| 国产成人精品在线电影| 黑人操中国人逼视频| 久久中文字幕人妻熟女| 无限看片的www在线观看| av视频在线观看入口| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产成人影院久久av| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品国产一区二区久久| 性少妇av在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲激情在线av| 一级毛片女人18水好多| 国产一区二区激情短视频| 亚洲国产欧美网| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲色图av天堂| 99riav亚洲国产免费| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产麻豆成人av免费视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产区一区二久久| 国产xxxxx性猛交| 午夜成年电影在线免费观看| 国产一卡二卡三卡精品| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产1区2区3区精品| 久久中文字幕人妻熟女| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日韩av在线大香蕉| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 午夜免费激情av| 一区二区三区高清视频在线| 操美女的视频在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| www日本在线高清视频| 亚洲人成电影免费在线| 丰满的人妻完整版| 国产精品亚洲美女久久久| 一区在线观看完整版| 欧美黑人精品巨大| 搡老熟女国产l中国老女人| tocl精华| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 最新美女视频免费是黄的| 久久人妻熟女aⅴ| 老熟妇仑乱视频hdxx| 正在播放国产对白刺激| 搡老妇女老女人老熟妇| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产片内射在线| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久中文字幕人妻熟女| 12—13女人毛片做爰片一| 国产av一区在线观看免费| 午夜亚洲福利在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品第一国产精品| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲少妇的诱惑av| 脱女人内裤的视频| 在线观看午夜福利视频| 一级a爱片免费观看的视频| 精品高清国产在线一区| 国产亚洲av嫩草精品影院| av欧美777| 久久精品亚洲精品国产色婷小说|