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    大鼠脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化能力的影響實(shí)驗(yàn)研究

    2013-09-12 12:27:00姜健秦書儉
    中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥 2013年9期
    關(guān)鍵詞:成骨礦化干細(xì)胞

    姜健 秦書儉

    了解ADSCs的體外生長(zhǎng)規(guī)律、生物學(xué)特性及成骨誘導(dǎo)分化能力的各種參數(shù),已經(jīng)成為目前急需解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)探討ADSCs的生長(zhǎng)增殖活性以及成骨分化能力,為ADSCs是否可以成為理想的種子細(xì)胞以及進(jìn)一步基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 健康SD大鼠,由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

    1.2 方法

    1.2.1 ADSCs分離及原代、傳代培養(yǎng) 取SD大鼠,無(wú)菌條件下取腹股溝部脂肪組織,常規(guī)方法沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,置37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)每3 d換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%時(shí),進(jìn)行1∶2傳代,繼續(xù)培養(yǎng)傳代。

    1.2.2 貼壁細(xì)胞鑒定 取第2代的ADSCs,按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,分為4份,分別滴加兔抗鼠CD34、CD44、CD49 d、CD106一抗。用SABC顯色試劑盒顯色,倒置顯微鏡下觀察拍照。

    1.3 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及指標(biāo)檢測(cè) 取第3代細(xì)胞,分別以1×104/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板、5×104/mL的密度接種到放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,更換為含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L 抗壞血酸的成骨誘導(dǎo)劑的DMEM培養(yǎng)基,每3 d換液。以加入不含誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基的3代細(xì)胞作為對(duì)照組。

    1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 每日在顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況以及形態(tài)特點(diǎn)。

    1.3.2 茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù) 取成骨誘導(dǎo)21 d的細(xì)胞,0.1%茜素紅染色30 min,鏡下觀察照相。將每孔均分為4個(gè)象限,每個(gè)象限隨機(jī)取一低倍2個(gè)視野,取8視野計(jì)數(shù)均值。

    2 結(jié)果

    2.1 貼壁細(xì)胞鑒定 對(duì)第2代貼壁細(xì)胞通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)了CD34、CD44、CD49 d、CD106四個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記,結(jié)果顯示貼壁細(xì)胞CD44、CD49 d陽(yáng)性表達(dá),細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色;而CD34、CD106為陰性表達(dá),大部分細(xì)胞胞漿未著色,細(xì)胞核藍(lán)染。說(shuō)明貼壁細(xì)胞為ADSCs,而非造血干細(xì)胞和BMSCs。

    2.2 成骨能力檢測(cè)結(jié)果

    2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)后,生長(zhǎng)速度明顯變慢,細(xì)胞形態(tài)變化相似,逐漸由梭形變?yōu)榱⒎叫?、三角形、多角形,有?shù)個(gè)突起。

    2.2.2 礦化結(jié)節(jié)染色 成骨誘導(dǎo)21 d,細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成明顯,經(jīng)茜素紅染色出現(xiàn)紅色結(jié)節(jié)的陽(yáng)性染色(圖1),不加誘導(dǎo)劑的對(duì)照組染色為陰性(圖2)。

    圖1 礦化結(jié)節(jié)陽(yáng)性染色(×100)

    圖2 對(duì)照組礦化結(jié)節(jié)染色陰性(×100)

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)中從脂肪組織獲取的單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng),貼壁細(xì)胞表面表達(dá)CD44、CD49 d陽(yáng)性;而CD34、CD106為陰性表達(dá)。CD34作為造血干細(xì)胞標(biāo)志性免疫表型,CD34陰性說(shuō)明貼壁細(xì)胞并非來(lái)源于血液循環(huán)中的干細(xì)胞[1],同時(shí)說(shuō)明細(xì)胞未受到脂肪組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染;有研究顯示ADSCs與 BMSCs都可表達(dá) CD44[2];CD49 d在 ADSCs中為陽(yáng)性表達(dá),在BMSCs中則為陰性表達(dá);而與CD106則相反;本實(shí)驗(yàn)CD106陰性表達(dá),已經(jīng)排除BMSCs污染的可能。以上結(jié)論說(shuō)明已經(jīng)得到純度較高的ADSCs。CD49 d是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞定居歸巢到骨髓的表面分子,CD106是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞從骨髓中向外遷移的表面分子,CD49 d與CD106是ADSCs與BMSCs很好的區(qū)別標(biāo)記[3],但其本質(zhì)有待進(jìn)一步的研究。

    礦化結(jié)節(jié)是體外培養(yǎng)條件下成骨細(xì)胞鑒定的一個(gè)重要指標(biāo),也是直接反應(yīng)干細(xì)胞成骨分化能力的一項(xiàng)指標(biāo)。ADSCs誘導(dǎo)21 d后經(jīng)茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色,均出現(xiàn)紅色結(jié)節(jié)的陽(yáng)性表達(dá)。

    [1]Civin CI,Banquerigo ML,Strauss LC,et al.Antigenic analysis of hematopoiesis.VI.Flow cytometric characterization of My-10-positive progenitor cells in normal human bone marrow.Exp Hematol,1987,15(1):10-17.

    [2]Katz AJ,Tholpady A,Tholpady SS,et al.Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal(hADAS)cells.Stem Cells,2005,23(3):412-423.

    [3]Gronthos S,F(xiàn)ranklin DM,Leddy HA,et al.Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells.J Cell Physiol,2001,189(1):54-63.

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