江西省2010年-2014年呼吸道感染腺病毒基因特征分析

張艷妮，熊英，龔甜，施勇，徐剛，李建雄，周珺，劉師文，肖芳，劉曉慶

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌330029)

江西省2010年-2014年呼吸道感染腺病毒基因特征分析

張艷妮，熊英，龔甜，施勇，徐剛，李建雄，周珺，劉師文，肖芳，劉曉慶

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌330029)

目的 了解2010年至2014年江西省兒科呼吸道感染患兒中腺病毒的感染狀況及其基因特征。方法 2010年至2014年，共采集呼吸道感染患兒的標(biāo)本2645份，分別進(jìn)行了7種常見呼吸道病毒的核酸檢測(cè)，核酸陽性標(biāo)本進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)獲得毒株。設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增所有腺病毒基因組Hexon基因片段、feiber基因片段的引物，毒株進(jìn)行擴(kuò)增，PCR的產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank的已知型別的序列進(jìn)行比對(duì)，確定腺病毒的型別。結(jié)果 在2645份呼吸道標(biāo)本中，核酸檢測(cè)腺病毒的陽性標(biāo)本數(shù)為259份，陽性率9.79%，對(duì)259份核酸陽性標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，得到46份毒株，病毒分離率為17.76%。46份標(biāo)本進(jìn)行PCR、測(cè)序、序列比對(duì)分析得知：1型ADV為7例，占15.22%，2型ADV為14例，占30.43%，3型ADV為 8例，占17.39%，5型ADV為7例，占15.22%，6型ADV為1例，占2.17%，7型ADV為9例，占19.57%。結(jié)論 2010年至2014年，南昌地區(qū)的腺病毒感染以2型、3型、7型為主，1型、5型、6型比較少見，暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)新的型別引起的感染。

呼吸道感染；腺病毒；基因特征

腺病毒是一種呼吸道感染的常見病原體，是在1953年由小兒扁桃體中首次分離得到，可引發(fā)急性、慢性潛在感染，能夠引起局部流行和爆發(fā)流行。腺病毒是普通的機(jī)會(huì)性病原體，可感染各年齡人群，并穩(wěn)定傳播[1，2]。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的腺病毒有51種血清型，分為A-G 6個(gè)亞屬；B屬可以引起嚴(yán)重的呼吸道疾病，C屬、E屬也可引起呼吸道疾病。20世紀(jì)50-60年代，腺病毒引起的兒童肺炎的發(fā)病率和死亡率均較高；到了80年代以后有所下降[3]，但是近些年腺病毒引起的感染又有所升高，且在近年國內(nèi)外發(fā)生的多起因腺病毒爆發(fā)而引起的呼吸道傳染病疫情中發(fā)現(xiàn)了多種新型別的腺病毒如HAdV-55、HAdV-53、HAdV-65[4-6]。人類腺病毒是無包膜雙鏈DNA病毒，基因組包含早期表達(dá)的與腺病毒復(fù)制相關(guān)的E1～E4基因和晚期表達(dá)的與腺病毒顆粒組裝相關(guān)的 L1～L5基因[1，7]。 Hexon基因位于晚期轉(zhuǎn)錄基因L3上，hexon蛋白攜帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇；Fiber基因位于晚期轉(zhuǎn)錄基因L5上，F(xiàn)iber蛋白有血清特異性，含種特異性抗原決定位點(diǎn)；Hexon基因和Fiber基因是新型腺病毒重組發(fā)生的多發(fā)區(qū)域，可利用Hexon基因高度可變區(qū)域的擴(kuò)增進(jìn)行型別的鑒定[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本及毒株來源2010年5月-2014年12月，在江西省兒童醫(yī)院共收集到2645份發(fā)熱呼吸道患兒標(biāo)本 （其中在門診患兒中采集的咽拭子標(biāo)本1707份，痰標(biāo)本117份，住院患兒采集的支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本821份）。收集到的所有標(biāo)本都進(jìn)行了7種常見的呼吸道病毒流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠狀病毒的核酸檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA的提取取采集的患兒標(biāo)本（咽拭子、痰、支氣管肺泡灌洗液）200μl，采用 Qiagen 公司的病毒核酸提取試劑盒提取病毒DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。病毒培養(yǎng)物DNA的提取相同。

1.2.2 PCR檢測(cè)采用腺病毒的通用引物VA3、VA6對(duì)提取的標(biāo)本的DNA進(jìn)行檢測(cè)。引物序列及PCR 程序均參考文獻(xiàn)[8]。 VA3：5’-TCTCGGTVAGRCGYGCGCARTC-3’，VA6：5’-TCTCGCAGCAC NGGATGCATCT-3’，目標(biāo)片段位于L3基因內(nèi)且長度約為 500bp。 PCR 程序 94℃ 5min，94℃ 1min，54℃ 45s，72℃ 2min，35 個(gè)循環(huán)，72℃ 5min。 擴(kuò)增的產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析，目的片段的大小約為500bp。

1.2.3 病毒分離及鑒定對(duì)經(jīng)過核酸檢測(cè)腺病毒陽性的標(biāo)本，接種于覆蓋率80%左右的Hep-2細(xì)胞上，每日觀察細(xì)胞病變，對(duì)細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集成類似于葡萄串樣的疑似腺病毒引起的病變，對(duì)疑似病變的標(biāo)本進(jìn)行收集保存。共對(duì)260份腺病毒陽性的標(biāo)本進(jìn)行了病毒分離培養(yǎng)，共得到46份疑似腺病毒毒株。對(duì)這46份標(biāo)本再次用腺病毒通用引物進(jìn)行鑒定，核酸提取、PCR擴(kuò)增及電泳均同前。電泳結(jié)果顯示，這46份標(biāo)本均在目的片段約500bp有明顯條帶，說明這46份毒株均為腺病毒的毒株。

1.2.4 腺病毒序列測(cè)定序列測(cè)定的引物參考文獻(xiàn)[9]，由上海生工生物工程公司合成。采用巢式PCR擴(kuò)增Hexon基因的HVR1-HVR6基因片段，二次擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為688～820bp。

一次擴(kuò)增體系：Green Master Mix(2x)：10μl，引物 各 0.8μl，H2O：12.4μl，DNA：6μl，擴(kuò) 增 程 序 ：94℃ 、2min，94℃ 、1min，45℃ 、1min，72℃ 、2min，40個(gè)循環(huán)，72℃、5min。 二次擴(kuò)增體系：Green Master Mix(2x)：10μl，引物各 0.8μl，H2O 15.4μl，DNA 3μl，擴(kuò)增程序同前。

擴(kuò)增B屬、C屬fiber基因的部分基因片段，引物序列參考文獻(xiàn)[10，11]見表 1。

表1 擴(kuò)增B屬、C屬fiber基因的部分基因片段，引物序列參考文獻(xiàn)

擴(kuò)增體系：Green Master Mix(2x)：10μl，引物各0.8μl，H2O：12.4μl，DNA：6μl，擴(kuò) 增 程 序 ：94℃ 、5min，94℃、1min，54℃、45s，72℃、2min，40 個(gè)循環(huán)，72℃、5min。擴(kuò)增產(chǎn)物直接送上海生工測(cè)序。

1.3 序列比對(duì)將測(cè)序得到的46份毒株序列與GeneBank上已經(jīng)公布的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。用DNA STAR和MEGA 5.0軟件對(duì)序列進(jìn)行核苷酸同源性分析和基因親緣性關(guān)系的分析。

腺病毒的hexon基因各個(gè)型別參考序列均從GenBank下載，各序列登錄號(hào)為：ADV3/DQ115429、ADV7/DQ115455、ADV1/DQ115407、ADV2/DQ1154 18、ADV5/DQ115451、ADV6/DQ115454。 見圖 1。

腺病毒的fiber基因各個(gè)型別參考序列均從GenBank下載，各序列登錄號(hào)為：ADV3/AY224416-1、ADV7/AY921616、ADV1/AC000017.1、ADV2/A C000007.1、ADV5/AC000008.1、ADV6/AB125751.1。見圖2。

2 結(jié)果

圖1 江西省腺病毒Hexon基因序列與各型別Hexon基因參考序列進(jìn)化樹。

圖2 江西省腺病毒Fiber基因序列與各型別Fiber基因參考序列進(jìn)化樹。

2.1 病毒分離在2645份呼吸道標(biāo)本中，核酸檢測(cè)腺病毒的陽性標(biāo)本數(shù)為259份，陽性率9.79%，對(duì)259份核酸陽性標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，得到46份毒株，病毒分離率為17.76%。其中2013年、2014年未分離到腺病毒毒株其他年份均分離到腺病毒毒株。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 2010-2014各年份采集的標(biāo)本數(shù)及核酸檢測(cè)、病毒分離數(shù)據(jù)

2.2 PCR檢測(cè)對(duì)病毒分離得到的46份毒株用腺病毒通用引物VA3、VA6二次進(jìn)行PCR測(cè)定，對(duì)再次鑒定為腺病毒陽性的標(biāo)本用測(cè)序引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果到GeneBank進(jìn)行BLAST比對(duì)分析得知：1型ADV為7例，占15.22%，2型ADV為14例，占30.43%，3型ADV為8例，占17.39%，5型ADV為7例，占15，22%，6型 ADV 為 1例，占 2.17%，7型 ADV 為9例，占19.57%。具體數(shù)據(jù)見表3。

由表3可以明顯的看出，2010年ADV2型占到了45.45%，為明顯的優(yōu)勢(shì)流行型別；ADV5、ADV3所占的比例一樣多，也是當(dāng)年的流行基因型別，但不處于優(yōu)勢(shì)地位。2011年ADV2所占的比例明顯的降低ADV7、ADV1所占的比例明顯上升，2011年有多個(gè)基因型別共同流行，還檢測(cè)到了一株ADV6。2012年ADV7為優(yōu)勢(shì)流行株。

2.3 序列測(cè)定腺病毒的hexon蛋白攜帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇，hexon蛋白具有7個(gè)高度可變區(qū)域，這些區(qū)域與腺病毒的型別特異性密切相關(guān)。通過對(duì)hexon基因高度可變區(qū)域進(jìn)行測(cè)序并與NCBI上已有的各個(gè)型別的序列進(jìn)行比對(duì)得知，46株毒株共有 6個(gè)基因型別 HADV1、HADV2、HADV5、HADV6、HADV3、HADV7。 每 個(gè)型別的毒株之間的同源性分別為HADV1：98.5%～100% 、HADV2：99.0% ～100% 、HADV5：95.4% ～100% 、HADV3：99.8% ～100% 、HADV7：99.8% ～100%；毒株與參考株之間的同源性為HADV1：98.5% ～100% 、HADV2：99.7% ～99.8% 、HADV5：95.4% ～100% 、HADV6：98.8% 、HADV3：98.9% ～99.1%、HADV7：95.8%～95.9%。

表3 2010-2014各年腺病毒基因型別

根據(jù)Hexon比對(duì)的分析的結(jié)果，分別針對(duì)6種型別的fiber基因設(shè)計(jì)了引物，序列測(cè)定并與NCBI上已有的腺病毒序列進(jìn)行比對(duì)分析，最終分析的結(jié)果和Hexon基因的型別的判定完全相符合。每個(gè)型別的毒株之間的同源性分別為HADV1：98.1% ～100% 、HADV2：98.1% ～100% 、HADV5：98.5% ～100% 、HADV3：96.8% ～100% 、HADV7：98.4%～100%；毒株與參考株之間的同源性為HADV1：97.9% ～99.6% 、HADV2：98.1% ～99.1% 、HADV5：98.8% ～99.7% 、HADV6：97.6% 、HADV3：98.4%～100%、HADV7：98.4%～99.8%。

3 討論

本研究通過對(duì)2010年至1014年江西省兒童醫(yī)院就診的呼吸道患兒的標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè)及型別的測(cè)定，結(jié)果表明南昌地區(qū)的ADV陽性率為9.83%，明顯低于南京地區(qū)2010年至2011年26.55%的檢出率[12]，且優(yōu)勢(shì)流行株為2型（14/46），與南京地區(qū)報(bào)道的3型流行株有一定的差異，與北京報(bào)道的3型流行為主也存在差異。腺病毒引起的呼吸系統(tǒng)感染多發(fā)生在冬、春兩季，且嬰幼兒較易感染[13，15]。 有報(bào)道顯示，HADV-2屬于C屬腺病毒，主要引起兒童的呼吸道疾病，引起的臨床癥狀較輕。B屬的HADV-3和HADV-7是嬰幼兒呼吸道腺病毒感染的常見血清型，能夠引起腺病毒的爆發(fā)感染，病死率高達(dá)12%[16]。與人腺病毒相關(guān)的呼吸道感染很常見，多感染5歲以下兒童，尤其2歲以下兒童發(fā)病率最高[17]。國外的研究發(fā)現(xiàn)，HADV導(dǎo)致的呼吸道感染的檢出率約在8.9%-10.5%，本研究的結(jié)果顯示，江西省連續(xù)5年監(jiān)測(cè)人腺病毒，檢出率分別為8.29%（50/603），10.53%（84/798），3.84%（20/521），12.57%（66/525），19.70%（39/198），這于北京地區(qū)2003-2008檢出率（1.69%）相比較，平均高出了6倍左右[18]。

本研究中分離到的46個(gè)毒株，分屬于6個(gè)不同的血清型，且都屬于B屬和C屬常見的的亞型。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的腺病毒的基因重組主要集中在Hexon基因和Fiber基因，本研究對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)序列進(jìn)行擴(kuò)增，以便對(duì)型別做出判斷；通過對(duì)46份毒株的兩個(gè)基因片段測(cè)序分析，兩個(gè)片段比對(duì)確定的基因型別完全相同，則可以排除基因之間存在存在重組的可能，在連續(xù)5年的監(jiān)測(cè)中，并未發(fā)現(xiàn)新型的腺病毒及腺病毒基因的重組。2010年、2011年引起的呼吸道感染的腺病毒主要以ADV2型為主，2012年以ADV7型腺病毒為主。因?yàn)?013年、2014年未分離到腺病毒的毒株，無從判斷2013年、2014年流行的腺病毒型別，無法判斷優(yōu)勢(shì)基因型。在今后的腺病毒監(jiān)測(cè)過程中，應(yīng)該對(duì)不同時(shí)期流行的腺病毒的Hexon基因、Fiber基因以及基因間的重組變異情況進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)，對(duì)腺病毒的流行特征進(jìn)行更全面的認(rèn)識(shí)，為預(yù)測(cè)人腺病毒可能引起的暴發(fā)與流行性疾病提供更加詳細(xì)可靠的參考依據(jù)。

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M olecular epidem iology analysis of Humen Adenovirus in Jiangxi Province from 2010 to 2014

ZHANG Yanni，XIONG Ying，GONG Tian，SHIYong，XU Gang，LIJianxiong，ZHOU Jun，LIU Shiwen，XIAO Fang，LIU Xiaoqing.
Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Objective To investigate the status and genetic characteristics of adenovirus infection in children with respiratory tract infection in Jiangxi province from 2010 to 2014.M ethods A total of 2，645 samples of respiratory tract infection were collected from 2010 to 2014，the nucleic acid of seven common respiratory virus types were detected.Virus positive specimens were isolated and cultivated to obtain strains.The primers of adenovirus genome Hexon and feiber gene fragmentwere designed to amplify strain.The type of virus was determined by directly sequencing PCR products，and obtained sequences were compared with the known genotypes in GenBank.Results Among 2，645 respiratory specimens，there were 259 positive samples of adenovirus and its positive rate was 9.79%.Forty-six strains were obtained from isolation of 259 nucleic acid positive specimens，with virus isolation rate as 17.76%.The sequence comparative analysis of PCR，sequencing of 46 samples showed：7 cases of HADV1(15.22%)，14 cases of HADV2(30.43%)，8 cases of HADV3(17.39%)，7 cases of HADV5(15.22%)，1 case of HADV6(2.17%)，9 cases of HADV7(19.57%).Conclusion The prevalence of adenovirus infection in Nanchang area wasmainly featured by type II，III and VII，with rare type I，V and VI，and no new type was discovered to lead to infection from 2010 to 2014.，

Respiratory tract infection；Humen adenovirus；Molecular epidemiology

R446.62，R511.8

A

1674-1129(2017)05-0650-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.005

江西省衛(wèi)計(jì)委課題，項(xiàng)目編號(hào)：20156032

張艷妮，女，1983年生，碩士，主管技師，主要從事分子病毒的檢測(cè)工作。E-mail：zhang-yn99@hotmail.com

2017-03-16；

2017-06-10)