高通量測序在婦科惡性腫瘤早期篩查中的應用進展

黃 柯，孟元光

(解放軍總醫(yī)院婦產科，北京 100039)

統(tǒng)計學研究顯示當前全球范圍內新增癌癥病例約1800萬，死亡人數(shù)達960萬，其中女性癌癥中宮頸癌的發(fā)病率占13.1%，死亡率達6.9%[1]。我國新發(fā)腫瘤病例380.4萬例，死亡病例高達229.6萬例，這意味著我國癌癥新發(fā)例數(shù)占全球總數(shù)的20%以上，同時在女性發(fā)病率前10位的癌癥中，宮頸癌和子宮癌的發(fā)病率及死亡率均排名靠前[2]。隨著中國步入老齡化社會，老年女性子宮頸癌和宮內膜癌的發(fā)病率有所升高[3]。宮頸癌是婦科惡性腫瘤中發(fā)病率最高的生殖系統(tǒng)腫瘤，雖然目前液基薄層細胞檢測技術的成熟和人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)疫苗的應用，子宮頸癌的發(fā)病率有所降低，但由于HPV疫苗價格昂貴，尚不能在我國普及[4]。由于宮頸癌篩查并不普及，我國宮頸癌的發(fā)病率和死亡率仍高于發(fā)達國家[5]。近年來子宮內膜癌的發(fā)病率也呈上升趨勢。一方面是由于宮頸癌早期診斷率的提高以及子宮頸上皮內瘤樣病變階段手術切除率的增加，子宮內膜癌發(fā)病率的升高；另一方面，影響子宮內膜癌發(fā)生的高危因素持續(xù)存在，如2型糖尿病、不孕癥、多囊卵巢綜合征以及終生拒絕妊娠女性的增加都導致子宮內膜癌的發(fā)病率逐年升高[6]。

卵巢癌的發(fā)病率雖然不高，但其具有易復發(fā)、易耐藥以及早期難發(fā)現(xiàn)的特點而導致卵巢癌的預后非常差，是致死率較高的女性生殖系統(tǒng)腫瘤[7]。以上海為例，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率近40年來未有明顯改觀[8]。因此，尋找能夠早期篩查宮頸癌和子宮內膜癌的手段，以期早診斷、早治療非常重要?，F(xiàn)就高通量測序技術在上述腫瘤早期篩查中的應用進行綜述。

1 高通量測序的運用

高通量測序又稱下一代測序(next generation sequencing，NGS)技術，其能同時對幾十萬到幾百萬條的DNA分子并行序列測序。相對于第1代焦磷酸法測序技術，NGS在速度方面有明顯提高，并可同時獲取豐富的基因遺傳學信息。基于NGS技術相關的腫瘤學研究日益增多，有潛在應用價值的方法如下。

1.1靶向測序 靶向測序是針對目標基因區(qū)域設計芯片和探針，區(qū)域DNA富集后進行深度測序分析，具有常規(guī)檢測方法不可比擬的優(yōu)勢[9]。相較于全基因組和轉錄組測序，靶向區(qū)域測序的目標序列較少。靶向測序的優(yōu)點是測序深度高、成本低、速度較快，可獲得更為準確的測序結果。靶向測序常用于獲取疾病相關致病基因和易感基因的信息，用于指導篩選臨床高危人群和制定個性化治療方案；缺點是無法進行探索性研究，不能識別未知突變基因[10]。

1.2外顯子測序 外顯子測序的靶向檢測目標是編碼外顯子的基因序列，是一種將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。外顯子組包括約1%的基因組、約85%的致病突變，外顯子組測序可檢測出單核苷酸變異，小部分基因插入或缺失，以及罕見的新生突變，可有效檢測惡性婦科腫瘤疾病的基因遺傳率[11]。外顯子測序相對于基因組重測序成本低，對研究已知基因的單核苷酸變異、基因插入或缺失等具有較大優(yōu)勢，但外顯子測序無法研究基因組的結構變異如染色體斷裂重組等。由于測序未涉及內含子序列，所以并不適用于研究腫瘤的調控機制[12]。由于目前對腫瘤發(fā)生學的理論研究主要集中在基因突變以及調控異常方面，所以除個別遺傳性腫瘤外，全外顯子組測序尚可滿足臨床需求。但隨著對腫瘤發(fā)生機制研究的深入，癌癥早期如與調控序列有關的話，外顯子測序就不能滿足臨床需求。

1.3甲基化測序 甲基化測序能直接對任何物種的高甲基化片段進行測序而無須知道基因組的序列信息。DNA基因甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，在維持細胞功能、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[13]。對所有富集的甲基化DNA片段進行高通量測序能夠明確全基因組的甲基化狀態(tài)，為表觀遺傳學中的調控分析提供了更有利的切入點。有學者研究了卵巢癌組織中鈣黏蛋白基因CDH10、CDH13以及CDH18的甲基化情況，與健康對照組相比，卵巢癌標本中CDH13基因的甲基化顯著增高，CDH10基因散發(fā)甲基化，而CDH18基因甲基化喪失[14]。上述研究表明，鈣黏蛋白基因的甲基化可能是卵巢癌進展的機制之一；其次，由于CDH13基因在卵巢癌早期的甲基化頻率較高，對胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點的甲基化分析可能是下一步研究卵巢癌早期篩查生物標志物的主要方向之一[15]。

1.4單細胞全基因組測序 單細胞全基因組測序技術是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的技術。它是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得其完整基因組后探尋細胞群體差異和細胞進化關系[16]。已有研究通過激光顯微切割分離卵巢癌石蠟切片的單細胞，然后進行單細胞全基因組測序，分析不同卵巢癌細胞的基因狀態(tài)[17]。結果發(fā)現(xiàn)，不同單細胞中相同基因座處均存在甲基化和未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤，即同一細胞亞群中顯示異質DNA甲基化狀態(tài)[17]，不過由于成本原因，目前該技術主要用于科研領域。

2 NGS篩查婦科惡性腫瘤

目前在婦科惡性腫瘤領域，早期篩查時使用NGS相關技術的報道較少，一方面由于NGS篩查成本較傳統(tǒng)方法高；另一方面由于NGS能檢測到的突變較多，但又缺乏大規(guī)模人群的正常對照數(shù)據進行解讀，導致NGS的臨床應用受到限制。NGS應用于婦科惡性腫瘤的優(yōu)勢也較多，是當前臨床研究的熱點。

2.1NGS檢測在宮頸癌篩查中的應用 宮頸癌傳統(tǒng)早期篩查方法已經很成熟，可直接取材、成本較低，且樣本質量較好，質控體系也較完善。宮頸癌的早期篩查主要以高危型HPV檢測聯(lián)合液基薄層細胞檢測技術為主[18]。但目前還沒有更好的方法對高危型HPV感染者進行分層，畢竟終生高危型HPV陽性且不罹患宮頸癌的女性也并非少數(shù)。如何降低高危型HPV陽性女性的心理負擔和篩查頻率，如何進行進一步分層是臨床急需解決的問題[19]。目前雖然有學者對包括甲基化檢測、HPV整合位點分析等方法進行了有益探索，但得到的數(shù)據相對于傳統(tǒng)方法仍然較少[20]。有學者利用NGS檢測在宮頸癌細胞系中發(fā)現(xiàn)12個基因啟動子(ARHGAP6、HAND2、LHX9、HEY2、NKX2-2、PCDH10、PITX2、PROX1、TBX3、IKBKG、RAB6C和DAPK1)存在甲基化，這為宮頸癌的早期檢測和臨床管理提供了基因特異性甲基化方面的有效生物標志物[21]。

2.2NGS檢測在子宮內膜癌篩查中的應用 子宮內膜癌的早期篩查目前尚未有規(guī)范內容，篩查多依賴于婦科超聲或磁共振成像結合子宮內膜活檢技術，更早期的篩查多是在行子宮頸液基薄層細胞學檢測過程中捕獲到從宮腔脫落的異形細胞間接發(fā)現(xiàn)，這屬于機會性因素，不能作為標準篩查方法。

因子宮內膜高危患者多合并有肥胖，導致子宮內膜活檢難度增大，并有漏檢風險，常規(guī)活檢無法做到對子宮內膜癌的早期準確篩查[22]。目前利用子宮頸部細胞DNA的異常變化來推測子宮內膜癌的早期癌前病變是一個新的研究方向，已有學者利用診斷性刮宮或子宮腔灌洗細胞進行循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)測序分析，以預測或輔助子宮內膜癌的早期診斷[23]。有研究分析了107例接受宮腔鏡檢查和刮宮術患者的宮灌洗液樣本,并從灌洗液中分離出細胞中和游離的DNA，然后進行超深度高通量測序，結果發(fā)現(xiàn)7例患者的宮腔鏡檢查經典刮除組織中有子宮內膜癌的前驅動突變，大約有50%的女性未在癌癥確診的灌洗液中鑒定出相對較多的等位基因驅動突變[24-25]。因此，NGS有可能用于子宮內膜癌的早期篩查。

Maritschnegg等[23]發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型卵巢癌和子宮內膜癌通過宮腔灌洗收集脫落細胞進行基因突變檢測，可實現(xiàn)卵巢癌和子宮內膜癌的早期檢測，甚至是臨床上尚無癥狀的卵巢癌。Xia等[26]利用NGS技術結合18種基因突變檢測方法以及非整倍性檢測方法對子宮內膜癌患者和卵巢癌患者進行檢測發(fā)現(xiàn)，對382例子宮內膜癌患者的宮頸脫落細胞進行基因檢測發(fā)現(xiàn)，81%的患者基因突變?yōu)殛栃?，其?8%為早期疾病患者；245例卵巢癌患者中相關基因突變率為33%，其中34%為早期癌癥患者；而在714例無癌癥的女性中只有1.4%宮頸脫落細胞基因突變?yōu)殛栃?特異度為99%)；隨后進行子宮內膜取樣NGS檢測發(fā)現(xiàn)，有93%(114/123)的子宮內膜癌患者和45%(23/51)的卵巢癌患者18種基因測序突變?yōu)殛栃?，?25例未患癌者均為陰性；在可獲得血漿的83例卵巢癌患者中，43%的患者ctDNA陽性;檢測血漿和脫落細胞時，卵巢癌的靈敏度為63%。上述結果表明，NGS檢測基因突變可作為早期篩查婦科惡性腫瘤的輔助手段。

2.3NGS檢測在卵巢癌篩查中的應用 卵巢癌的早期診斷仍是目前臨床無法根本解決的難題。以前對微RNA和長鏈非編碼RNA研究比較多，但現(xiàn)在認為微RNA主要與調控有關，涉及相關通路的激活或抑制，因而目前主要用于監(jiān)控和治療癌癥患者，而非早期篩查[27]。癌抗原125(cancer antigen 125，CA125)檢測聯(lián)合婦科超聲檢查組成了現(xiàn)在最常用的婦科惡性腫瘤篩查方法，包括對CA125動態(tài)變化的分析[28]。這些檢測方法雖然成熟，但陽性符合率和假陽性率均不佳，且部分卵巢癌患者早期并無CA125的升高，首發(fā)癥狀即為腹脹、腹水。如何早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌或在癌前病變階段發(fā)現(xiàn)卵巢癌，一直是臨床醫(yī)師和科研人員探索的方向?；诼殉舶┌l(fā)生學觀點，有研究認為卵巢癌是輸卵管來源的惡性腫瘤，在腫瘤組織中已經鑒定出輸卵管上皮是高級別漿液性卵巢癌的祖細胞群之一[29]。同時卵巢子宮內膜樣癌和透明細胞癌均出現(xiàn)了KRAS基因、PIK3CA基因、CTNNB1基因、ARID1A基因以及PTEN基因突變，且TTC28-L1轉導以及經典的驅動突變在腫瘤中幾乎普遍存在，這表明L1激活可能發(fā)生在子宮內膜異位癥相關的卵巢癌的早期，TTC28-L1轉導可用于確定克隆關系和跟蹤卵巢癌進展[30]。最近開展的一項研究是利用ctDNA檢測腫瘤細胞，其采用的分子檢測技術為PapGene檢測，以期早期識別小體積的卵巢高級別漿液性癌或漿液性輸卵管上皮內癌的癌前病變[31]。NGS在卵巢癌中應用的最終目標是評估PapGene和ctDNA測試檢測高級別漿液性卵巢癌的作用特征，研究PapGene和ctDNA檢測在高卵巢癌風險女性中預測早期病變和微小卵巢癌病變的價值；確定PapGene試驗作為前瞻性隊列研究中高級別漿液性卵巢癌篩查工具的臨床效用[32]。

3 小 結

從宮頸管細胞涂片、子宮腔脫落細胞或灌洗液等得到的樣本中提取基因進行NGS，可有效篩查出婦科惡性腫瘤相關基因的突變，從而為婦科惡性腫瘤的早期篩查提供新思路。高通量基因測序篩查婦科惡性腫瘤的敏感性和準確度優(yōu)勢是傳統(tǒng)檢查技術無法超越的。基于ctDNA、無細胞DNA等新技術用于NGS獲取樣本信息將更有助于指導婦科惡性腫瘤的臨床靶向治療方案的制定和調整。目前為實現(xiàn)癌癥的無創(chuàng)早期篩查，Johns Hopkins Kimmel癌癥中心的科學家開發(fā)了一種高通量測序檢測血液中微量腫瘤特異性DNA的技術，其已準確篩選識別了138例相對早期的結直腸癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌患者[33]，證實NGS用于婦科惡性腫瘤是具有可行性的。也有學者將NGS與蛋白質組學結合起來，但由于蛋白質組學技術的穩(wěn)定性目前還不能保證，臨床應用前景相對較遠[34]。目前婦科惡性腫瘤NGS早期篩查技術的發(fā)展方向仍是ctDNA和甲基化檢測，隨著ctDNA技術的成熟，NGS將更多地應用于卵巢漿液性癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、宮頸鱗癌和腺癌的早期篩查?？傊?，應用NGS技術進行早期婦科惡性腫瘤的篩查雖然還不完善，但其以無創(chuàng)活檢為目標的精準篩查、精準治療將是未來婦科惡性腫瘤診治領域的大方向。