食品中檢測志賀氏菌的實時熒光RPA方法的建立與應用

劉立兵 孫曉霞 姜彥芬 王金鳳 陳志敏 王建昌

（石家莊海關技術中心 石家莊 050051）

食源性疾病目前是全世界關注的重要公共衛(wèi)生問題，無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，每年都會有數(shù)千萬的人因感染食源性致病菌而發(fā)病，嚴重者導致死亡[1]。志賀氏菌（Shigella）作為主要的食源性致病菌之一，在我國引起感染性腹瀉的致病菌中居首位。志賀氏菌屬由4種革蘭氏陰性、非運動性、無芽孢形成的桿狀細菌組成，分別是鮑氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌[2-3]。毒力較強的志賀氏菌可以引起人類細菌性痢疾，表現(xiàn)出輕度痢疾、發(fā)熱、腹部絞痛以及嚴重的體液流失[4-5]。

傳統(tǒng)的志賀氏菌檢測主要依賴于細菌培養(yǎng)及一系列的生化鑒定，檢測周期較長，無法實現(xiàn)快速檢測。目前的分子生物學檢測方法可以有效克服傳統(tǒng)檢測方法的部分劣勢而被多數(shù)研究者所青睞，其中重組酶聚合酶擴增技術因其特異性強，靈敏性高，反應時間短，操作簡便等優(yōu)點而受到廣泛關注，具有巨大的發(fā)展前景。RPA技術是在3種核心酶的作用下進行核酸的等溫擴增。其中，重組酶與特異性引物結合后形成復合物，可移動尋找同源的雙鏈DNA，隨后發(fā)生鏈置換。單鏈DNA結合蛋白與同源DNA結合，引物與互補的DNA鏈結合，在鏈置換DNA聚合酶作用下延伸[6]。RPA基本原理是模仿體內(nèi)核酸復制機制[7]，利用酶打開模板鏈，不需要反復熱變性，在常溫條件下（25～42°C）即可實現(xiàn)對核酸的擴增。RPA技術在檢測時間上具有明顯的優(yōu)勢，一般5～20 min內(nèi)即可判定結果[8]。如果在反應中加入特異性引物探針[9]，通過熒光檢測設備就可實現(xiàn)對目的片段擴增的實時監(jiān)控。

本研究以志賀氏菌高度保守的侵襲性質(zhì)粒抗原H基因（ipaH）為靶基因，建立了用于食品中志賀氏菌快速檢測的real-time RPA方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設備

志賀氏菌增菌肉湯、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂等細菌培養(yǎng)基，北京陸橋技術有限責任公司；TransStart Probe qPCR SuperMix（2×），全式金生物技術有限公司；熒光型RAA檢測試劑盒，杭州眾測生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，寶生物工程有限公司；引物及探針由通用生物工程股份有限公司合成。

Genie III等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)，英國Opti-Gene公司；Step One Plus Real-time PCR System，美國ABI應用生物公司；核酸蛋白分析儀（PS232C），賽默飛世爾生物技術有限公司。

1.2 菌株

本試驗所用的菌株見表1。

表1 本研究所用菌種Table1 Bacterial strains used in the study

1.3 細菌基因組DNA的提取

將宋內(nèi)氏志賀氏菌（CICC21679）純培養(yǎng)菌接種于10 mL營養(yǎng)肉湯中，36℃培養(yǎng)18 h。取菌液1 mL加入1.5 mL Eppendorf管中，10 000 r/min離心1 min，收集沉淀。按照細菌基因組DNA提取說明提取志賀氏菌DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。同時使用核酸蛋白分析儀測定基因組DNA的濃度。

1.4 引物探針的設計與合成

參考GeneBank中志賀氏菌ipaH基因保守區(qū)域（登錄號：AE005674），設計擴增大小為247 bp片段的引物和探針（見表2）。

1.5 實時熒光 RPA方法的建立

50 μL 反應體系：RPA-F/R（10 μmol/L）各 2 μL，exo Probe（10 μmol/L）0.6 μL，A Buffer 12.5 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 29.4 μL。 將上述 47.5 μL體系混勻后加入到裝有凍干酶制劑（1 mmol/L dNTP，90 ng/μL 單鏈結合蛋白，120 ng/μL recA 重組酶，30 ng/μL Bsu DNA 聚合酶，30 ng/μL Exo核酸外切酶，100 mmol/L Tricine，20%PEG，5 mmol/L二硫蘇糖醇，100 ng/μL肌酸激酶）的反應管中，在管蓋上加入2.5 μL B Buffer，蓋上管蓋瞬時離心10 s，并渦旋后放入Genie III中。

表2 引物和探針序列Table2 Sequence of primers and probes

反應條件：39℃恒溫反應20 min。

1.6 實時熒光 PCR方法

按照文獻[10]中的反應體系和反應條件進行。反應體系：TransStart Probe qPCR SuperMix（2×）12.5 μL，PCR-F/R（10 μmol/L）各 1.5 μL，探針（5 μmol/L）0.9 μL，DNA 1 μL，補水至 25 μL。 將上述體系充分混勻后放入Step One Plus Real-time PCR System中。

反應條件：95℃預變性40 s；95℃變性10 s，60℃延伸35 s，35個循環(huán)，60℃收集熒光信號。

1.7 特異性和靈敏性試驗

根據(jù)1.5節(jié)建立的實時熒光RPA方法對表1中所有細菌DNA進行檢測，根據(jù)擴增曲線驗證該引物探針的特異性。

以10倍稀釋的志賀氏菌DNA進行實時熒光RPA方法的靈敏性檢測，根據(jù)不同濃度擴增曲線確定該方法的靈敏性，同時與文獻中的實時熒光PCR方法進行比較。

1.8 人工污染樣品檢測

將過夜培養(yǎng)的宋內(nèi)氏志賀氏菌（CICC21679）菌液進行倍比稀釋，選取可計數(shù)范圍內(nèi)的3個稀釋度菌液均勻地涂在木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂板上，每個稀釋度做3個平行，用于計算志賀氏菌的初始濃度。稱取25 g西蘭花和25 g雞肉樣品中（樣品預先按照GB4789.5-2012檢測，均未檢出志賀氏菌），加入到225 mL志賀氏菌增菌肉湯中，添加 1～10，10～50，50～100 CFU 細菌，36℃增菌培養(yǎng)6，8 h后，采用熒光RPA和實時熒光PCR方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 特異性試驗

以志賀氏菌和其它細菌DNA作為模板進行熒光RPA檢測，結果表明，僅志賀氏菌呈現(xiàn)典型的擴增曲線，其它細菌均無擴增，說明本研究建立的熒光RPA檢測方法具有較強的特異性（表1）。

2.2 靈敏性試驗

經(jīng)核酸蛋白分析儀測定志賀氏菌菌液DNA質(zhì)量濃度為35 ng/μL，將其稀釋至 3.5×10-5ng/μL，以不同質(zhì)量濃度的基因組DNA為模板進行熒光RPA和實時熒光PCR反應。結果表明，3.5×10-3ng/μL菌液質(zhì)量濃度為熒光RPA方法的最低檢出限，與實時熒光PCR方法檢出限一致（圖1），說明本研究建立的熒光RPA方法具有很好的靈敏性。

2.3 人工污染樣品的檢測結果

通過熒光RPA方法對志賀氏菌增菌液培養(yǎng)后的西蘭花、雞肉樣品進行檢測。結果表明，3個梯度菌液質(zhì)量濃度的污染量在增菌時間為8 h時，兩種樣品中的志賀氏菌均可檢出；當樣品污染量為46 CFU/25 g、增菌時間為6 h時，雞肉樣品中志賀氏菌可檢出，而西蘭花樣品中未能檢出；當樣品污染量為101 CFU/25 g、增菌時間為6 h時，兩種樣品中的賀氏菌均可檢出。兩種方法對所有樣品的檢測結果一致，而real-time RPA僅需要7～12 min，而real-time PCR則需要35 min以上（Ct值為27～34之間）（表3）。

圖1 志賀氏菌熒光 RPA和實時熒光PCR檢出限分析Fig.1 The detection limit analysis of Shigella with real-time RPA and real-time PCR

表3 熒光RPA和實時熒光PCR方法檢測人工污染樣品Table3 Detection of artificial contamination samples by real-time RPA and real-time PCR

3 討論

志賀氏菌主要造成人的急性侵襲性腸道感染[11]，會對人類健康造成嚴重威脅，是一種重要的食源性致病菌。本文以志賀氏菌ipaH基因為靶基因，建立了一種可以有效檢測志賀氏菌的realtime RPA方法。該方法特異性強，靈敏度高，在39℃恒溫下僅需要20 min即可完成檢測。

目前已建立了多種志賀氏菌的檢測方法。常規(guī)的檢驗程序需要增菌，選擇性平板分離培養(yǎng)，生化試驗，血清學分離鑒定等，耗時長，操作繁瑣，難以滿足大批量樣品檢測或突發(fā)公共衛(wèi)生事件處理的需求[12]。在分子生物學檢測方面，常用的方法包括聚合酶鏈式反應（PCR）、環(huán)介導等溫擴增法（LAMP）和基因芯片技術等[13]。PCR反應由變性、退火、延伸3個基本步驟構成，反應完成后進行電泳檢測，必要時需要對產(chǎn)物進行純化或測序分析，一般需要經(jīng)驗豐富的技術人員進行操作，且PCR設配昂貴。LAMP擴增目的片段時依賴于一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶和4～6條能夠識別靶序列6個特異區(qū)域的引物[14]，引物設計較為繁瑣，其擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測呈梯度條帶，不易與非特異性條帶區(qū)分[15]。與上述方法相比，本研究中建立的real-time RPA方法具有如下優(yōu)勢：（1）操作簡便，僅需增菌提取核酸后即可上機檢測，所有試劑均以凍干粉的形式保存在反應管中；（2）反應時間短，不需要熱變性，20 min內(nèi)即可完成；（3）反應結果可直接觀察，無需電泳檢測；（4）便攜式熒光檢測設備的使用。本研究中使用的Genie III等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)體積小，便于攜帶，觸摸式操作系統(tǒng)，結果觀察直觀，內(nèi)置鋰電池可持續(xù)工作20 h，可用于微生物性食品中毒事件引起的現(xiàn)場檢測[16-18]。

本研究中運用建立的real-time RPA方法，對人工污染志賀氏菌的不同樣品進行檢測，當樣品污染量為46 CFU/25 g、增菌6 h時，雞肉中可檢出志賀氏菌，西蘭花中未能檢出。在細菌污染量、增菌時間相同的情況下，雞肉中志賀氏菌檢出所需要的時間均小于西蘭花樣品，這可能由于不同基質(zhì)提取核酸的效率不同，或是不同介質(zhì)中細菌繁殖數(shù)量有差異導致。本研究中real-time RPA和real-time PCR檢測結果一致，然而前者檢測所需時間明顯短于后者。

本研究建立針對志賀氏菌的real-time RPA方法特異性強，靈敏性高，操作簡單，反應時間短，可以實現(xiàn)對食品樣品中志賀氏菌的有效檢測，并可以用于現(xiàn)場檢測，為食品和食源性公共衛(wèi)生事件中的志賀氏菌的檢測提供了一種新方法。