HPLC同時(shí)測(cè)定唐古特大黃地上部分6種化學(xué)成分含量

陳麗萍 李茂星 馬幸福

摘要：目的 建立HPLC同時(shí)測(cè)定唐古特大黃地上部分中大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、番瀉苷A和番瀉苷B共6種成分含量的方法。方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min，70%B；5 min，65%B；8～16 min，60%B；18～23 min，55%B；25～30 min，45%B；32～39 min，35%B；49～57 min，24%B；65～72 min，20%B）；流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫為室溫，按外標(biāo)法定量分析。結(jié)果 大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、番瀉苷A、番瀉苷B在一定范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好（r≥0.999 5），方法的精密度RSD為0.75%～1.17%，重復(fù)性RSD為0.99%～2.06%，穩(wěn)定性RSD為0.97～1.76%，平均加樣回收率為99.7%～100.4%。唐古特大黃根和地上部分6種化學(xué)成分含量存在差異。結(jié)論 所建立的方法能同時(shí)測(cè)定唐古特大黃地上部分6種成分的含量，可作為大黃地上部分化學(xué)成分含量測(cè)定的參考方法。

關(guān)鍵詞：唐古特大黃；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；蘆薈大黃素；番瀉苷A；番瀉苷B；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.018

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）10-0076-05

Simultaneous Determination of Contents of 6 Components in Aerial Part of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf by HPLC Method CHEN Li-ping， LI Mao-xing， MA Xing-fu （Department of Pharmacy， Lanzhou General Hospital of PLA， Key Laboratory of the Prevention and Cure for the Plateau Environment Damage， PLA， Lanzhou 730050， China）

Abstract： Objective To develop an HPLC method to determine the contents of chrysophanol， emodin， physcion， aloe-emodin， sennoside A， and sennoside B simultaneously in the aerial part of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf. Methods The analysis was achieved with an Agilent ZORBAX SB-C18 analytic column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） by gradient elution of methanol-0.1% phosphoric acid in water gradient elution system （0 min， 70% B； 5 min， 65% B； 8–16 min， 60% B； 18–23 min， 55% B； 25–30 min， 45% B； 32–39 min， 35% B； 49–57 min， 24% B； 65–72 min， 20% B）. The flow rate was 1.0 mL/min； detection wavelength was 254 nm； the column temperature was room temperature； the quantification used external standard method. Results The peak areas and concentrations of chrysophanol， emodin， physcion， aloe-emodin， sennoside A， and sennoside B showed good linear relationship within a certain concentration range （r≥0.999 5）； the RSD of precision was 0.75%–1.17%； the RSD of repeatability was 0.99%–2.06%； the RSD of stability was 0.97%–1.76%； the average recoveries were 99.7%–100.4%. The results showed that there were differences in content between the root and aerial part of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf. Conclusion HPLC method for simultaneous determination of contents of 6 contents of the aerial part of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf can be used as the references for quality control.

Key words： Rheum tanguticum Maxim.ex Balf； chrysophanol； emodin； physcion； aloe-emodin； sennoside A； sennoside B； HPLC

大黃被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為中品，以干燥根和根莖入藥，《中華人民共和國藥典》規(guī)定的原植物為蓼

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（30672643、30472186、30772773）；甘肅省自然科學(xué)基金（3ZS051-A25-078）

通訊作者：李茂星，E-mail：limaox2005@aliyun.com

科植物唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.、掌葉大黃Rheum palmatum L.或藥用大黃Rheum officinale Baill.[1]，屬多年生宿根草本植物。唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.又稱“雞爪大黃”，主產(chǎn)于甘肅、青海、西藏等海拔2500 m以上的高寒、高海拔地區(qū)[2]，在我國已有多年的栽培歷史。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，3種正品大黃中，唐古特大黃的質(zhì)量較優(yōu)，在某些藥理藥效方面勝于掌葉大黃和藥用大黃[3]。唐古特大黃具有瀉熱攻堅(jiān)、化瘀行滯、清火解毒消腫功效和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[4]，藥用歷史悠久，臨床療效確切，是我國常用傳統(tǒng)大宗中藥材。

通常入藥用唐古特大黃為生長(zhǎng)周期3年或5年的根、根莖的切制或炮制品。每年6～7月為大黃葉茂期，這一時(shí)期地上部分枝葉繁盛，葉柄莖枝粗壯，但采收時(shí)常依據(jù)傳統(tǒng)做法，將地上部分作為非藥用部位摒棄不用。在甘肅甘南州大黃藥材GAP種植基地，每年大黃葉盛期都要耗費(fèi)大量人工對(duì)地上部分進(jìn)行酌情摘減，以確保根莖部正常生長(zhǎng)。大黃地上部分每年秋季自然枯萎，年年可采，資源豐富。如果能對(duì)其進(jìn)一步綜合開發(fā)利用，將產(chǎn)生很大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

為發(fā)掘新的藥用部位，使資源可持續(xù)發(fā)展，本研究對(duì)唐古特大黃生長(zhǎng)期地上部分的化學(xué)成分進(jìn)行分析，對(duì)其主要有效成分進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，以期為擴(kuò)大新藥源、合理使用中藥材資源提供新的思路和有力依據(jù)，為綜合開發(fā)利用及深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，Waters 996紫外檢測(cè)器，Waters 600泵；Mettler AE 240電子分析天平（瑞典），Sorvall Legend Micro 17型電動(dòng)離心機(jī)（Thermo Fisher），KQ-100A型超聲波清洗機(jī)（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

番瀉苷A對(duì)照品（批號(hào)YJ-C3-WG1160324）、番瀉苷B對(duì)照品（批號(hào)YJ-C3-WG1160324），江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，純度均大于98%；蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)795-201503）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)756-201509）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)895-201526）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)758-201506），中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%。甲醇（色譜純），SPECTRUM CHEMICAL MFG. CORP；甲醇（分析純），立安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司；磷酸（分析純），天津科密歐化學(xué)試劑公司；滅菌注射用水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）；自制超純水，其他試劑均為分析純。

甘肅省甘南州瑪曲縣中藥材GAP示范園區(qū)種植的3年生唐古特大黃種株，分別于2016年6月3日、7月5日采收地上部分，并按不同部位分解后，置于通風(fēng)干燥處陰干，備用。所采藥材均由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科李茂星博士鑒定為唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.。樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0 min，70%B；5 min，65%B；8～16 min，60%B；18～23 min，55%B；25～30 min，45%B，32～39 min，35%B，49～57 min，24%B，65～72 min，20%B）；柱溫為室溫；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 ?L；分析時(shí)間72 min。在此色譜條件下，指標(biāo)性成分可與其他組分達(dá)到基線分離，且峰形良好。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取番瀉苷A 0.002 1 g、番瀉苷B 0.002 6 g、蘆薈大黃素0.001 7 g、大黃素0.001 8 g、大黃酚0.001 1 g、大黃素甲醚0.002 9 g，分別用甲醇定容于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.21、0.26、0.17、0.18、0.11、0.29 mg/mL的對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液各1 mL，加入10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得含番瀉苷A 0.021 mg/mL、番瀉苷B 0.026 mg/mL、蘆薈大黃素0.017 mg/mL、大黃素0.018 mg/mL、大黃酚0.011 mg/mL、大黃素甲醚0.029 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，4 ℃冰箱保存，備用。

2.3 供試品溶液制備

將低溫烘干至恒重的樣品粉碎后過40目篩。取本品粉末約1 g，精密稱定后，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W，80 kHz）提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 ?m微孔濾膜過濾，將續(xù)濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，70%甲醇定容，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液2、4、8、16、32 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以對(duì)照品進(jìn)樣量（?g）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 ?L，測(cè)定番瀉苷A、番瀉苷B、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積積分值，計(jì)算其RSD，結(jié)果分別為1.13%、0.75%、0.98%、1.16%、1.17%、1.06%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在制備后0、2、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，每次進(jìn)樣10 ?L，記錄峰面積積分值，計(jì)算番瀉苷A、番瀉苷B、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積RSD，結(jié)果分別為0.98%、1.02%、1.06%、0.97%、1.76%、1.05%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品粉末約1 g，共6份，分別精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算番瀉苷A、番瀉苷B、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積RSD，結(jié)果分別為1.15%、0.99%、1.05%、2.06%、1.03%、1.17%，表明本法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品粉末6份，每份0.25 g，分別精密加入混合對(duì)照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 ?L，測(cè)定番瀉苷A、番瀉苷B、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

3 討論

本課題組通過實(shí)地考察甘肅甘南州大黃GAP基地，以及對(duì)大黃各部分化學(xué)成分予以試驗(yàn)分析后發(fā)現(xiàn)，5-7月份是大黃生長(zhǎng)期，尤以6月份長(zhǎng)勢(shì)明顯，此時(shí)枝葉繁茂，葉莖、花莖粗壯，地上各部分的有效成分含量均較高；7月份以后，地上莖逐漸木質(zhì)化，葉發(fā)黃、漸枯萎，化學(xué)成分含量有較大幅度降低。提示大黃地上部分的最佳采收期是葉茂期（6月），這一時(shí)間與中醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)上關(guān)于葉類藥材采收期的界定相一致。

大黃傳統(tǒng)上以根和根莖入藥。本課題研究發(fā)現(xiàn)，大黃地上部分含有與根及根莖類似的藥用成分，如游離蒽醌和二蒽酮類。葉莖和花莖中游離蒽醌種類和含量均較根莖低，但二蒽酮類成分在唐古特大黃中各部位含量均較高，尤以葉片和花序中番瀉苷A、B含量為高。國外藥典中，常把是否含有番瀉苷作為正品大黃的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)之一[5]。我國也有文獻(xiàn)報(bào)道，唐古特大黃是藥典規(guī)定大黃藥材來源中品質(zhì)較優(yōu)的一種[3]。番瀉苷A、B等二蒽酮類是大黃瀉下活性的主要藥效成分，具有清熱行滯利水、排毒養(yǎng)顏的功效，并有一定抗菌活性[6]，可廣泛用于藥品和保健品。現(xiàn)已有許多學(xué)者對(duì)大黃中二蒽酮類成分予以關(guān)注并進(jìn)行了相關(guān)研究報(bào)道[7-8]。因此，可以考慮對(duì)大黃地上部分中的番瀉苷進(jìn)行富集提取，有效利用大黃地上部分資源，既可擴(kuò)大藥源，又能提高藥用植物資源利用率。

公元8世紀(jì)，著名藏醫(yī)學(xué)家宇妥·元丹貢布《四部醫(yī)典》有記載，我國西藏、青海、甘肅等地的群眾，不僅以大黃的根部作藥材，也使用大黃屬植物地上部位的葉柄和幼嫩莖枝解渴、除翳。延續(xù)至今，我國南方和甘肅甘南的局部地區(qū)農(nóng)牧民仍有食用唐古特大黃新鮮葉莖、花莖的習(xí)慣，因其肉厚多汁、口感較佳，深受當(dāng)?shù)鼐用竦南矏踇9]。本課題組于2016年6月赴甘肅省甘南州瑪曲縣采集藥材的過程中發(fā)現(xiàn)，大黃葉莖和花莖粗壯，且肉厚多汁，味酸爽，口感較佳。當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民常剝?nèi)ネ馄ど曰蜃鳛槭卟耸秤?，這也進(jìn)一步確證了《四部醫(yī)典》和《妙音本草》中有關(guān)食用大黃屬植物地上部位的葉柄和嫩枝的記載。大黃葉柄在國外常被用作食品調(diào)味劑等，通常被制成果醬、餡餅、飲料、酒品等，美國、英國等國家也已把大黃作為藥食兩用的基材[10]。隨著大黃研究的不斷深入和野生資源的相對(duì)匱乏，進(jìn)一步開發(fā)大黃的多種藥用部位已迫在眉睫。本研究初步建立了同時(shí)測(cè)定大黃地上各部分中6種化學(xué)成分含量的方法，為開發(fā)利用大黃地上植物資源提供了一定方法，也為民間食用大黃地上莖枝提供了依據(jù)。

大黃葉、葉莖、花莖、花序以及根和根莖中都含有蒽醌、二蒽酮、有機(jī)酸和鈣、鐵、鋅等各種微量元素[11]，可以根據(jù)不同使用目的，分部位區(qū)別應(yīng)用大黃藥材。如減肥藥品和食品可以考慮使用大黃葉莖和花莖，不僅本身口感較佳，不需要額外添加矯味劑，而且具有瀉下作用的番瀉苷含量適中，不會(huì)導(dǎo)致急性腹瀉。對(duì)于大黃葉的急性毒性、長(zhǎng)期毒性等方面的研究，本課題組將進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2017-02-13）

（修回日期：2017-03-24；編輯：陳靜）