三波長切換法同時(shí)測定仙靈骨葆膠囊中淫羊藿苷等5種活性成分含量

馮良 褚書豪 汪小彩

摘要：目的 建立三波長切換法同時(shí)測定仙靈骨葆膠囊中淫羊藿苷等5種活性成分含量的方法。方法 采用Waters Atlantis T3 C18色譜柱（250mm×4.6mm，5 ?m）；以乙腈（A）-0.05%甲酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，12%～20%A；5～15 min，20%～55%A；15～35 min，55%A；35～55 min，55%～76%A；55.1 min，12%A；55.1～60 min，12%A）；檢測波長：0～30 min為212 nm，>30～42 min為246 nm，>42～60 min為270 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min。結(jié)果 川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷分別在101.6～3048 ng、8.7～261 ng、7.9～237 ng、117.2～3516 ng、78～2340 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；儀器精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中RSD均小于3%；平均回收率分別為99.83%、100.35%、100.59%、100.60%、99.72%，RSD均小于3%。結(jié)論 該測定方法準(zhǔn)確度、靈敏度高，分離效果理想，可為完善仙靈骨葆膠囊質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：仙靈骨葆膠囊；淫羊藿苷；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素；朝霍定C

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.016

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）10-0068-04

Simultaneous Determination of Epimedium Glycoside and Other 4 Kinds of Active Ingredients in Xianling Gubao Capsules by Three Wavelength Switching Method FENG Liang， CHU Shu-hao， WANG Xiao-cai （Pharmacy Department， Third Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450008， China）

Abstract： Objective To establish the method for simultaneous determination of epimedium glycoside and other 4 kinds of active ingredients in Xianling Gubao Capsules by three wavelength switching method. Methods An Waters Atlantis T3 C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） was used with the mixture of acetonitrile-0.05% formic acid solution as the mobile phase in gradient elution （0–5 min， 12%–20% A； 5–15 min， 20%–55% A； 15–35 min， 55% A； 35–55 min， 55%–76% A； 55.1 min， 12% A； 55.1–60 min， 12% A）. Detection wavelength was as follow： 0–30 min， 212 nm； 30–42 min， 246 nm； 42–60 min， 270 nm. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃. Results The calibration curves of asperosaponin Ⅵ， psoralen， angelicin， epimedin C， and icariin were in good linearity among the ranges of 101.6–3048 ng， 8.7–261 ng， 7.9–237 ng， 117.2–3516 ng， 78–2340 ng， respectively. In the instrument precision test， stability test， repeatability test， the RSD was less than 3%. The average recoveries were 99.83%， 100.35%， 100.59%， 100.60%， 99.72%， respectively， and all the RSD were less than 3%. Conclusion The method is sensitive， accurate， and separation effect is good， which can provide a basis for quality evaluation standard of Xianling Gubao Capsules.

Key words： Xianling Gubao Capsules； icariin； asperosaponin Ⅵ； psoralen； angelicin； epimedin C

仙靈骨葆膠囊是淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃6種中藥經(jīng)現(xiàn)代工藝技術(shù)制成的膠囊劑，具有滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)、強(qiáng)筋壯骨功效，臨床用于骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松癥、骨折、骨關(guān)節(jié)炎、骨無菌性壞死等病癥的治療[1-3]。目前，仙靈骨葆膠囊的質(zhì)量主要以淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量衡量[4-6]，而對其他成分或多種成分同時(shí)測定的研究報(bào)道甚少。淫羊藿苷、朝霍定C是淫羊藿的主要成分，檢測波長270 nm[7-8]；川續(xù)斷皂苷Ⅵ是續(xù)斷的主要成分，檢測波長212 nm[9-10]；補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂的主要成分，檢測波長246 nm[11-12]。這5種成分檢測波長不一致且差異較大，不能采用常規(guī)方法檢測。本研究以淫羊藿苷、朝霍定C、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、川續(xù)斷皂苷Ⅵ為指標(biāo)，采用波長切換方法，用RP-HPLC同時(shí)測定仙靈骨葆膠囊中5種活性成分含量，旨在拓展仙靈骨葆膠囊的綜合質(zhì)量評價(jià)方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），Sartorius BP211D分析天平（德國賽多利斯集團(tuán)），KQ-100DA超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

淫羊藿苷對照品（批號073729910）、補(bǔ)骨脂素對照品（批號110739-201115）、異補(bǔ)骨脂素對照品（批號110738-201012）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（批號111685-201003）、梓醇對照品（批號110808-201210），中國食品藥品檢定研究院。朝霍定C對照品（批號MUST-13122312），中國科學(xué)院成都生物研究所。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。仙靈骨葆膠囊，規(guī)格0.5 g×40粒/瓶，國藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司，批號1509007、1605066、1606007。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Atlantis T3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相為乙腈（A）-0.05%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，12%～20%A；5～15 min，20%～55%A；15～35 min，55%A；35～55 min，55%～76%A；55.1 min，12%A；55.1～60 min，12%A）；檢測波長：0～30 min為212 nm，>30～42 min為246 nm；>42～60 min為270 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min。5種成分色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算不低于5000。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷對照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為2.54、0.87、0.79、2.93、1.95 mg/mL各對照品貯備液。精密量取各對照品貯備液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成混合對照品溶液，濃度分別為101.6、8.7、7.9、117.2、78 mg/mL，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品約0.4 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加60%甲醇50 mL，精密稱定，超聲（頻率40 kHz，功率100 W）處理30 min，冷卻后精密稱定，用60%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，0.45 ?m濾膜過濾，即得。

2.4 陰性對照溶液制備

按仙靈骨葆膠囊處方制備缺淫羊藿、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂的粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。在上述色譜條件下測定，結(jié)果川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷相應(yīng)的保留時(shí)間無干擾。

A

B

C

注：A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照；

1.川續(xù)斷皂苷Ⅵ；2.補(bǔ)骨脂素；3.異補(bǔ)骨脂素；4.朝霍定C；5.淫羊藿苷

圖1 仙靈骨葆膠囊中5種成分HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取1、5、10、15、20、30 ?L混合對照品溶液，注入色譜儀，以進(jìn)樣量為自變量，峰面積為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液10 ?L，按上述色譜條件測定，以各峰面積分別計(jì)算，川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷RSD分別為1.56%、1.79%、1.86%、0.47%、0.89%（n=5）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液（樣品批號1509007），于0、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣10 ?L進(jìn)行含量測定，峰面積RSD分別為0.83%、1.54%、1.43%、0.29%、0.76%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號1509007），制備供試品溶液，共6份，進(jìn)樣10 ?L，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果分別為8.31、0.82、0.87、11.85、6.53 mg/g。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號1509007），共9份，每份約0.2 g，精密稱定，按照樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷含量一半的80%、100%、120%比例精密加入各對照品貯備液，再按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2～表6。

2.10 樣品含量測定

取3個(gè)批號仙靈骨葆膠囊樣品，制備供試品溶液，并在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算仙靈骨葆膠囊中5種成分的含量，結(jié)果見表7。

3 討論

仙靈骨葆膠囊處方中，淫羊藿為君藥，2015年版《中華人民共和國藥典》對淫羊藿的質(zhì)量控制指標(biāo)為淫羊藿苷，但朝霍定C在淫羊藿中含量較大，若僅以淫羊藿苷作為考察指標(biāo)則有片面性，因此，本研究采用淫羊藿苷和朝霍定C含量共同監(jiān)測仙靈骨葆膠囊中淫羊藿的內(nèi)在質(zhì)量。補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素均為補(bǔ)骨脂的指標(biāo)性成分，川續(xù)斷皂苷Ⅵ是續(xù)斷的指標(biāo)性成分，同時(shí)對川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷5種成分進(jìn)行含量測定，為仙靈骨葆膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了依據(jù)，具有一定實(shí)用價(jià)值。

本試驗(yàn)探討了水、10%甲醇、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇及甲醇提取溶劑對樣品中的川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷含量的影響，結(jié)果顯示，以60%甲醇為提取溶劑既能保證提取完全，又能兼顧5種成分含量，故選取60%甲醇作為提取溶劑。同時(shí)，比較了不同超聲處理時(shí)間（10、20、30、45、60 min），結(jié)果顯示，超聲30 min時(shí)5種成分含量已經(jīng)達(dá)到了最大值，因此，選擇超聲處理時(shí)間為30 min。

在流動相系統(tǒng)的考察中，對比甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)，甲醇具有強(qiáng)的氫鍵作用能力，可在固定相材料表面與水競爭吸附從而干擾吸附水層的形成，嚴(yán)重縮短樣品分子的保留時(shí)間，因此，流動相使用乙腈-水；此外，調(diào)節(jié)了流動相的pH值，發(fā)現(xiàn)流動相為乙腈-0.05%甲酸溶液系統(tǒng)效果較為理想，分離效果俱佳，分離度均大于1.5，能完成對川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷的分離，各峰的對稱因子均在0.95～1.05之間。

仙靈骨葆膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷5種成分的紫外吸收行為各不相同，通過對各對照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示，川續(xù)斷皂苷Ⅵ在212 nm、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在246 nm、朝霍定C和淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收，按照5種成分在色譜上的保留行為即保留時(shí)間，將檢測波長設(shè)定為212 nm（0～30 min）、246 nm（30～42 min）、270 nm（42～60 min），3個(gè)波長實(shí)現(xiàn)切換，同時(shí)滿足5種成分的定性及定量測定。

對3批仙靈骨葆膠囊中淫羊藿苷等5種活性成分的含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，3批樣品川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷含量差異較小，說明工藝較為穩(wěn)定、成熟。

綜上所述，本試驗(yàn)建立了不同波長切換法同時(shí)測定仙靈骨葆膠囊中淫羊藿苷等5種活性成分含量的方法，該方法靈敏、準(zhǔn)確，分離效果較好，無干擾，可為完善仙靈骨葆膠囊質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳鑫，朱雄白，林文軍，等.仙靈骨葆膠囊治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的療效及其機(jī)制研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2015，31（10）：827-829，854.

[2] 董舒，解俊杰.仙靈骨葆膠囊治療胸腰椎骨質(zhì)疏松性骨折54例[J].中國藥業(yè)，2014，23（14）：95-96.

[3] 董君博.骨肽片聯(lián)合仙靈骨葆膠囊對經(jīng)傷椎置釘結(jié)合植骨治療骨質(zhì)疏松性胸腰椎骨折術(shù)后恢復(fù)效果的影響[J].中國藥房，2016，27（6）：746- 748.

[4] 伍慶，周寧，馮澤熹，等.HPLC測定仙靈骨葆膠囊中淫羊藿苷和淫羊藿定C含量[J].中成藥，2009，31（8）：1211-1213.

[5] 謝琴，王菊美，黃禮杰，等.仙靈骨葆膠囊多指標(biāo)成分的定量研究[J].中成藥，2001，23（6）：411-414.

[6] 龔琴丹，陳宗良，陳桂茜.HPLC法測定仙靈骨葆膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素[J].中草藥，2016，47（16）：2868-2870.

[7] 李銳華，徐小倩，張小強(qiáng)，等.HPLC法同時(shí)測定淫羊藿總黃酮膠囊中5種黃酮類成分[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（9）：1813-1817.

[8] 張小強(qiáng)，張小龍，楊晶，等.淫羊藿總黃酮膠囊指紋圖譜研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2016，18（8）：1051-1054.

[9] 謝仕偉，梁沃華.HPLC法測定續(xù)斷配方顆粒中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J].中國中醫(yī)藥咨訊，2011，3（3）：246.

[10] 張志堅(jiān)，胡曉慶，李鏡友，等.蛤蚧大補(bǔ)丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].臨床合理用藥雜志，2012，5（7）：54-55.

[11] 江麗，申國慶，龔春燕.HPLC法同時(shí)測定復(fù)方紫靈膠囊中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、大黃素和丹參酮ⅡA的含量[J].中國藥師，2013，16（10）：1482-1485.

[12] 莫志斌.HPLC梯度洗脫法同時(shí)測定參茸延齡片中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（10）：86-89.

（收稿日期：2017-03-24）

（修回日期：2017-04-01；編輯：陳靜）