HPLC-DAD和LC/MS/MS測(cè)定豆奶中三聚氰胺

尤 妍

(玉環(huán)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江臺(tái)州 317608)

HPLC-DAD和LC/MS/MS測(cè)定豆奶中三聚氰胺

尤 妍

(玉環(huán)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江臺(tái)州 317608)

目的：建立二極管陣列高效液相色譜儀和三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)豆奶中三聚氰胺的測(cè)定方法。方法：采用三氯乙酸和乙腈為提取劑、蛋白質(zhì)為沉淀劑，提取液過(guò)凈化柱純化。結(jié)果：三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)三聚氰胺的檢出限為0.001 5 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.01～0.5 μg/mL范圍內(nèi)，R2為0.999 8，線性良好，再回收率為85 %～89 %，適用于檢測(cè)低濃度的樣品；二極管陣列高效液相色譜法檢出限為0.024 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.5～100 μg/mL范圍內(nèi)，R2為0.999 9，線性良好，回收率為83 %～91 %，可以快速地對(duì)高濃度樣品進(jìn)行篩查。結(jié)論：以上兩種檢測(cè)方法結(jié)合使用，可檢測(cè)0.01～100 mg/kg的三聚氰胺含量，極大地拓寬了檢測(cè)范圍。

二極管陣列高效液相色譜；三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用；三聚氰胺；豆奶

近幾年，我國(guó)豆奶行業(yè)市場(chǎng)消費(fèi)量逐年上升，低價(jià)豆奶充斥市場(chǎng)，豆奶品質(zhì)令人擔(dān)憂。蛋白質(zhì)含量是豆奶的重要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)，而三聚氰胺含氮量高，在豆奶中添加三聚氰胺可顯著提高其蛋白含量。檢測(cè)豆奶中三聚氰胺的含量能有效管控豆奶的品質(zhì)，而目前對(duì)豆奶中三聚氰胺的檢測(cè)鮮有報(bào)道。

檢測(cè)三聚氰胺的方法主要有膠體金免疫層析法、可見近紅外光譜法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法等[1-11]。酶聯(lián)免疫法和紅外光譜法可以快速實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的定性鑒別；高效液相色譜法和氣/液質(zhì)聯(lián)用法可對(duì)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)[12-14]。其中，氣質(zhì)聯(lián)用法前處理過(guò)程復(fù)雜；高效液相色譜法快速、易操作，儀器較常見，能滿足一般檢測(cè)的需求，但是雜質(zhì)干擾多，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；液質(zhì)聯(lián)用法靈敏度高、檢出限低，但是儀器價(jià)格昂貴、維修費(fèi)用高。

2008年，我國(guó)制定三聚氰胺在乳與乳制品中的臨時(shí)管理值：嬰幼兒配方乳粉的限量值為1 mg/kg，液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉及其他配方乳粉的限量值為2.5 mg/kg。2012年7月5日，聯(lián)合國(guó)負(fù)責(zé)制定食品安全標(biāo)準(zhǔn)的國(guó)際食品法典委員會(huì)為三聚氰胺設(shè)定了新標(biāo)準(zhǔn)，液態(tài)牛奶中三聚氰胺限量值為0.15 mg/kg。本實(shí)驗(yàn)研究二極管陣列高效液相色譜儀和三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)豆奶中三聚氰胺的測(cè)定方法，利用質(zhì)譜法降低三聚氰胺的檢出限，拓寬檢測(cè)范圍，為三聚氰胺的日常檢測(cè)提供依據(jù)，為解決豆奶市場(chǎng)中偽劣產(chǎn)品帶來(lái)的安全隱患提供新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液質(zhì)聯(lián)用儀由Thermo液相系統(tǒng)串聯(lián)Thermo TSQ Quantiva 和 TSQ Endura三重四級(jí)桿質(zhì)譜組成，賽默飛(世爾)科技有限公司；二極管陣列高效液相色譜儀由Agilent 1260液相系統(tǒng)和DAD檢測(cè)器組成，安捷倫科技有限公司；梅特勒XS205DH電子天平(萬(wàn)分之一)，梅特勒；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；美國(guó)Organomation N-EVAP-12位水浴氮吹儀；Neofuge 18R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；Milli-Q Direct 16超純水處理器；三聚氰胺對(duì)照品，甲醇(HPLC)、乙腈(HPLC)、乙酸銨(HPLC)、辛烷磺酸鈉(HPLC)、三氯乙酸(AR)、氨水(AR)、檸檬酸(AR)；陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化柱：Poly-Sery MCX。

1.2 HPLC-DAD條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：離子對(duì)試劑(檸檬酸、辛烷磺酸鈉，pH=3)：乙腈=82∶18；檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3 LC/MS/MS條件

色譜柱：Thermo syncronis HILIC(2.1mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相：乙酸銨(10 mmol/L，pH=3)：乙腈=40∶60；進(jìn)樣量：10 μL；電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測(cè)模式，多反應(yīng)檢測(cè)；離子噴霧電壓：4 000V；離子傳輸管溫度：350℃；霧化溫度：300℃；鞘氣流速：40Arb；輔氣流速：5Arb；停留時(shí)間：300ms；分辨率Q1：0.7FWHM；分辨率Q3：0.7FWHM；碰撞氣壓力：1.5mTorr。

1.4 樣品處理

稱取2.00 g樣品，置于50 mL離心管中，加10 %三氯乙酸15 mL、乙腈5 mL，超聲30 min，4 000 r/min離心15 min，用中速濾紙過(guò)濾后，用10 %三氯乙酸定容至25 mL；吸取10 mL，經(jīng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化(Poly-Sery MCX)，經(jīng)50 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，? mL流動(dòng)相定容，渦旋混勻1 min，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的確定

在豆奶中添加三聚氰胺的主要作用是增加樣品的蛋白質(zhì)含量，待測(cè)樣品中主要含有蛋白質(zhì)。三聚氰胺是強(qiáng)極性的小分子化合物，溶于乙腈，乙腈能沉淀蛋白質(zhì)，三氯乙酸是一種強(qiáng)有機(jī)酸，溶于水、乙腈等，可作為蛋白質(zhì)的沉淀劑，用10%的三氯乙酸和乙腈溶液能較好地提取三聚氰胺并沉淀蛋白質(zhì)。

2.2 HPLC-DAD參數(shù)的選擇

利用DAD對(duì)三聚氰胺進(jìn)行200～400 nm波長(zhǎng)掃描(附圖)。三聚氰胺在236 nm的波長(zhǎng)下有最大吸收峰。在210 nm處雖有最大吸收峰，但是檢測(cè)波長(zhǎng)小，樣品雜質(zhì)干擾多，不利于檢測(cè)。綜上，選擇236 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

附圖 三聚氰胺吸收光譜

2.3 LC/MS/MS參數(shù)的選擇

取1 μg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，以流動(dòng)注射的方式，注入帶電噴霧離子源的串聯(lián)質(zhì)譜中，正離子模式下掃描得m/z為127的母離子，通過(guò)子離子掃描，選擇2對(duì)子離子，定量離子m/z 85、碰撞能量18V；定量離子m/z 68、碰撞能量28V，并優(yōu)化相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用流動(dòng)相配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用二極管陣列高效液相色譜儀和三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，表1結(jié)果表明，兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，R2均大于0.999，HPLC-DAD法的線性范圍為0.5～80 μg/mL，LC/MS/MS法的線性范圍為10～500 ng/mL，本實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)三聚氰胺的濃度范圍為10ng/mL～80ng/mL。

表1 不同方法制得的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線

2.5 檢出限與精密度

根據(jù)3倍信噪比×稀釋倍數(shù)(2.5)/稱樣量(2 g)得三聚氰胺的檢出限，10倍信噪比×稀釋倍數(shù)(2.5)/稱樣量(2 g)得其定量限。分別取0.5 μg/mL和0.01 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)HPLC-DAD和LC/MS/MS分析，平行進(jìn)樣6次，計(jì)算三聚氰胺的保留時(shí)間精密度和峰面積精密度。表2結(jié)果表明，兩種方法的保留時(shí)間和峰面積精密度均小于2 %，方法的精密度良好。HPLC-DAD法的檢出限是LC/MS/MS法檢出限的16倍，LC/MS/MS法能極大地降低樣品的檢出濃度。

表2 檢出限、定量限和精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 回收率

在空白豆奶中添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(表3)。樣品中三聚氰胺含量為2～6 mg/kg時(shí)，HPLC-DAD檢測(cè)的回收率為85%～89%；樣品中三聚氰胺含量為0.04～0.12 mg/kg時(shí)，LC/MS/MS檢測(cè)的回收率為83%～91 %。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

建立了HPLC-DAD和LC/MS/MS測(cè)定豆奶中三聚氰胺的方法。利用這兩種方法能簡(jiǎn)單快速檢測(cè)三聚氰胺殘留量，且靈敏度高，時(shí)間短。本研究利用LC/MS/MS法降低了三聚氰胺的檢出限，采用質(zhì)譜SRM的掃描方式進(jìn)行定量分析，抗干擾能力強(qiáng)，適用于豆奶樣品三聚氰胺含量的檢測(cè)?！?/p>

[1]蘇敏，楊娟，姚志揚(yáng)，等.乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及研究進(jìn)展[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，22(6)：66-68.

[2]王巧華，劉亞麗，馬美湖，等.表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)雞蛋蛋清內(nèi)三聚氰胺的定量方法研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2015，35(4)：919-923.

[3]云環(huán)，嚴(yán)華，張朝暉，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶和奶粉中二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸[J].色譜，2013，31(5)：404-409.

[4]Pan X D，Wu P G，Yang D J，et al.Simultaneous determination of melamine and cyanuric acid in dairy products by mixed-mode solid phase extraction and GC-MS[J].Food Control，2013，30(2)：545-548.

[5]Goscinny S，Hanot V，Halbardier J-F，et al.Rapid analysis of melamine residue in milk products，bakery goods and flour by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry From food crisis to accreditation [J].Food Control，2011，22(2)：226-230.

[6]林祥梅，王建峰，賈廣樂，等.三聚氰胺的毒性研究[J].毒理學(xué)雜志，2008(3)：216-218.

[7]Chansucarn W.Panich S，Imyi A.Simple spectrophotometric method for determination of melamine in liquid milks based on green Mannich reaction[J].Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2013，113(9)：154-158.

[8]Khedr A.Optimized exreaction method for LC-MS determination of bisphenol A，melamine and di(2-eth-ylhexyl)phthalate in selected soft drinks，syringes，and milk power[J]. Journal of Chromatography B，2013，930(6)：98-103.

[9]石向群，劉建云.三聚氰胺檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2009，27(2)：157-159.

[10]Baynes R E，Barlow B，Masom S E，et al.Disposition of melamine residues in blood and milk from dairy goats exposed to an oral bolus of melamine[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48(8-9)：2542-2546.

[11]Sun H W，Wang L X，Ailf，et al.A sensitive and validated method for determination of melamine residue in liquid milk by reversed phase high-performance liquid chromatography with solid-phase extraction[J].Food Control，2010，21(5)：686-691.

[12]Filazi A，Sireli U T，Ekici H，et al.Determination of melamine in milk and dairy products by high performance liquid chromatography[J].Jonrnal of Dairy Science，2012，95(2)：602-608.

[13]趙東豪，黎智廣，黃柯，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中三聚氰胺殘留的比較研究[J].南方水產(chǎn)，2010，6(3)：32-35.

[14]胡強(qiáng)，王延云，李超豪，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定乳及乳制品中三聚氰胺[J].分析與檢測(cè)，2012，38(12)：157-160.

Determination on Melamine in Soy Milk by HPLC-DAD and LC/MS/MS

YOU Yan

(The Inspection Testing Center of Food and Drug in Yuhuan City，Taizhou 317608，China)

【Objective】 To establish a method for the melamine in soy milk by HPLC-DAD and LC/MS/MS.【Method】 we used trichloroacetic acid and acetonitrile to extract and precipitate impurities.The Extraction was purificated by purification column.【Result】 Using LC/MS/MS method，the detection limit was melamine was 0.001 5 mg/kg，the calibration curves showed a good linearity in the range of 0.01～0.5 μg/mL，and the correlation coefficients(R2)was 0.999 8.The recoveries ranged from 85%～89%.The method was applicable to detect low concentration of sample.While using HPLC-DAD method，the detection limit of melamine was 0.024 mg/kg，the calibration curves showed a good linearity in the range of 0.5～100 μg/mL，and the correlation coefficients(R2)was 0.999 9.The recoveries ranged from 83%～91%.It was suitable for high concentration of the detection of the sample.【Conclusion】 The two kinds of detection methods used in combination could detect 0.01～100 mg/kg of melamine，greatly expand the detection range.

Diode Array High Performance Liquid Chromatography (HPLC-DAD)；Triple Level 4 Pole Liquid Ms(LC/MS/MS)；melamine；soy milk

尤妍(1986— )，女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品檢測(cè)。

(責(zé)任編輯 唐建敏)