特殊染色及組織化學技術在病理診斷及科研中的應用

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(1 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科,山東 青島 266003； 2 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科;3 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院東區(qū)特檢科； 4 山東大學齊魯醫(yī)院病理科)

特殊染色和組織化學染色技術是病理學研究常用的方法之一，也是臨床病理診斷中重要的輔助技術之一。近20多年來，隨著免疫組織化學及分子病理等技術的開展，在病理診斷過程中一些需要進行特異性標記的物質的染色，大部分已被免疫組化和分子病理學技術所替代完成，但仍有一些特殊物質標記是不能被這些新技術所替代(如細菌、色素、基底膜等)。特殊染色和組織化學技術具有特異、簡單、快捷、廉價等顯著優(yōu)點，并且這些技術也在發(fā)展和完善，至今還沒有出現(xiàn)更好的、完全替代它的直接顯示細胞內外特殊化學物質的簡便易行的方法和技術[1]。因此，特殊染色和組織化學技術應該引起我們的重視。

1 特殊染色和組織化學染色的概念和機制

特殊染色和組織化學染色常用于顯示在蘇木精-伊紅(HE)染色中難以觀察或觀察不到的組織成分或組織細胞內所含的某些物質，以了解這些物質在組織和細胞中的分布、含量和變化，以研究組織細胞的生理和病理改變及機制。

1.1 特殊染色技術

特殊染色是一項復雜的染色過程，其染色機制目前尚不清楚。一般來說，被染色的物質通過直接與染料結合而呈色，只在特殊情況下才應用，因此習慣稱為特殊染色，以示與常規(guī)HE染色的區(qū)別[2]。常用的特殊染色的染料有很多種，大致分為天然染料如蘇木精、胭脂紅、地衣紅等，合成染料如亞硝基類(萘酚綠-B)、硝基染料(苦味酸、馬休黃等)、偶氮染料(剛果紅、麗春紅、維多利亞綠、蘇丹類等)、重氮鹽類(堅牢紅)、醌亞胺染料(中性紅、甲苯胺藍)、苯甲烷類(堿性品紅、酸性品紅、苯胺藍、亮綠、甲基綠、結晶紫等)；也可按染色對象分為組織染色染料(結締組織和肌纖維、神經組織等)、細胞染料(細胞核、細胞質及細胞化學成分如糖類、脂肪、核酸等)[3]。如Masson三色染色中的肌纖維被麗春紅染成紅色，膠原纖維被苯胺藍染成藍色；PTAH染色中磷鎢酸蘇木精將橫紋肌等染成藍色；剛果紅染色將淀粉樣物質染成紅色，神經髓鞘被亮綠染成綠色等。

1.2 組織化學技術

又稱經典組織化學技術，是將細胞學、組織學和生物化學結合起來的一門染色技術，其原理是應用某些試劑或染料與組織細胞內的化學成分進行特異性反應，或染料分子結構的某些基團與組織內的相應基團特異性結合，通過顏色的變化顯示組織結構中的各種化學成分，并對這些化學物質進行定性、定位、定量，從而研究生物生理或病理狀態(tài)下細胞組織的代謝、功能及形態(tài)變化規(guī)律[3]。如奧辛藍過碘酸雪夫法(ABPAS)染色中Schiff試劑將糖原和中性黏液物質染成紅色，而將酸性黏液物質染成藍色，混合性黏液物質染成紫紅色；用甲基綠-派洛寧法可顯示RNA和DNA；亞鐵氰化鉀將含鐵血黃素染成普魯士藍色；組織中各種酶如三磷酸腺苷酶、琥珀酸脫氫酶、葡萄糖6磷酸酶、乳酸脫氫酶等的染色?？傊彩堑鞍踪|、糖類、核酸、色素、某些金屬、脂肪、酶類等染色都屬于組織化學染色技術。

2 特殊染色和組織化學染色的特點

特殊染色和組織化學染色能對組織細胞中的某些特殊物質進行定性、定量和定位，而普通的生化檢測只能定性和定量。如酶組織化學染色不僅可以檢測出酶的性質，而且可以測定酶的含量(根據(jù)陽性反應的強弱)，確定酶的定位(如琥珀酸脫氫酶定位在線粒體中，酸性磷酸酶和堿性磷酸酶主要定位在溶酶體內，葡萄糖6磷酸酶定位于粗面內質網(wǎng))等。應用Feulgen法顯示DNA，應用甲基綠-派洛寧法顯示DNARNA，并根據(jù)顯示的部位、強弱及染色的深淺對其進行定位、定量、定性分析。應用Masson三色法既可以顯示膠原纖維(陽性或陰性)及其含量的多少(顏色的深淺)，同時還可以觀察到膠原纖維在心肌中的分布。

3 特殊染色和組織化學染色技術在臨床及科研中的應用

特殊染色和組織化學染色技術在臨床和科研上應用非常廣泛。如HE染色不能明確地顯示細菌，而需用特殊的染色：結晶紫-中性紅法可區(qū)分組織中革蘭陽性、陰性菌，苯酚堿性品紅法可用于檢查結核桿菌、麻風桿菌；慢性胃炎、消化性潰瘍等疾病與幽門螺桿菌有密切關系，硝酸銀、美藍法可檢出胃黏膜上皮處的幽門螺桿菌。切片內的真菌HE染色著色差，特別是真菌數(shù)量較少、菌體體積小時更難辨認，應用六胺銀法能較好地顯示各種真菌，特別是對曲菌、毛真菌、放線菌的顯示效果較佳；各種真菌菌壁均含有多糖類物質，高碘酸-無色品紅法可顯示大多數(shù)真菌，是目前應用較為廣泛的方法。新型隱球菌的莢膜由一種黏多糖組成，黏液胭脂紅和愛先藍染色呈陽性反應；淀粉樣蛋白在HE染色中有時和玻璃樣變難以區(qū)別，可用甲醇剛果紅法區(qū)分。臨床上長期肺淤血和出血、肝硬化時慢性脾淤血、陳舊性出血灶等病變中均有含鐵血黃素，采用亞鐵氰化鉀法可將其與組織中出現(xiàn)的黃棕色的色素如瘧色素、黑色素、甲醛色素等區(qū)分。應用AB-PAS可區(qū)分中性黏液和酸性黏液，從而判斷是腸型胃癌還是胃型胃癌。皮膚的色素性蕁麻疹和系統(tǒng)性肥大細胞增生癥的病理診斷需要根據(jù)特異性的肥大細胞染色顯示才能確診；在同一組織中同時出現(xiàn)分化程度較低的癌和肉瘤細胞時，可用Gordon-Sweets法加以鑒別，此法要比免疫組化方法簡單實用的多。一些特殊的神經組織如神經纖維、神經髓鞘、尼氏小體等都可用特殊染色清楚地顯示出來。

4 特殊染色和組織化學染色的技術要求

特殊染色技術與常規(guī)的制片技術有許多相同之處，但在操作程序上較常規(guī)制片要嚴謹?shù)亩?；而組織化學技術則根據(jù)標本中所含物質的不同，要求條件更加嚴格。這需要醫(yī)生和技術員的密切配合。

4.1 對標本取材的要求

用于特殊染色和組織化學染色的材料有冷凍切片、石蠟切片、細胞涂片等。取材時的標本越新鮮越好，以保持生物體的原狀；取材時應盡量避免組織變形、擠壓、破碎；光鏡標本大小不超過1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm。需要酶組織化學染色的標本因需保留組織中酶的活性，因此要用冷凍切片，最好在低溫下(-20 ℃～-18 ℃左右)操作，切好的片子可于-20 ℃或-80 ℃保存。

4.2 對標本固定的要求

特殊染色和組織化學染色時，應盡量保留組織細胞內的化學成分和酶的活性，防止細胞內物質的彌散、移位、溶解、丟失。取材后的標本最好是在離體后10～30 min內立即用相應的固定液固定。但是，組織中的化學物質和酶的種類繁多，其理化性質及特點各不相同，因此應根據(jù)被檢物質的不同選擇不同的固定液及固定方法。最常用的固定方法是組織浸泡法，一般固定液的量不少于組織塊的5倍。固定液的種類有很多種，但至今沒有一種固定液適用于所有的組織染色法。大部分特殊染色和組織化學染色需要的固定液為40 g/L中性緩沖甲醛或40 g/L中性甲醛，40 g/L的甲醛也可用作固定液，但甲醛易被氧化成甲酸，使固定液偏酸性，破壞組織中的某些物質,而影響其他染色。中性緩沖甲醛或中性甲醛的配制方法： 0.1 mol/L磷酸緩沖液90 mL+40 g/L甲醛10 mL或40 g/L甲醛液中加入碳酸鈣至飽和。也有少部分用于特殊染色和組織化學染色的組織或細胞需要用特殊的固定液，以使細胞內的化學物質在組織固定過程中不能溶解，且定位準確。如PTAH染色常用Zenker固定液固定標本，對于已用甲醛固定的切片，則在染色前用Zenker固定液重新固定；Masson染色顯示膠原纖維和肌纖維則最好用Bouin液固定標本。糖原染色時組織絕對不能用甲醛固定液固定，因為甲醛液可使糖原與蛋白質結合而不溶于水，這過程中糖原并不與蛋白質發(fā)生化學結合，而是機械地包含在凝結的蛋白質內，使細胞內的糖原(特別是不穩(wěn)定性糖原)損失。所以糖原染色應用含乙醇溶液的固定液固定標本，常用的固定液為Carnoy液，但應注意的是Carnoy固定液雖然能較好地固定糖原，但易出現(xiàn)“極化現(xiàn)象”，即糖原在固定中可流動到細胞一側，觀察時應注意。而脂肪染色時不能采用含乙醇的固定液，也不能作石蠟切片，而需用冷凍切片經40 g/L甲醛固定后直接染色。酶組織化學染色的組織不需要固定，取材后的標本應即刻冷凍切片，或-80 ℃冷凍保存，需切片時再孵溫至切片溫度。

4.3 對染色試劑和染色條件的要求

特殊染色和組織化學染色需要有較高的特異性，尤其是組織化學染色，每種染色都需要有專一的染料、試劑或底物；染色時還需要控制一定的時間及pH環(huán)境,如Fe3+應用專一的亞鐵氰化鉀和鹽酸處理后，可產生藍色，故又稱普魯士藍反應；DNA染色可用Schiff液和鹽酸，而同時顯示DNA和RNA則需要用派洛寧和甲基綠；顯示三磷酸腺苷酶所用的底物是三磷酸腺苷，但根據(jù)不同的pH又可顯示3種不同的肌肉類型。染色時所用的器皿必須經酸清潔液處理，以確保染色器皿清潔無污染；染色所用試劑必須是分析純(A.R)，而且對被檢測物質或酶無任何影響，所用蒸餾水最好是雙蒸水或去離子水；緩沖液的pH值要準確，配制試劑時所用器皿要專一，不能混用，配制結束后所用器皿經酸清潔液處理后，再用自來水和蒸餾水反復沖洗干凈后烤干備用。染色過程中大部分染色方法采用滴染法，這樣可以節(jié)省染液；但有些方法卻必須浸染，如磷鎢酸蘇木精法，因染色時間較長(24～48 h)，就必須用染色缸來浸染；有些染色液用乙醇配制如醛品紅、地衣紅等，染色時液體易揮發(fā)，也不宜滴染；無色品紅染液在染色時需要避光，也不宜滴染。有些染色試劑配制后有使用有效期，應在試劑瓶上標明配制時間。有些試劑易起氧化還原反應，應密閉放入4 ℃冰箱保存。

5 特殊染色和組織化學染色技術的操作規(guī)范及實驗對照

大部分特殊染色和組織化學染色過程復雜，影響染色結果的因素很多，染色過程中技術操作是否規(guī)范很重要。結締組織中的三大纖維、細菌和病毒、色素和病理性沉著物、內分泌細胞顆粒、脂質、糖類、核酸及各種酶的染色中，每種物質的顯示都有一種或多種相應的染色方法，并需要配制相應的染料和試劑，進行不同的染色步驟，因此在染色操作過程中嚴格控制反應物質的濃度、反應時的溫度、試劑的pH值、反應時間尤為重要。六胺銀、PAS染色等均為進行性染色，需要嚴格的鏡下控制；而DNA和RNA染色、酶組織化學染色等則需要病理技術人員要有過硬的技術水平。染色過程中為了保證實驗的可靠性、科學性，防止假陽性結果的出現(xiàn)，應采用已知含有所顯示物質的標本作陽性對照，用已知不含有所顯示物質的標本或用抑制和消化等方法進行陰性對照?？傊?，熟練的技術可直接影響制片的質量，而作為病理技術員要學會觀察每一張切片，以確保染色的正確性。

6 免疫組化技術不能完全取代特殊染色及組織化學染色

特殊染色及組織化學染色從19世紀中葉Virchow細胞病理學時代開始，一個多世紀以來雖然發(fā)展了上百種染色方法，但其發(fā)展速度非常緩慢，這是由于組織成分各自具有獨特的、互不相同的檢測方法，一種酶需要一種底物,難以掌握全面，對病理技術員技術要求很高，其應用受到限制。免疫組化是組織化學的一種特殊類型，是用免疫學的方法，把抗體標記上可見的顏色，如熒光素、酶、某種金屬等呈色物質，使抗體由不可見變?yōu)榭梢?，以檢測組織細胞中的抗原，即用顏色的變化來判斷組織細胞中的化學成分[4]。雖然越來越多的特殊染色和組織化學染色被取代，但還是有相當一部分特異性物質染色是免疫組化所取代不了的。原因：①免疫組化在蛋白質水平上對細胞染色相對特異，而許多結締組織或細胞內的蛋白質是以絡合物形式存在，特殊染色對復合蛋白質的顯示有著特殊顯示效果。如在同一張切片上可以不同色調顯示不同的成分，因而可一目了然地從整體結構上顯示出各種不同的組織成分，如心血管疾病組織中肌纖維的膠原化、鈣鹽的沉積、彈力纖維的變性和斷裂、纖維組織的黏液變等，應用一個簡單的Masson三色染色就可在短期內完全診斷；某些色素分類通過特殊染色便可直觀顯示。②組織化學染色除可特異性地顯示某些蛋白質以外，還可以相對顯示核酸的分布特點。如Feulgen染色后，通過圖像分析儀或流式細胞儀可檢測DNA倍體，從而反映出機體的功能狀態(tài)。又如在顯示細胞內特殊酶類時，以酶促反應的形式可相對特異地顯示這些酶的存在或分布，而免疫組化特異性抗體不能完全顯示這些酶。因此，在進行臨床診斷和科研工作時不能忽視特殊染色和組織化學染色技術。

[1] 王德田，董建強. 實用現(xiàn)代病理學技術[M]. 北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社， 2012：86.

[2] 梁英杰，凌啟波，張威. 臨床病理學技術[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 2011：87.

[3] 王伯沄，李玉松，黃高昇，等. 病理學技術[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 2001:106-110,202.

[4] 吳秉銓，劉彥仿. 免疫組織化學病理診斷[M]. 北京：北京科學技術出版社， 2007：3-4.