基于磁球表面的抗原決定基印跡法用于選擇性識別細(xì)胞色素c的研究

趙曉麗， 何錫文， 李文友

(藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市生物傳感與分子識別重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院，天津 300071)

分子印跡作為一種分離技術(shù)，具有預(yù)訂性、識別性和實(shí)用性三大特性。分子印跡聚合物(Molecular Imprinting Polymers,MIPs)具有易于合成、成本低廉、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用在分離提純[1 - 3]、傳感器[4]等領(lǐng)域。目前，對小分子的印跡技術(shù)發(fā)展已較為成熟，但由于蛋白質(zhì)分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、容易變性等原因，對蛋白質(zhì)的印跡仍有很多困難[5]。蛋白質(zhì)的印跡方法主要有包埋法、表面印跡法和抗原決定基印跡法[6 - 7]，而研究較多的為表面印跡法和抗原決定基印跡法?？乖瓫Q定基印跡法基于抗原-抗體間相互作用的原理，由Rachkov等[8]提出。該方法在印跡過程中只需印跡蛋白質(zhì)的一小段多肽序列，即該蛋白質(zhì)的抗原決定基，而非整個(gè)蛋白質(zhì)，得到的印跡聚合物不僅能識別這段多肽序列，還能識別相應(yīng)的蛋白質(zhì)。Nishino等[9]分別使用牛血清白蛋白(BSA)、細(xì)胞色素c(Cyt c)和乙醇脫氫酶(ADH)C端的九肽作為模板，在進(jìn)行一系列化學(xué)修飾的玻璃表面進(jìn)行印跡，制得的印跡層對目標(biāo)蛋白具有很好的吸附選擇性。近幾年，抗原決定基印跡法已成功地與多種材料結(jié)合制備印跡聚合物，如結(jié)合電化學(xué)方法[10]或使用石英晶體微天平芯片[6,11]的金傳感器表面、磁球[12]、量子點(diǎn)[13]等。

Cyt c分子量約11～13 kDa，是生物氧化過程中的電子傳遞體，從線粒體中泄漏出的Cyt c具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，因此對Cyt c的分析得到了越來越多的關(guān)注[14 - 17]。本工作結(jié)合表面印跡法和抗原決定基印跡法，采用一種簡便的方法合成了磁性印跡聚合物用于選擇性識別Cyt c。使用磁球作為基質(zhì)，具有制備簡單、生物相容性好、低毒、便于快速分離等優(yōu)點(diǎn)。此外，還利用了多巴胺(DA)自聚的原理，在磁球表面直接形成DA印跡薄膜，洗脫掉模板后得到核殼結(jié)構(gòu)的磁性分子印跡聚合物。合成過程中，磁球表面不再進(jìn)行其它修飾，直接進(jìn)行下一步的印跡聚合，操作步驟簡單。形成的印跡聚合物采用多種技術(shù)手段進(jìn)行形貌、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的表征。在吸附實(shí)驗(yàn)中，該聚合物的吸附動力學(xué)速度很快，對目標(biāo)蛋白有較好的吸附選擇性，并且在多次吸附-洗脫循環(huán)中有良好的重復(fù)利用性，結(jié)果表明使用抗原決定基做模板的聚合物的吸附情況優(yōu)于使用相應(yīng)蛋白做模板的情況。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

LC-20AD型高效液相色譜儀(日本，島津公司)；UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；JEM 100CXII型透射電子顯微鏡(TEM)(日本，電子公司)；D/MAX-2500型X-射線衍射儀(XRD)((日本，島津公司)；LDJ 9600-1型振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)(美國，LDJ電子儀器公司)；Vector 22傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜儀(德國，布魯克公司)。

Cyt c的C端九肽(AYLKKATNE)購于上海吉爾生化有限公司。FeCl3·6H2O、無水NaAc、乙二醇(EG)、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、十二烷基硫酸鈉(SDS)和HAc，均購于天津光復(fù)精細(xì)化學(xué)品廠。甲醇(99.5%)和乙醇(99.7%)購于天津康科德科技有限公司。多巴胺鹽酸鹽(DA，99%)購于J&K科技(北京)有限公司。所用的蛋白質(zhì)，包括牛血清白蛋白(BSA，Mw=67 kDa，pI=4.9)，Cyt c(Mw=12.4 kDa，pI=9.6)以及辣根過氧化物酶(HRP)(Mw=40 kDa，pI=7.2)購于北京索萊寶科技有限公司。所有試劑均為分析純或色譜純。實(shí)驗(yàn)用水由艾科浦超純水系統(tǒng)(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)制備。

1.2 Fe3O4磁性納米粒子的合成

Fe3O4磁性納米粒子參照文獻(xiàn)方法[18]，通過溶劑熱法合成。將FeCl3·6H2O(1.35 g)和無水NaAc(3.60 g)溶解在EG(35 mL)中，先通過磁力攪拌使其混合均勻，然后將其轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓釜中密封，200 ℃反應(yīng)8 h。反應(yīng)完成后，待高壓釜冷卻到室溫，通過外加磁場收集得到的產(chǎn)物，分別用乙醇和超純水洗滌數(shù)次，然后用磁鐵將產(chǎn)品分離出來，45 ℃下干燥過夜。

1.3 Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@CMIPs的合成

稱取100 mg Fe3O4納米粒子分散在10 mL 10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=8.0)中，超聲30 min使其分散均勻。稱取20 mg Cyt c的抗原決定基，并用5 mL上述PBS溶解。然后將二者混合，機(jī)械攪拌2 h使其進(jìn)行充分的預(yù)組裝。稱取60 mg DA溶于5 mL PBS(pH=8.0)中，將溶解好的DA溶液加入上述混合體系中，繼續(xù)機(jī)械攪拌3 h，該過程中保證有充足的空氣進(jìn)入體系，使DA進(jìn)行聚合反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后在外加磁場下分離產(chǎn)物，棄去液體部分，產(chǎn)物用甲醇-HAc(9/1,V/V)的混合液洗脫48 h，除去聚合物中的抗原決定基模板。最后用乙醇和水反復(fù)洗滌產(chǎn)物，45 ℃干燥最終的印跡聚合物。非印跡的Fe3O4@ENIPs用同樣的方法制備，只是不加入Cyt c的抗原決定基。

Fe3O4@CMIPs(使用Cyt c作為模板)的合成方法同F(xiàn)e3O4@EMIPs，只是使用20 mg的Cyt c蛋白質(zhì)作為模板。得到的產(chǎn)物用5%SDS-5%HAc洗脫液洗脫。非印跡的Fe3O4@CNIPs用同樣的方法制備，只是不加入 Cyt c。

1.4 多巴胺用量的優(yōu)化

DA用量不同，形成的聚合物的印跡層厚度不同，因此吸附效果也不同。為使Fe3O4@EMIPs達(dá)到最佳的印跡效果，對合成過程中DA的用量進(jìn)行了優(yōu)化。固定載體Fe3O4的用量及其它反應(yīng)條件，DA分別為20、40、60、80、100 mg五種用量，合成了五組不同的Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs，然后在相同條件下進(jìn)行吸附性能實(shí)驗(yàn)。將5 mg Fe3O4@EMIPs或Fe3O4@ENIPs置于2 mL 0.5 mg/mL的Cyt c的PBS(10 mmol/L，pH=7.0)中，室溫下振蕩吸附30 min使吸附達(dá)到飽和。在外加磁場下分離聚合物和上清液，用紫外-可見分光光度計(jì)檢測上清液中Cyt c的濃度，進(jìn)而計(jì)算出吸附容量和印跡因子，根據(jù)吸附效果選取DA的最佳用量。

1.5 吸附實(shí)驗(yàn)

動力學(xué)吸附實(shí)驗(yàn)：將5 mg Fe3O4@EMIPs或Fe3O4@ENIPs置于2 mL 0.5 mg/mL Cyt c的PBS(10 mmol/L，pH=7.0)中，室溫下分別進(jìn)行2 min到60 min不同時(shí)間的振蕩吸附。外加磁場下分離聚合物和上清液，用紫外-可見分光光度計(jì)檢測上清液中Cyt c的濃度。磁性印跡納米粒子對蛋白質(zhì)的吸附容量(Q)可以根據(jù)如下公式計(jì)算：

Q=(c0-ct)·V/m

(1)

其中，Q(mg/g)是吸附容量，c0(mg/g)是蛋白質(zhì)溶液的起始濃度，ct(mg/g)是吸附后上清液中蛋白質(zhì)溶液的濃度，V(mL)是蛋白質(zhì)溶液的體積，m(g)是使用的納米粒子的質(zhì)量。

等溫吸附實(shí)驗(yàn)：將5 mg Fe3O4@EMIPs或Fe3O4@ENIPs置于2 mL不同濃度的Cyt c(0.1 mg/mL到1.0 mg/mL)的PBS(10 mmol/L，pH=7.0)中，室溫下分別進(jìn)行30 min的振蕩吸附。然后在外加磁場下分離聚合物和上清液，用紫外-可見分光光度計(jì)檢測上清液中Cyt c的濃度。同樣根據(jù)上述公式計(jì)算吸附容量。

選擇性吸附實(shí)驗(yàn)：將5 mg Fe3O4@EMIPs或Fe3O4@ENIPs置于2 mL 0.5 mg/mL的不同蛋白質(zhì)(Cyt c、BSA、HRP)的PBS(10 mmol/L，pH=7.0)中，室溫下分別進(jìn)行30 min的振蕩吸附。外加磁場下分離聚合物和上清液，然后使用高效液相色譜儀檢測上清液中不同蛋白質(zhì)的濃度。印跡聚合物的吸附性能可以通過吸附容量Q和印跡因子(IF)來評估。其中，IF=QMIP/QNIP。QMIP和QNIP(mg/g)分別為印跡聚合物和非印跡聚合物對目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附容量。

重復(fù)利用性實(shí)驗(yàn)：為了檢驗(yàn)該印跡聚合物的重復(fù)利用性能，5 mg的Fe3O4@EMIPs或Fe3O4@ENIPs分別加入2 mL 0.5 mg/mL Cyt c溶液(10 mmol/L PBS,pH=7.0)中，在室溫下振蕩吸附30 min直至達(dá)到吸附平衡。然后納米粒子通過外部磁場與溶液分離，用5%SDS -5%HAc的混合溶液洗脫24 h，除去吸附的蛋白質(zhì)。重新得到的納米粒子用于下次的吸附-洗脫循環(huán)，整個(gè)過程重復(fù)三次，分別計(jì)算每次吸附過程的吸附容量。

1.6 印跡聚合物的表征

用透射電子顯微鏡(TEM)表征Fe3O4和Fe3O4@EMIPs的形貌特征。用X-射線衍射(XRD)儀表征Fe3O4，F(xiàn)e3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的晶體結(jié)構(gòu)，2θ角在3°～80°范圍內(nèi)。傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜用Vector 22 FT-IR光譜儀測量。磁性特征用LDJ 9600-1振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)測量。紫外-可見吸收光譜用UV-2450分光光度計(jì)測得。

2 結(jié)果與討論

2.1 核殼型Fe3O4@EMIPs的制備

Fe3O4@EMIPs的制備過程如圖1所示。先以溶劑熱法合成Fe3O4磁性納米粒子，然后加入Cyt c的抗原決定基預(yù)組裝2 h，再加入DA溶液進(jìn)行聚合反應(yīng)3 h，從而將模板包覆在磁球表面。待洗脫掉模板分子后，即得到Fe3O4@EMIPs。作為對照，F(xiàn)e3O4@ENIPs用同樣的方法合成，只是不加入模板分子Cyt c的抗原決定基。

圖1 Fe3O4@EMIPs的制備示意圖Fig.1 Synthesis illustration of Fe3O4@EMIPs

圖2 多巴胺的用量對吸附效率的影響Fig.2 Influence of the amount of dopamine on adsorption efficieacy

實(shí)驗(yàn)中，我們考察了不同DA用量下聚合物的吸附性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以做如下解釋：當(dāng)DA用量較小(20和40 mg)時(shí)，F(xiàn)e3O4表面沒有被完全包裹住，有部分裸露的磁球，因此非特異性吸附較強(qiáng)，F(xiàn)e3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的吸附容量Q均較大，印跡因子IF較小。當(dāng)DA用量過大(80和100 mg)時(shí)，F(xiàn)e3O4表面聚合的印跡層又過厚，導(dǎo)致模板被包裹在印跡層較深的位置，不易被洗脫出來，可識別的印跡位點(diǎn)變少或是因?yàn)橛≯E位點(diǎn)被包覆在印跡層較深的位置，目標(biāo)蛋白不易到達(dá)印跡位點(diǎn)。這都導(dǎo)致Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs 的吸附容量Q較小。當(dāng)DA用量為60 mg時(shí)較為合適，聚合物的Q和IF(IF=2.17)都較為理想。所以，在合成此磁性印跡聚合物時(shí)，選擇DA的用量為60 mg。

2.2 磁性印跡聚合物的表征

采用透射電鏡(TEM)觀察Fe3O4和Fe3O4@EMIPs的粒徑和形貌結(jié)構(gòu)。如圖3(a)所示，F(xiàn)e3O4粒子為球形，分散較為均勻，粒徑大小較為統(tǒng)一，約為350 nm。而Fe3O4@EMIPs的粒徑(圖3(b)和3(c))較Fe3O4相比僅增長約5 nm，可見在Fe3O4表面形成了很薄的一層聚多巴胺(PDA)印跡層。在圖3(c)中印跡聚合物的外層可以較為明顯地觀察到這層PDA。TEM圖較為直觀地表明了核殼型磁性印跡聚合物的成功合成。Fe3O4表面這層較薄的聚多巴胺印跡層對模板的洗脫及對蛋白質(zhì)的吸附都非常有利，這使該印跡聚合物有較快的吸附動力學(xué)，并且其飽和磁化強(qiáng)度仍能保持較高的數(shù)值，便于與溶液達(dá)到快速分離。

圖3 Fe3O4(a),Fe3O4@EMIPs(b和c)的透射電鏡(TEM)圖Fig.3 TEM images of Fe3O4(a) and Fe3O4@EMIPs(b and c)

Fe3O4、Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的晶型用X-射線衍射(XRD)儀進(jìn)行分析(圖4)。如圖所示，當(dāng)2θ在3°～80°的范圍內(nèi)，三個(gè)樣品均能明顯地觀察到Fe3O4的2θ=30.38°、35.58°、43.14°、53.48°、57.08°和62.66° 六個(gè)特征峰。與2θ值相對應(yīng)的峰位置的指數(shù)分別為(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)。這些峰位置的指數(shù)均與JCPDS卡(19-629)磁鐵礦的數(shù)據(jù)相對應(yīng)。因此，XRD表征說明制得的Fe3O4有很好的晶型，并且在形成聚合物后，其晶型并未發(fā)生變化。

Fe3O4和Fe3O4@EMIPs納米粒子的傅立葉紅外(FT-IR)光譜圖如圖5所示。590 cm-1處為Fe-O的伸縮振動峰，是Fe3O4的特征吸收峰。與裸磁球的光譜圖對比，在Fe3O4@EMIPs中，1 640 cm-1處代表芳香環(huán)的伸縮振動，表明在磁球表面成功地包覆了PDA層。因此，F(xiàn)T-IR光譜圖也可以表明該印跡聚合物的成功合成。

圖4 Fe3O4 (a)、Fe3O4@EMIPs(b)和Fe3O4@ENIPs(c)的X-射線衍射(XRD)圖Fig.4 XRD patterns of Fe3O4 (a),Fe3O4@EMIPs(b) and Fe3O4@ENIPs(c)

圖5 Fe3O4 (a)和Fe3O4@EMIPs(b)的傅立葉紅外(FT-IR)光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of Fe3O4 (a) and Fe3O4@EMIPs(b)

圖6 Fe3O4 (a)和Fe3O4@EMIPs(b)的磁滯回線圖Fig.6 Hysteresis loops of Fe3O4 (a) and Fe3O4@EMIPs(b)

采用振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)表征合成的Fe3O4和Fe3O4@EMIPs的磁性質(zhì)，結(jié)果見圖6。Fe3O4和Fe3O4@EMIPs的飽和磁化強(qiáng)度分別為60.75、50.96 emu/g。可見，F(xiàn)e3O4@EMIPs與裸磁球相比，磁化強(qiáng)度略有下降，但仍有較高的磁化強(qiáng)度以保證該印跡聚合物在外加磁場下能和溶液快速分離。此外，飽和磁化強(qiáng)度的下降也側(cè)面說明印跡層的成功形成。

2.3 Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的吸附特性

2.3.1吸附動力學(xué)稱取5 mg Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs，分別置于2.0 mL初始濃度為0.5 mg/mL 的Cyt c溶液中。Fe3O4@EMIPs 和 Fe3O4@ENIPs 的動力學(xué)吸附如圖7所示。在0～20 min內(nèi)，隨吸附時(shí)間增長，吸附容量逐漸增大。這是因?yàn)樵谖降淖畛蹼A段，空的印跡位點(diǎn)較多，Cyt c能較容易地進(jìn)入這些空的印跡位點(diǎn)。而吸附到20 min時(shí)吸附達(dá)到飽和。其后，隨吸附時(shí)間的增長，吸附容量不再增大。在吸附過程中，F(xiàn)e3O4@EMIPs的吸附容量始終高于Fe3O4@ENIPs的吸附容量，由此可以說明在Fe3O4@EMIPs表面成功形成了特異性的印跡位點(diǎn)。從圖中可以看出，F(xiàn)e3O4@EMIPs能在20 min內(nèi)就達(dá)到吸附平衡，主要是因?yàn)槲覀兒铣傻臑楹藲ば头肿佑≯E聚合物，形成的印跡層很薄，位于或接近磁球的表面，因此傳質(zhì)阻力很小，目標(biāo)蛋白質(zhì)較容易進(jìn)入識別位點(diǎn)，使吸附達(dá)到平衡。

2.3.2吸附等溫線Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的等溫吸附曲線如圖8所示。當(dāng)Cyt c濃度小于0.5 mg/mL時(shí)，隨濃度的增大，F(xiàn)e3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的吸附容量逐漸增大。當(dāng)Cyt c的濃度大于0.5 mg/mL時(shí)吸附達(dá)到平衡，F(xiàn)e3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的吸附容量不再隨蛋白質(zhì)濃度的增大而增大。在實(shí)驗(yàn)考察的濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)e3O4@EMIPs的吸附容量明顯大于Fe3O4@ENIPs的吸附容量。當(dāng)吸附達(dá)到平衡時(shí)，F(xiàn)e3O4@EMIPs的飽和吸附容量為8.33 mg/g，印跡因子為2.08。由此可見，在Fe3O4@EMIPs 表面形成了具有特異性識別能力的印跡孔穴，這些印跡孔穴可以吸附目標(biāo)蛋白質(zhì)。此外，在Fe3O4@ENIPs表面也有一定的非特異性識別位點(diǎn)，所以非印跡聚合物也存在一定的吸附容量。

圖7 Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs動力學(xué)吸附圖Fig.7 Adsorption kinetics of Fe3O4@EMIPs and Fe3O4@ENIPs

圖8 Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs等溫吸附圖Fig.8 Adsorption isotherms of Fe3O4@EMIPs and Fe3O4@ENIPs

對于Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的吸附數(shù)據(jù)，進(jìn)一步通過Langmuir等溫吸附模型來分析。Langmuir方程為：

ce/Qe=1/(QmKL)+ce/Qm

(2)

式中,Qe(mg/g)為Fe3O4@EMIPs或Fe3O4@ENIPs對Cyt c的平衡吸附容量，Qm(mg/g)是理論最大吸附容量，ce(mg/mL)是吸附達(dá)到平衡時(shí)Cyt c的濃度，KL(mL/mg)是Langmuir吸附平衡常數(shù)。

Qm和KL的值可通過Langmuir擬合直線的斜率和截距計(jì)算得出，得到的數(shù)值列在表1中。線性回歸系數(shù)(r)高于0.950，說明Langmuir模型比較符合該印跡聚合物和非印跡聚合物。

表1 Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的Langmuir模型

圖9 Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs對三種蛋白的吸附情況Fig.9 Binding specificity of Fe3O4@EMIPs and Fe3O4@ENIPs toward three kinds of proteins

2.3.3吸附選擇性為了考察合成的Fe3O4@EMIPs的特異性吸附能力，我們采用了兩種與Cyt c分子量和等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)作為對照進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。達(dá)到吸附平衡后，通過外加磁場分離上清液和納米粒子，用高效液相色譜法檢測上清液中剩余蛋白質(zhì)的含量，所得結(jié)果如圖9所示。從圖中可以看出，該印跡聚合物對目標(biāo)蛋白有較高的吸附容量。對于HRP和BSA兩種蛋白，其吸附容量均較小。

2.3.4重復(fù)利用性為了考察合成的Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的重復(fù)利用性，用一定量Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs進(jìn)行了三次吸附-洗脫循環(huán)實(shí)驗(yàn)(圖10)。在洗脫過程中，我們使用5%SDS-5%HAc洗脫吸附的 Cyt c。在實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)用SDS-HAc洗脫液洗脫蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于用甲醇-HAc的洗脫效果，因此此處改用SDS-HAc洗脫液洗脫吸附的蛋白質(zhì)。從圖10可以看出，在吸附-洗脫循環(huán)中，F(xiàn)e3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的吸附容量都略有下降，可能是因?yàn)橐恍┯≯E位點(diǎn)在洗脫過程中被破壞，或是因?yàn)橐恍┯≯E位點(diǎn)吸附的蛋白質(zhì)較難被洗脫下來，導(dǎo)致這些印跡位點(diǎn)在下次吸附實(shí)驗(yàn)中不能再吸附蛋白質(zhì)。但是Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的吸附容量下降均較小，吸附容量仍維持在原來的89.0%以上。此外，印跡因子在三次吸附-洗脫循環(huán)中變化不大，均維持在2.0左右。由此可以說明，該聚合物具有良好的可重復(fù)利用性。

2.4 Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@CMIPs吸附性能的比較

為了說明抗原決定基印跡法的優(yōu)越性，我們分別以Cyt c的抗原決定基和Cyt c為模板合成了兩種印跡聚合物Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@CMIPs，然后分別稱取5 mg聚合物振蕩吸附0.5 mg/mL的Cyt c溶液，直至達(dá)到飽和。結(jié)果(圖11)表明，F(xiàn)e3O4@EMIPs的吸附容量(8.47 mg/g)大于Fe3O4@CMIPs的吸附量(4.85 mg/g)，印跡因子也明顯優(yōu)于蛋白質(zhì)做模板的情況。

圖10 Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@ENIPs的重復(fù)利用性實(shí)驗(yàn)Fig.10 Reusability of Fe3O4@EMIPs and Fe3O4-@ENIPs

圖11 Fe3O4@EMIPs和Fe3O4@CMIPs對Cyt c的吸附情況Fig.11 Binding amount of Fe3O4@EMIPs and Fe3O4-@CMIPs towards Cyt c

3 結(jié)論

本工作結(jié)合表面印跡法和抗原決定基印跡法合成了核殼型的磁性分子印跡聚合物，并利用了DA在弱堿性條件下自聚的特點(diǎn)，在磁球表面直接進(jìn)行聚合。該方法操作簡單、制備過程中無需加熱。形成的印跡聚合物不僅有磁性納米粒子易于分離的優(yōu)點(diǎn)，又有表面印跡吸附動力學(xué)快的優(yōu)點(diǎn)。此外，該印跡聚合物對目標(biāo)蛋白有較好的吸附選擇性，且在三次吸附-洗脫循環(huán)中吸附容量略有下降，具有良好的可重復(fù)利用性。該方法為制備抗原決定基印跡聚合物提供了一種簡便快速的途徑，并且豐富了抗原決定基印跡法的研究。