硫解法和正相色譜法測定山竹殼原花青素

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(暨南大學食品科學與工程系,廣東廣州 510632)

硫解法和正相色譜法測定山竹殼原花青素

黃文燁,李星星,黃雪松*

(暨南大學食品科學與工程系,廣東廣州 510632)

為分析山竹殼中原花青素的組成和含量,采用硫解衍生法和反相HPLC對山竹殼中可提原花青素(EP)和不可提原花青素(NEP)進行了測定,采用正相HPLC、ESI-MS對不同聚合度EP進行了分析和定量。山竹殼中原花青素的主要組成單體為表兒茶素,EP和NEP含量分別為(131.69±11.24)、(36.92±2.38) g/kg(以原花青素B2計),平均聚合度為(4.27±0.08)、(5.41±0.04)。檢測出三種不同聚合度EP分別為:B型原矢車菊素二聚體(40.51±8.30) g/kg、三聚體(38.70±8.69) g/kg和四聚體(13.95±3.93) g/kg。這些結(jié)果為山竹殼原花青素的利用提供了一定的依據(jù)。

山竹殼,原花青素,硫解,測定

山竹(GarciniamangostanaL.)又稱莽吉柿、鳳果、倒捻子、山竺等,屬藤黃科藤黃屬,是一種原產(chǎn)馬來群島馬魯古的熱帶水果,果實柔軟多汁、酸甜適口、營養(yǎng)豐富,有“熱帶果后”之稱。山竹以鮮食為主,也可將果肉加工制成果脯、罐頭和果汁,但果皮即山竹殼常被廢棄[1]。然而,山竹殼在泰國、印度傳統(tǒng)醫(yī)藥中,用于治療腹瀉、霍亂、痢疾、皮膚與傷口感染等,具有獨特的藥用價值。大量研究顯示,山竹殼中的原花青素是這些藥用活性的來源之一[2-3]。

原花青素又被稱為縮合單寧(Condensed tannin),以分子骨架為C6-C3-C6的黃烷-3-醇、黃烷-4-醇或黃烷-3,4-二醇單體聚合而成,分子量在500～3000左右[4],具有抗氧化、抗癌、預防心血管疾病、降血壓、降血脂、降血糖等生物活性[5]。根據(jù)是否能被水和有機溶劑提取,可以將原花青素分為可提原花青素(Extrac
Table proanthocyanidings,EP)和不可提原花青素(Nonextrac
Table proanthocyanidins,NEP)[6]。由于NEP不被提取、一般地,分析原花青素時常常忽略NEP,也不被腸道菌群發(fā)酵、吸收而發(fā)揮其應有的抗氧化[7]、抗病毒[8]調(diào)節(jié)腸道pH等生物活性,故研究快速、方便、正確地測定NEP含量的方法,對于其有效利用有重要意義。

硫解法能方便地分析EP、NEP的組成和含量,其反應過程如圖1。原花青素B2結(jié)構(gòu)為(-)-表兒茶素-(4β→8)-(-)-表兒茶素,若根據(jù)圖1硫解,應只會生成表兒茶素和表兒茶素硫解衍生物(EC-thiol)。EP、NEP衍生后可以通過HPLC分析出它們的單元組成,并計算平均聚合度(Mean degree of polymerization,mDP)。

Fu等[9]研究發(fā)現(xiàn),山竹殼中原花青素以原矢車菊素為主,含少量原天竺葵素(Propelargonidins)和原飛燕草素(Prodelphinidins),表兒茶素是主要構(gòu)成單體,連接方式以B型為主,平均聚合度為6.6。周海超等[10]應用MALDI-TOF-MS分析了山竹殼原花青素三到十一聚物的分布,其中五聚物離子峰最強。但是這些研究均因未準確定量或無定量關(guān)系,而未能測得總原花青素和不同聚合度原花青素的含量。為此,本論文將采用硫解法和正相HPLC分析測定山竹殼中的EP、NEP和不同聚合度EP。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

山竹 大小均一,于暨南大學小西門水果店購買后剝?nèi)⌒迈r果皮,加水打漿(1∶1)、凍干磨粉后,過20目篩,得到山竹殼干粉,置于4 ℃冰箱備用;芐硫醇≥98% 阿拉丁試劑(上海)有限公司;兒茶素,99% 美國Sigma-Aldrich公司;原花青素B2,表兒茶素≥98%(HPLC級) 上海源葉生物有限公司;甲醇,丙酮,冰醋酸 分析純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 RE-52,上海嘉鵬科技有限公司;高效液相色譜,LC-20AT 日本島津公司;液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀ABI 4000 Q TRAP 美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.2實驗方法

1.2.1 山竹殼中原花青素的提取分離 稱取0.5 g山竹殼凍干粉,2瓶25 mL的正己烷超聲處理去酯后,以甲醇-水-冰乙酸(80∶20∶1,v/v/v)、丙酮-水-冰乙酸(70∶29.5∶0.5,v/v/v)先后室溫超聲提取EP各三次,合并所有提取液,即EP粗提液。殘渣加水凍干、稱重,待測定其中的NEP[6]。

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EP粗提液經(jīng)40 ℃ 旋蒸濃縮后,加入等體積的二氯甲烷萃取三次,進一步去酯。濃縮液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,過Sephadex LH-20(20 cm×1.5 cm)柱。Sephadex LH-20柱先用甲醇-水(1∶1,v/v)平衡,上樣后,繼續(xù)用甲醇-水(1∶1,v/v)洗提至紅色消失,以去除含色素、糖、酸等雜質(zhì),再用丙酮-水(7∶3,v/v)洗脫EP。EP提取液真空濃縮后,用1 mL甲醇溶解,即得到純化的EP提取液,供HPLC分析測定用。

1.2.2 硫解法測定EP和NEP(1)原花青素的硫解衍生化 配制濃度為0.51、1.02、1.53、2.04、2.55 g/L的原花青素B2標準溶液,進行硫解衍生處理,繪制標準曲線。硫解衍生化步驟為:取200 μL標準溶液,加入200 μL酸化甲醇(3.3%濃鹽酸甲醇溶液,v/v)和400 μL卞硫醇溶液(5%卞硫醇甲醇溶液,v/v),混勻,密封,40 ℃ 反應30 min后,室溫保持10 h,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,放入-20 ℃ 冰箱中保存至HPLC上樣[8]。同法硫解EP稀釋液后,待HPLC分析;對于NEP,準確稱取0.01 g凍干殘渣粉,加入2倍的酸化甲醇、衍生化試劑處理后待HPLC測定。

配制濃度為0.00、7.65、15.30、30.60、61.20 g/L兒茶素和0.00、24.75、49.50、99.00、198.00 g/L的表兒茶素標準溶液,做標準曲線,分別定量硫解后生成的兒茶素、表兒茶素。分別取同樣濃度范圍的兒茶素、表兒茶素單獨作硫解衍生化處理,以計算相互轉(zhuǎn)化率(如式(1))、校正測定結(jié)果。

式(1)

式(1)中:R為轉(zhuǎn)化率(%),c0為(表)兒茶素初始濃度,ct為硫解處理后(表)兒茶素濃度。

反相HPLC分析條件:

反相HPLC的分析條件[7]為:Diamonsil C18色譜柱(250 mm,× 4.6 mm,5 μm);檢測溫度:40 ℃;檢測波長:280 nm;進樣量:10 μL;流動相:2%(v/v)冰乙酸水溶液(A)、甲醇(B);梯度洗脫程序:0 min:85%A、15% B;45 min:15%A、85%B;流速:1.0 mL/min。

ESI-MS參數(shù):CUR(氣簾氣):10 Psi;TEM(霧化溫度):0 ℃;GS1(霧化氣):30 Psi;GS2(輔助氣):0 Psi;IS(噴霧電壓):5500 V;DP(去簇電壓):30 V;EP(聚焦電壓):10 V;掃描范圍:50～2000 amu;掃描時間:3 s。

表1 正相HPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution of normal HPLC

不同聚合度EP的定量分析：配制濃度為0.05～0.6 g/L 的原花青素B2標準溶液,按1.2.3.1 EP的條件分析并繪制標準曲線。同法分析EP提取稀釋液。以原花青素B2計算不同聚合度EP的相對含量。計算公式如下:

式(2)

式中:wi為組分i的相對含量(mg/kg),Ai為組分i的峰面積,AB2為原花青素B2的峰面積,wB2為原花青素B2的含量(mg/kg)。

1.2.4 mDP的計算公式如下 參考文獻[11-12]。

圖1 原花青素硫解衍生過程[9-10]Fig.1 Thiolysis procedure of proanthocyanidins[9-10]

mDP=兒茶素衍生物峰面積+表兒茶素衍生物峰面積/兒茶素峰面積+表兒茶素峰面積+1

式(3)

2 結(jié)果與分析

2.1硫解法測定EP和NEP的結(jié)果

2.1.1 硫解法對EP和NEP的定性 圖2a是兒茶素和表兒茶素未經(jīng)硫解的色譜圖,其保留時間分別為10～11 min和14～15 min。圖2b可以看出,原花青素B2硫解衍生后的產(chǎn)物主要為兒茶素、表兒茶素和表兒茶素硫解衍生物(EC-thiol)。由圖1知,原花青素B2硫解后應僅生成一個表兒茶素和一個EC-thiol。但硫解條件下,兒茶素和表兒茶素之間存在一定比例的相互轉(zhuǎn)換[11],峰兒茶素的存在是硫解過程中部分表兒茶素轉(zhuǎn)換成兒茶素的結(jié)果。由圖2c和圖2d可以看出,山竹殼EP、NEP硫解衍生后的主要產(chǎn)物[9]也是這三種,峰表兒茶素很小,因此,可以判定組成山竹殼原花青素的主要單體是表兒茶素。

圖2 兒茶素和表兒茶素(a)、原花青素B2硫解衍生(b)、山竹殼EP硫解衍生(c)、NEP硫解衍生(d)的色譜圖Fig.2 Chromatogram of catechin and epicatechin(a),thiolysis derivations ofprocyanidin B2(b),EP(c)and NEP(d)from mangosteen husk注:(1)峰:兒茶素,(2)峰:表兒茶素,(3)峰:EC-thiol,(4)峰:硫解衍生劑。

2.1.2 硫解法對EP和NEP的定量 表2所示是各標準品的回歸方程和山竹殼EP、NEP的組成和含量。山竹殼總原花青素含量為(168.61±13.40)×103mg/kg,其中NEP占到近22%,說明一般忽略NEP的原花青素測定,會嚴重低估山竹殼原花青素的含量。EP和NEP的mDP分別為4.27±0.08和5.41±0.04,低于Fu等[9]測得的結(jié)果(mDP=6.6),這應該是山竹的品種、成熟度和處理方式不同造成的差異。

Gu等[7]的研究顯示,兒茶素、表兒茶素在硫解環(huán)境會相互轉(zhuǎn)化。對(表)兒茶素分別單獨硫解處理的分析結(jié)果,并未測得有兒茶素轉(zhuǎn)化生成表兒茶素,而表兒茶素在衍生條件下生成兒茶素的轉(zhuǎn)化率為7.85%±1.50%。而Gu等[11]測得硫解過程中,9.0%±0.7%的兒茶素轉(zhuǎn)化成了表兒茶素,28.7%±1.5%的表兒茶素轉(zhuǎn)化為兒茶素;Prieur等[13]在90 ℃,2 min硫解處理后測得的轉(zhuǎn)化率則分別為:4%的兒茶素轉(zhuǎn)化成了表兒茶素、15%的表兒茶素轉(zhuǎn)化為兒茶素。本研究結(jié)果與這些文獻均不同,這可能是在不同研究,兩者轉(zhuǎn)化率的差異應當是受到處理條件的影響。

表2 原花青素B2、山竹殼原花青素硫解衍生物組成Table 2 Thiolysis results of procyanidin B2 and proanthocyanidins from mangosteen husk

2.2正相HPLC測定不同聚合度EP的結(jié)果

由圖3可以看出,保留時間在55 min前,低聚原花青素有比較好的分離效果;55 min后在86%甲醇的等度洗脫下,高聚合度的原花青素形成了一個大的單峰,該結(jié)果與文獻[11]類似。

圖3 山竹殼EP的正相HPLC色譜圖 Fig.3 Normal phase HPLC chromatograph ofEP from mangosteen husk注:P2：B型原矢車菊素二聚體,P3：B型原矢車菊素三聚體,P4：B型原矢車菊素四聚體。

由圖3看出:P2、P3、P4峰分離效果好。單獨收集這些峰樣液后所做MS分析結(jié)果見圖4,其中P2峰的[M+H]+=579.5(m/z),[M-H]-=577.5(m/z),即P2的Mr=M=578.5,與原花青素B2[B型原矢車菊素二聚體,(表)兒茶素-β-(表)兒茶素]的分子量一致。根據(jù)P2峰的面積計算出其相對含量為:(40.51±8.30) g/kg(以原花青素B2)。

P3的[M+H]+=867.6(m/z),[M-H]-=865.6 (m/z),說明P3的Mr=866.6,為B型原矢車菊素三聚體:(表)兒茶素-β-(表)兒茶素-β-(表)兒茶素,P3的相對含量(38.70±8.69)g/kg(以原花青素B2計)。

P4的[M+H]+=1155.6(m/z),[M-H]-=1153.7(m/z),證實P4的Mr=1154.0,為B型原矢車菊素四聚體:(表)兒茶素-β-(表)兒茶素-β-(表)兒茶素-β-(表)兒茶素,P4的相對含量(13.95±3.93)g/kg(以原花青素B2計)。

由圖3還可以看出:保留時間60 min時,有一個大且分離效果好的峰,但由于其分子量大、結(jié)構(gòu)復雜,屬于混合多聚體原花青素類物質(zhì),還難于對其進行分析。

3 討論

原花青素測定方法有很多,常用的包括:正丁醇-鹽酸法、香草醛-鹽酸法[4]和DMAC法[14]等,這些傳統(tǒng)比色法價廉、便捷,但是它們?nèi)狈μ禺愋?容易受到測定樣品中其他化合物干擾。相比之下,色譜法分析更加特異、準確,但受到原花青素聚合度高、異構(gòu)體多的限制,分離分析也比較困難。采用硫解法柱前衍生,能通過降解多聚物、特異性衍生和HPLC分離,分析并定量EP和NEP兩類原花青素的組成單元、含量和平均聚合度,不受高聚物分離困難的限制。對于不同聚合度EP的分離和定量,反相HPLC一般僅能分析至四聚物,而正相HPLC以增大極性的方式洗脫,能有效地分離和分析聚合度達10甚至更高的原花青素,極大地擴展了高聚體原花青素的研究空間[15]。近年,隨著MALDI-TOF-MS的普及,可被分析的原花青素聚合度在不斷提高[16]。

4 結(jié)論

本文采用硫解HPLC法、正相HPLC分析了山竹殼中原花青素的組成和含量。山竹殼原花青素的主要組成單體為表兒茶素,總原花青素含量為(168.61±13.40)×103mg/kg(以原花青素B2計),EP和NEP的聚合度分別為:4.27±0.08,5.41±0.04。硫解衍生過程中,有部分表兒茶素轉(zhuǎn)化為兒茶素,轉(zhuǎn)化率為 7.85%±1.50%。分離出三種不同聚合度EP分別為:B型原矢車菊素二聚體、B型原矢車菊素三聚體和B型原矢車菊素四聚體。

[1]蔣儂輝,李春雨,戴宏芬,等. 山竹的食用藥用價值及綜合利用研究進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學,2011,38(3):50-53.

[2]José P C,Noemí C R,Marisol O I,et al. Medicinal properties of mangosteen(Garciniamangostana)[J]. Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association,2008,46(10):3227-3239.

[3]Tjahjani S,Widowati W,Khiong K,et al. Antioxidant properties of garcinia mangostana,L(Mangosteen)Rind[J]. Procedia Chemistry,2014,13:198-203.

圖4 山竹殼原花青素二聚物(P2)、三聚物(P3)、四聚物(P4)的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of proanthocyanidin dimer,trimer and tetramer from mangosteen husk注:左圖為正離子模式 右圖為負離子模式。

[4]石碧. 植物多酚[M]. 科學出版社:石碧,狄瑩,2000.

[5]張華,曾橋. 原花青素功能及應用進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(9):5349-5350.

[6]Di Y,Arranz S,Saura-Calixto F. Proanthocyanidin content in foods is largely underestimated in the literature data:An approach to quantification of the missing proanthocyanidin[J]. Routledge,1999,42(10):1381-1388.

[7]王金晶,單巖,劉春鳳,等. 酒花原花青素抗氧化性能研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013(8):118-126.

[8]周秋枝、黃蕾、沈丹華,等. 火棘果中原花青素含量測定方法的建立[J]. 食品工業(yè)科技,2013(7):314-318.

[9]Caili F,Loo A E K,Chia F P P,et al. Oligomeric proanthocyanidins from mangosteen pericarps.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2007,55(19):7689-94.

[10]周海超,魏淑東,李敏,等. 基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜方法分析山竹果皮縮合單寧[J]. 分析化學,2010,38(10):1492-1496.

[11]Gu L,Mark K,Hammerstone J F,et al. Fractionation of polymeric procyanidins from lowbush blueberry and quantification of procyanidins in selected foods with an optimized normal-phase HPLC-MS fluorescent detection method[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2002,50(17):4852-60.

[12]Guyot S,Nathalie Marnet A,Drilleau J F. Thiolysis-HPLC Characterization of Apple Procyanidins Covering a Large Range of Polymerization States[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2001,49(1):14-20.

[13]Prieur C,Rigaud J,CheyniGu L,Mark K,Hammerstone J F,et al. Fractionation of polymeric procyanidins from lowbush blueberry and quantification of procyanidins in selected foods with an optimized normal-phase HPLC-MS fluorescent detection method.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2002,50(17):4852-60.

[14]黃雪松,黃文燁. 對-二甲基氨基肉桂醛法測定山竹原花青素[J]. 現(xiàn)代食品科技,2013(7):1687-1690.

[15]Hümmer W,Schreier P. Analysis of proanthocyanidins[J]. Molecular Nutrition & Food Research,2008,52(12):1381-98.

[16]Monagas M,Quintanilla-López JE,Gómez-Cordovés C,et al. MALDI-TOF MS analysis of plant proanthocyanidins[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2010,51(2):358-372.

Determinationofproanthocyanidinsfrommangosteenhuskbythiolysis-HPLCandnormal-phaseHPLC

HUANGWen-ye,LIXing-xing,HUANGXue-song*

(Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

To investigate the content of proanthocyanidins from mangosteen husk,thiolysis-HPLC was used to analyze and quantify extractable(EP)and nonextractable(NEP)proanthocyanidins,then normal-phase HPLC was applied to isolate and determinate EP in different degrees of polymerization. Proanthocyanidins from mangosteen husk mainly consisted of epicatechin,contents and mean degree of polymerization of EP and NEP were(131.69±11.24),(36.92±2.38) g/kg procyanidin B2/kg and(4.27±0.08),(5.41±0.04)respectively. Contents of B-type procyanidin dimer,trimer and tetramer from EP were(40.51±8.30),(38.70±8.69),(13.95±3.93) g/kg. These results can provide reference for the use of proanthocyanidins from mangosteen husk.

GarciniamangostanaL. husk;proanthocyanidins;thiolysis;determination

TS255.1

A

1002-0306(2017)19-0260-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.048

2017-03-06

黃文燁(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail:hwendyy@sina.com。

*通訊作者:黃雪松(1957-),男，博士，教授，研究方向：功能食品，E-mail:thxs@jnu.edu.cn。

廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室開放基金(201504)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(2013030775-5)。