牛血清白蛋白及金屬石墨烯復合材料與高藜蘆胺對映體的選擇性作用研究

冉佩瑤，宋金奕，夏 巧，馬 驕，楊成成，傅英姿

(西南大學化學化工學院，重慶400715)

牛血清白蛋白及金屬石墨烯復合材料與高藜蘆胺對映體的選擇性作用研究

冉佩瑤，宋金奕，夏 巧，馬 驕，楊成成，傅英姿*

(西南大學化學化工學院，重慶400715)

利用還原氧化石墨烯、納米鉑和牛血清白蛋白復合材料(BSA/PtNPs/rGO)修飾玻碳電極，構建手性傳感界面，并采用差分脈沖伏安法(DPV)研究該傳感界面與手性藥物合成前體高藜蘆胺對映體(1-(4-甲氧基苯基)乙胺，MPEA)的相互作用。實驗發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，當MPEA對映體濃度小于2.25×10-3mol/L時，RMPEA在傳感界面的電流響應信號明顯大于S-MPEA；當MPEA對映體濃度大于2.25×10-3mol/L時，SMPEA的電流響應信號更強,即該傳感界面可與MPEA對映體發(fā)生選擇性作用。且在1.00×10-4mol/L至4.00×10-3mol/L濃度范圍內，R-MPEA和S-MPEA的峰電流與其濃度呈線性響應。該傳感器制備簡單、響應快速、檢測靈敏，在MPEA的選擇性作用方面具有較大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

選擇性作用；電分析化學；金屬石墨烯復合材料；牛血清白蛋白；1-(4-甲氧基苯基)乙胺

Abstract：A chiral sensing interface was fabricated by reduced graphene oxide,platinum nanoparticles(PtNPs/rGo)and bovine serum albumin(BSA).Differential pulse voltammetry(DPV)was used to investigate the stereoselectivity of sensing interface to homoveratrylamine enantiomers(1-(4-methoxyphenethyl)amine,MPEA).The result displayed that when the concentration was less than 2.25 mmol/L,R-MPEA got the larger signal compared with S-MPEA.When the concentration was exceeded 2.25 mmol/L,S-MPEA got the larger signal compared with R-MPEA.Besides,R-MPEA and S-MPEA presented a linear relationship in the range of 1.00 ×10-4mol/L to 4.00×10-3mol/L.This chiral sensor exist great potentials in selective action owing to its advantages of simple operation,rapid detection and sensitive response.

Key words:chiral recognition;electroanalytical chemistry;complex of metal and graphene;bovine serum albumin;1-(4-methoxyphenethyl)amine

0 引言

生命體是一個復雜的手性體系，維持身體運作的生物活性分子大多是手性分子，手性藥物進入生物體后，會與體內分子進行嚴格的手性匹配，從而使得手性藥物的不同構型在生物系統(tǒng)內的作用機制以及產生的藥效和毒理性都有一定差異。當手性藥物處于生物體中的手性環(huán)境時，不同的構型會具有不同的藥效[1-2]。例如，R-反應停是一種緩解妊娠反應的藥物，而S-反應停不僅沒有療效，反而具有致畸作用；D-青霉胺用于治療肝豆狀核變和威爾森氏癥，并可作為中間體用于合成藥物，而L-青霉胺則具有較強毒性和潛在的致癌活性[3]。因此，發(fā)展簡單、快速、靈敏和可靠的手性藥物對映體純度分析和含量檢測技術成為醫(yī)藥學和生物學等領域的研究熱點。近年來，手性電化學傳感器以其操作簡單、靈敏度高和成本低等優(yōu)點獲得了廣泛的關注[4-10]。

高血壓是心、腦血管疾病的主要誘發(fā)因素之一，現(xiàn)已位于各種疾病引起死亡的第三位，被醫(yī)學界稱為人類的第一殺手。因此，降壓藥物的篩選及其開發(fā)研究具有重要現(xiàn)實意義。高藜蘆胺(1-(4-甲氧基苯基)乙胺，MPEA)不僅降壓作用明顯，無快速耐受現(xiàn)象，具有與藜蘆生物堿相似或相近的藥理活性，而且也是維拉帕米、貝凡諾爾等心血管藥物的合成前體[11-12]。目前為止，對于高藜蘆胺對映體有效識別的研究工作并不充分。因此，發(fā)展快速有效的識別方法對高藜蘆胺對映體進行識別具有巨大的實際應用價值。

石墨烯(graphene)是由碳原子以sp2雜化軌道組成的六角型呈蜂巢晶格平面薄膜結構的一種新型二維碳納米材料，以其比表面面積大、導電性能好及穩(wěn)定性高等優(yōu)點，在電化學傳感器的構建上得到大量應用[13-15]。為充分利用石墨烯的優(yōu)良性能，對石墨烯的改性研究日益多樣化，如在石墨烯表面原位還原K2PtCl6，提高石墨烯的電子傳輸能力。

牛血清白蛋白(BSA)是由583個氨基酸殘基組成的多肽鏈，其中35個半胱氨酸組成17個二硫鍵，在肽鏈的34位有一個自由的巰基，其二級結構為高度的ɑ-螺旋結構，是一種天然的手性選擇劑。BSA可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質結合，已成功地用于電化學手性傳感器中。然而，由于蛋白質對氧化還原活性位點具有屏蔽作用，會阻礙電子傳遞而制約BSA的應用范圍。因此，增加BSA與電極之間的電子傳遞速率是構建電化學傳感器的關鍵。

該文使用還原氧化石墨烯和納米鉑進行復合，而后通過BSA在納米鉑表面自組裝形成復合手性材料并修飾在玻碳電極表面(BSA/PtNPs/rGO/GCE)，構建手性電化學傳感器。利用掃描電子顯微鏡(SEM)表征了修飾界面的表面形態(tài)，并用電化學方法研究了該手性界面與MPEA對映體的相互作用。

1 實驗

1.1 試劑和儀器

高藜蘆胺對映體(R-1-(4-甲氧基苯基)乙胺，R-MPEA,96%；S-1-(4-甲氧基苯基)乙胺，SMPEA,98%)購于百靈威試劑公司(中國，北京)，氧化石墨烯(GO)購于納米先鋒納米材料科技有限公司(中國，南京)，六水氯鉑酸和硼氫化鈉購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,美國)，牛血清白蛋白(BSA,98%)購于百靈威試劑公司(中國北京)。工作緩沖溶液為0.10 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS,pH7.4)制備的 5.00 ×10-3mol/L[Fe(CN)6]4-/3-溶液。其余化學試劑均為分析純，無需進一步純化即可直接使用，所有實驗用水均為二次蒸餾水。

所有電化學測試均在CHI 440A電化學工作站(中國，上海辰華)上進行，標準三電極體系中，鉑絲電極作為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，玻碳電極和修飾過的玻碳電極均為工作電極。掃描電子顯微鏡照片由掃描電子顯微鏡S-4800(SEM,日立，日本)測得。

1.2 金屬石墨烯復合材料制備

首先，參照文獻制備還原石墨烯和納米鉑復合材料[16-17]。具體操作如下：稱取10.00 mg氧化石墨烯分散于10.00 mL蒸餾水中，超聲半小時使其分散均勻。向上述溶液中加入1 mL濃度為2.12 mg/mL六水氯鉑酸溶液。在持續(xù)攪拌條件下，緩慢滴加10.00 mL新制備的NaBH4(0.48 mol/L)溶液于混合溶液中，室溫條件下持續(xù)攪拌24 h。溶液顏色由淺棕色變?yōu)楹谏幢砻餮趸┮驯贿€原為還原石墨烯。然后將所制得的溶液離心，洗滌并晾干。所得產品標記為PtNPs/rGO。

1.3 生物選擇性界面制備

裸玻碳電極(GCE,Φ=4 mm)分別用1.00、0.3和0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨拋光，依次在乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗，除去Al2O3粉末，在空氣中自然晾干;然后滴涂10.00 μL PtNPs/rGO納米材料到干凈的玻碳電極表面，室溫下晾干。隨后，再滴涂10.00 μL BSA于其上(BSA/PtNPs/rGO/GCE)，晾干備用。

2 結果分析與討論

2.1 納米材料表征

用SEM對GO、PtNPs/rGO和BSA/PtNPs/rGO材料進行了表征。從圖1A可以看到氧化石墨烯(GO)表面有輕微皺褶;將H4PtCl6和GO混合還原后,可看到還原石墨烯片層上附著有大量的鉑納米顆粒(圖1B);當?shù)瓮苛薆SA之后，材料表面有一層薄薄的物質包裹其外（圖1C）。同時使用了X-射線能譜(EDX)對材料的元素進行分析，如圖1D所示，說明金屬鉑被成功地原位還原在石墨烯上。

圖1 (A)GO,(B)PtNPs/rGO,(C)BSA/PtNPs/rGO的SEM形貌;(D)EDX圖像Fig.1 SEM image of nanomaterials:(A)GO,(B)PtNPs/rGO,(C)PtNPs/rGO and BSA,(D)EDX of PtNPs/rGO complex

2.2 不同修飾界面的電化學響應

循環(huán)伏安法(CV)是研究電極表面特性的常用方法，實驗中采用其研究了不同界面在5.00 mmol/L的[Fe(CN)6]4-/3-溶液(pH7.4)中的電化學行為(掃速0.10 V/s)。從圖2中可以看出裸玻碳電極呈現(xiàn)一對對稱的氧化還原峰 (曲線a)，而PtNPs/rGO修飾電極的峰電流比裸玻碳電極高(曲線b)，這是由于PtNPs/rGO納米材料良好的電子傳輸能力所致；修飾上BSA之后，修飾電極的峰電流顯著降低(曲線c)，這是由于BSA阻礙了電子的傳輸。

圖2 不同修飾界面的電化學響應：(a)裸玻碳電極，(b)PtNPs/rGO，(c)BSA/PtNPs/rGOFig.2 The electrochemical response of different interfaces:(a)bare glassy carbon electrode,(b)PtNPs/rGO and(c)BSA/PtNPs/rGO

2.3 生物傳感器界面與高藜蘆胺的選擇性作用

采用差分脈沖伏安法研究了修飾界面與MPEA 對映體（4.00×10-3mmol/L）的相互作用，測試底液為 5.00×10-3mol/L[Fe(CN)6]4-/3-(pH7.4)溶液。如圖3所示，當BSA/PtNPs/rGO/GCE與R或S構型MPEA作用后，電流顯著下降，且S構型MPEA(曲線a)的電流下降量大于R構型MPEA(曲線 b)，兩者峰電流變化差(ΔI=ΔIR-ΔIS)為33 μA。

圖3 傳感界面對MPEA對映體的DPV響應:(a)SMPEA,(b)R-MPEAFig.3 Different pulse voltammetry of the chiral sensing interface to the(a)S-MPEA and(b)R-MPEA

產生這種現(xiàn)象的機理可能是：當BSA/PtNPs/rGO/GCE與R或S構型MPEA作用時，因蛋白質BSA的強阻礙電子性，導致電流響應信號降低；其中R構型MPEA比S構型更能使蛋白質多肽鏈伸展，破壞蛋白質空間結構，使BSA以一種更疏松的狀態(tài)存在，有利于電子的傳遞[17],因此R構型電流響應強于S構型，由此產生了與對映體間的選擇性作用。

圖4 (a)S-MPEA和(b)R-MPEA在不同界面的DPV電流響應：(A)裸玻碳電極,(B)PtNPs/rGO/GCE,(C)BSA/PtNPs/rGO/GCEFig.4 DPV current response of(a)S-MPEA and(b)R-MPEA on different interfaces:(A)bare glassy carbon electrode,(B)PtNPs/rGO/GCE,(C)BSA/PtNPs/rGO/GCE

同時，研究了不同傳感界面的電流響應情況。如圖4所示，兩種構型的MPEA對映體在裸玻碳電極(圖A)和PtNPs/rGO修飾電極(圖B)表面的電流響應信號無明顯區(qū)別，說明這兩種電極對MPEA異構體無識別作用；但MPEA對映體在PtNPs/rGO/GCE上的電流響應顯著增強，說明PtNPs/rGO復合材料能夠促進MPEA對映體在電極上的電子傳遞。當在PtNPs/rGO/GCE上固載了BSA后，兩種構型的MPEA在電極表面的電流響應信號如圖4C所示，S-MPEA(曲線a)和R-MPEA(曲線b)的電流響應均明顯減小，說明BSA阻礙了MPEA在電極上的電子轉移，且對兩者的電子阻礙作用不同，表現(xiàn)為更利于R-MPEA在電極上的電子轉移，因此R-MPEA的電流響應信號明顯大于S-MPEA。實驗結果表明，該傳感界面對MPEA對映異構體有明顯的識別作用。

2.4R-MPEA、S-MPEA濃度對選擇性的影響

為研究該手性界面與R-MPEA及S-MPEA作用程度，測定了一系列不同濃度的MPEA對映體作用后的差分脈沖伏安測試。如圖5所示，曲線 b為 BSA／PtNPs/rGO/GCE與濃度從 1.00×10-4mol/L到4.00×10-3mol/L的RMPEA作用后的峰電流的變化。從圖中可看出，BSA/PtNPs/rGO/GCE與R-MPEA作用后的峰電流的變化均與濃度的增加成反比，線性方程為Ip=101.80-15.04cRMPEA(r=0.9960);當BSA/PtNPs/rGO/GCE與濃度從1.00×10-4mol/L 到 4.00×10-3mol/L S-MPEA 作用時(曲線a)，S-MPEA的電流響應大小與濃度的增加成正比，線性方程為：Ip=27.50+18.06cSMPEA(r=0.9961)。這可能是由于S-MPEA與BSA的鍵合作用比R-MPEA弱[17-18]，分子中苯環(huán)可隨意轉動，當濃度增大時，附著在BSA上的S-MPEA分子中苯環(huán)轉動至同一平面的概率增大，從而有利于電子的傳遞。

圖5 峰電流與MPEA對映體的響應關系：1×10-4mol/L～4.0 ×10-3mol/L,(a)S-MPEA,(b)R-MPEAFig.5 Response relationship between peak current and concentration of(a)S-MPEA and(b)R-MPEA:1×10-4mol/L～4.0 ×10-3mol/L

3 結論

實驗通過BSA與PtNPs/rGO復合材料相互作用，在玻碳電極表面構建了一個簡單可靠的手性傳感界面，用電化學方法研究該界面與R-或S-MPEA的選擇性研究。由于R-MPEA和SMPEA的空間結構不同，導致它們與BSA呈現(xiàn)不同的作用：低濃度時，手性表面與R-MPEA作用后峰電流降低比S-MPEA少；當MPEA對映體濃度增大至2.25×10-3mol/L以上時，該界面對SMPEA的電流響應比同濃度R-MPEA大，說明該傳感界面在不同濃度與R-MPEA和S-MPEA具有不同的作用。低濃度時，R構型MPEA比S構型更能使蛋白質多肽鏈伸展，破壞蛋白質空間結構，有利于電子的傳遞；高濃度時，因為S-MPEA與BSA的鍵合作用比R-MPEA弱，分子中苯環(huán)可隨意轉動，當濃度增大時，附著在BSA上的SMPEA分子中苯環(huán)轉動至同一平面的概率增大，從而有利于電子的傳遞。這為其它探討手性藥物或手性小分子與BSA的作用提供了有價值的理論數(shù)據(jù)基礎。

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Study on BSA and metal/graphene complex for enantioselective interaction with homoveratrylamine enantiomers

Ran Pei-yao,Song Jin-yi,Xia Qiao,Ma Jiao,Yang Cheng-cheng,Fu Ying-zi*
(School of chemistry and chemical engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

*通信聯(lián)系人