核-殼型赤蘚紅分子印跡聚合物的制備 及吸附性能的評(píng)價(jià)

嚴(yán) 恒， 劉靜靜， 沈正雨， 張 瑞， 胡瑩瑩， 謝衛(wèi)紅*

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北武漢 430073; 2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068)

人工合成色素由于其低成本、高穩(wěn)定性及染色效果較強(qiáng)的特性，已被廣泛用作食品工業(yè)中的添加劑。然而，人工合成色素的安全性較低，過(guò)量的食用會(huì)對(duì)人體造成傷害，因此我國(guó)對(duì)食品著色劑有明確的使用標(biāo)準(zhǔn)和限量[1 - 3]。赤蘚紅屬于雜氧蒽類人工合成色素，主要用于果蔬、肉類、調(diào)料、糕點(diǎn)、飲料等的著色，其允許添加范圍為0.015～0.1 g/kg[4 - 5]。為了保證食品的安全性，嚴(yán)格控制人工合成色素的使用量，精確的色素檢測(cè)方法是不可或缺的。但是，食品基質(zhì)成分比較復(fù)雜，給準(zhǔn)確檢測(cè)帶來(lái)一定困難，因此，在色素檢測(cè)前有效地樣品前處理及富集過(guò)程是非常必要的[6 - 8]。赤蘚紅在幾種常用的食品著色劑中屬于較特殊的一種，對(duì)于含有赤蘚紅食品的前處理方法常用的有兩種：一種是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的液-液萃取，另一種是固相萃取(如聚酰胺粉固相萃取小柱)。然而，這兩種方法都存在一定的弊端，液-液萃取消耗的試劑較大，步驟較繁瑣；聚酰胺粉固相萃取吸附材料對(duì)于色素的提取依靠的是非特異性作用力，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的提取缺乏選擇性，導(dǎo)致基質(zhì)中的其它組分同時(shí)被萃取出來(lái)，影響了對(duì)食品中赤蘚紅的分離富集。因此，需要探究一種新的材料用于赤蘚紅的選擇性分離和富集[9 - 11]。

分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymer,MIP)是一種仿抗體材料，能夠?qū)⒛繕?biāo)物質(zhì)從復(fù)雜的樣品中選擇性吸附出來(lái)，已被廣泛開(kāi)發(fā)應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，包括固相萃取、傳感器、酶抑制劑和抗體等[12 - 15]。近年來(lái)，許多MIP利用其本身的特性用于其它人工合成色素的檢測(cè)，并取得了良好的結(jié)果[16 - 17]。但是，MIP用于赤蘚紅的檢測(cè)文獻(xiàn)報(bào)道很少。本文采用表面印跡方法，制備核-殼型赤蘚紅MIP，將其作為吸附材料，利用其高親和力和選擇性能夠?qū)⒊嗵\紅從復(fù)雜的食品基質(zhì)中提取出來(lái)，提高了回收率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

UV-Lambda 35紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)，鉑金艾爾默公司)；Nicolet 5700傅里葉紅外掃描儀(美國(guó)，Nicolet公司)；Ultimate 3000 高效液相色譜儀(美國(guó)，賽默飛世爾科技公司)。

二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、赤蘚紅(Erythrosine)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(分析純)；4-乙烯基吡啶(4-VP)和聚酰胺粉(Polyamide)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(分析純)；偶氮二異丁腈(AIBN純度98%)，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，純度98%)購(gòu)于Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司。水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1SiO2表面氨基化將10 g SiO2用0.25 mol/L NaOH溶液在室溫下攪拌蝕刻30 min，過(guò)濾，超純水洗滌，再加入2 mol/L的HCl 90 ℃回流8 h，過(guò)濾，超純水洗脫至中性，干燥。將處理好的SiO2顆粒分散在5%(V/V)的APTES甲苯溶液中，90 ℃回流12 h，結(jié)束后用甲醇除去未反應(yīng)的APTES，干燥得到表面氨基化修飾的SiO2顆粒。

1.2.2SiO2表面赤蘚紅分子印跡層的制備在50 mL甲醇∶水=4∶1(V/V)中，加入0.95 mmol功能單體4-VP和0.24 mmol赤蘚紅，室溫下攪拌孵育2 h，然后依次加入1 g氨基化SiO2、4.75 mmol交聯(lián)劑EGDMA、0.014 g引發(fā)劑AIBN，超聲混勻，通氮?dú)獬酰?0 ℃反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后聚合物用含10%氨水的甲醇進(jìn)行洗脫(索氏提取)，最后再用甲醇洗脫，直至用紫外-可見(jiàn)分析法檢測(cè)不到模板分子為止。非分子印跡聚合物(Non-imprinted Polymer,NIP)的制備除不加模板外，其它制備過(guò)程與MIP一樣。

1.2.3動(dòng)力學(xué)吸附實(shí)驗(yàn)稱取10 mg MIP和NIP各5份于4 mL的離心管內(nèi)，每個(gè)離心管內(nèi)加入1 mL濃度為600 μg/mL赤蘚紅水溶液，超聲混勻后靜置吸附。分別在第5、15、30、45、60 min時(shí)用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)其在533 nm處的吸光值，觀察其吸附容量隨吸附時(shí)間的變化規(guī)律。

(1)

其中，Q為吸附容量(μg/mg)；c0為吸附前赤蘚紅溶液的濃度(μg/mL)；c為吸附后赤蘚紅溶液的濃度(μg/mL)；V為吸附液體積(mL)；m為聚合物的質(zhì)量(mg)。

1.2.4等溫吸附實(shí)驗(yàn)分別稱取若干份10 mg赤蘚紅分子印跡聚合物和非印跡聚合物于4 mL的離心管內(nèi)，加入不同濃度的赤蘚紅水溶液，超聲混勻后室溫下靜置吸附。吸附完成后，離心、取上清液，用紫外-可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定溶液中未被吸附的赤蘚紅在533 nm處的吸光值。根據(jù)吸光值的變化算出赤蘚紅吸附前后濃度的變化進(jìn)而得出聚合物的吸附容量。

1.2.5加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)選取“農(nóng)夫果園果汁”飲料作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，赤蘚紅的加標(biāo)濃度為1、5、10 μg/mL。分別準(zhǔn)確稱取20 mg MIP和聚酰胺粉各3份于4 mL的離心管內(nèi)，然后加入2 mL不同濃度的赤蘚紅果汁溶液，使三份離心管中果汁的色素添加量分別為2、10、20 μg。室溫靜置吸附20 min后，離心、去除上清。每個(gè)離心管內(nèi)加入2 mL的淋洗液(V水∶V甲酸∶V甲醇=4∶2∶4)，超聲洗脫，離心、去除上清；再用10%的氨化甲醇溶液洗脫吸附在MIP和聚酰胺粉上的色素，洗脫液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，蒸發(fā)至近干，加甲醇復(fù)溶，進(jìn)行高效液相色譜( HPLC)分析。另一種處理方法是MIP和聚酰胺粉吸附色素后，中間省去淋洗步驟，直接用10%的氨化甲醇溶液進(jìn)行洗脫所吸附的色素，然后進(jìn)行HPLC分析。

液相色譜條件：Thermo ODS HYPERSIL色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-乙酸銨溶液(pH=4，0.02 mol/L)；梯度洗脫:甲醇：20%～35%，3%/min；35%～98%，9%/min；98%繼續(xù)6 min；流速:1 mL/min；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 核-殼型赤蘚紅分子印跡聚合物的制備及紅外表征

2.1.1核-殼型分子印跡聚合物制備為了便于離心分離以及后續(xù)固相萃取柱的開(kāi)發(fā)利用，我們將赤蘚紅的分子印跡聚合物制備在柱層析常用的SiO2柱表面，經(jīng)過(guò)活化的SiO2表面首先硅烷化修飾使SiO2表面帶有氨基基團(tuán)以利于模板分子在SiO2表面的吸附。通過(guò)條件優(yōu)化，分子印跡聚合物層的制備采用4-VP作為功能單體，模板與功能單體的摩爾數(shù)比為1∶4，模板的洗脫液以10%氨水的甲醇效果最好。MIP層的制備及重吸附見(jiàn)圖1。

圖1 核-殼型赤蘚紅分子印跡聚合物制備路線Fig.1 Synthesis route of core-shell erythrosine molecularly imprinted polymer

圖2 NIP(a)、氨基化SiO2(b)和SiO2(c)的紅外(IR)光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of NIP(a),aminated SiO2(b) and SiO2(c)

2.1.2分子印跡聚合物紅外表征圖2為SiO2、氨基化SiO2及NIP的紅外光譜圖。對(duì)比未氨基化修飾的SiO2，在圖中可以看出氨基化SiO2在2 900 cm-1處有C-H鍵和685 cm-1處有Si-C鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，說(shuō)明硅烷化氨基修飾上去了。對(duì)比氨基化SiO2和NIP的紅外圖譜，發(fā)現(xiàn)NIP在1 700 cm-1左右處有交聯(lián)劑中C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，而氨基化SiO2沒(méi)有，說(shuō)明通過(guò)聚合反應(yīng)可以在氨基化SiO2外面包裹了一層聚合物。

2.2 動(dòng)力學(xué)吸附實(shí)驗(yàn)

動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖3所示。由圖可知，MIP和NIP在0～15 min時(shí)，其吸附容量隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增加，當(dāng)其大于15 min時(shí)，吸附曲線趨于平緩，說(shuō)明在15 min時(shí)MIP和NIP達(dá)到吸附平衡。NIP的吸附容量小于MIP，這是由于分子印跡聚合物表面的特異性結(jié)合位點(diǎn)對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)的特異性識(shí)別所產(chǎn)生的。

2.3 等溫吸附實(shí)驗(yàn)

等溫吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖4所示。由圖可知，當(dāng)赤蘚紅濃度小于800 μg/mL時(shí)，MIP對(duì)赤蘚紅的吸附隨赤蘚紅濃度的增加而增大，當(dāng)赤蘚紅濃度大于800 μg/mL時(shí)，吸附容量沒(méi)有太大的變化，則此時(shí)吸附趨于飽和。而NIP的等溫吸附趨勢(shì)與MIP相似，但吸附容量小于MIP，這主要是由于印跡聚合物對(duì)模板分子的特異性吸附。

圖3 MIP和NIP吸附赤蘚紅的動(dòng)力學(xué)吸附曲線Fig.3 Kinetic adsorption curves of MIP and NIP for erythrosine Erythrosine aqueous solution:600 μg/mL,UV-Vis absorption was detected at λ=533 nm,room temperature.

圖4 MIP和NIP對(duì)赤蘚紅的等溫吸附曲線Fig.4 Isothermal adsorption curves of MIP and NIP for erythrosine The concentration of erythrosine range from 50 μg/mL to 1 400 μg/mL,UV-Vis absorption was detected at λ=533 nm after 20 min’s adsorption at room temperature.

為了進(jìn)一步分析印跡聚合物微球?qū)δ０宸肿拥慕Y(jié)合能力，將Langmuir-Freundlich(LF)模型用于評(píng)價(jià)分子印跡聚合物的結(jié)合特性。其方程式為：

(2)

式中，Q為聚合物微球?qū)τ谀０宸肿拥钠胶馕饺萘?μg/mg)，ce為平衡吸附時(shí)溶液中游離的模板濃度(μg/mL)，KLF表示結(jié)合常數(shù)(mL/μg)，Qm為最大表觀吸附容量(μg/mg)，n代表結(jié)合位點(diǎn)的異質(zhì)性系數(shù)。

Langmuir-Freundlich(LF)等溫線無(wú)論是對(duì)于均質(zhì)的MIP，還是對(duì)于非均質(zhì)的MIP都有著較為理想的近似擬合效果，從而可以用來(lái)比較具有不同分布位點(diǎn)的MIP的結(jié)合特性。通過(guò)模擬，得出的Qm為48.02 μg/mg，KLF為0.048 mL/μg，n為1.81，R2=0.994。

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

圖5為赤蘚紅加標(biāo)果汁經(jīng)MIP和聚酰胺粉提取后的HPLC圖，表1和表2分別為經(jīng)過(guò)淋洗和不經(jīng)過(guò)淋洗過(guò)程聚酰胺粉和MIP對(duì)添加到果汁中赤蘚紅的回收率。由表1和表2可知，MIP和聚酰胺粉對(duì)添加到果汁中低濃度的赤蘚紅都有一定的吸附，對(duì)比實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是否含有淋洗步驟，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過(guò)淋洗步驟的MIP回收率高于含有淋洗步驟的回收率，且MIP的回收率較高于聚酰胺粉，在85%以上。以上這些結(jié)果表明赤蘚紅分子印跡聚合物可以用于食品樣品中赤蘚紅的選擇性吸附分離，且過(guò)程中不需要淋洗步驟，節(jié)約了大量的有機(jī)溶劑，可以作為一種潛在的固相萃取吸附材料。

圖5 淋洗(A、B、C)和非淋洗(D、E、F)條件下赤蘚紅加標(biāo)果汁經(jīng)MIP和聚酰胺粉提取后的液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatograms of erythrosine spiked juice was extracted by MIP and polyamide under the condition of leaching(A,B,C) and non-leaching(D,E,F) a:erythrosine standard;b:the spiked juice is extracted by MIP;c:the spiked juice is extracted by polyamide.spiked level:2 μg(A,D),10 μg(B,E),20 μg(C,F).peak 1:erythrosine. 表1 有淋洗處理過(guò)程的赤蘚紅的回收率和精確度Table 1 Recovery and precision of erythrosine in the spiked juice with leaching condition

AdsorbentSpiked(μg)Found(μg)Recovery(%)RSD(%)Polyamide2010.5152.5516.44105.0950.9014.7221.0251.002.65MIP208.5142.5522.39103.7537.5029.2120.8241.001.68

表2 無(wú)淋洗處理過(guò)程的赤蘚紅的回收率和精確度Table 2 Recovery and precision of erythrosine in the spiked juice without leaching condition

3 結(jié)論

采用表面分子印跡技術(shù)，以氨基改性的SiO2為內(nèi)核，赤蘚紅為模板，4-乙烯基吡啶為功能單體，成功制備了核-殼型色素分子印跡聚合物。該印跡聚合物具有較快的吸附能力，有較好的吸附能力。在實(shí)際樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)比聚酰胺粉結(jié)果，其回收率較好，且過(guò)程中不需要淋洗步驟節(jié)約了大量的有機(jī)溶劑，可以作為一種潛在的固相萃取吸附材料。