灸法早期干預(yù)對(duì)5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠β淀粉樣蛋白1-40表達(dá)的影響

余靜,包燁華,張永生,楚佳梅

(1.杭州市中醫(yī)院,杭州 310007;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053)

灸法早期干預(yù)對(duì)5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠β淀粉樣蛋白1-40表達(dá)的影響

余靜1,包燁華1,張永生2,楚佳梅1

(1.杭州市中醫(yī)院,杭州 310007;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053)

目的探討灸法早期干預(yù)對(duì)阿爾茨海默病模型(AD)小鼠腦內(nèi)Aβ1-40的影響,對(duì)艾灸防治AD的作用機(jī)制進(jìn)行探討。方法PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因AD傳代小鼠的基因表型,選取1.5月齡雌性轉(zhuǎn)基因陽性Tg6799小鼠隨機(jī)分為模型組9只和治療組8只,同齡、同背景的C57BL/6J野生型雌性小鼠9只為正常組。治療組進(jìn)行雙側(cè)心俞、腎俞麥粒灸治療,治療結(jié)束后,應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)小鼠額葉皮層及海馬區(qū)Aβ1-40的表達(dá)水平。結(jié)果與模型組比較,治療組小鼠大腦額葉皮層和海馬區(qū)Aβ1-40表達(dá)明顯減少(P＜0.01,P＜0.05)。結(jié)論艾灸療法早期干預(yù)可減少AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ1-40的表達(dá),延緩AD病理過程的進(jìn)展。

阿爾茨海默病;5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠;麥粒灸;早期干預(yù);β淀粉樣蛋白1-40

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種漸進(jìn)性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,由德國神經(jīng)解剖學(xué)家和精神病醫(yī)生Alois Alzheimer于1906年首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[1]。AD發(fā)生的比例約占癡呆的 60%～70%,是癡呆中最常見的一種形式[2-4],其起病隱匿,病程呈進(jìn)行性惡化,記憶障礙是該病早期最突出的癥狀,隨著病情的發(fā)展,逐漸出現(xiàn)其他認(rèn)知功能障礙,精神、行為障礙和日常生活能力下降等[5-6]。隨著老齡化社會(huì)的到來,AD的發(fā)病率不斷上升,成為老年人病亡率的第4位,嚴(yán)重威脅著人類健康和社會(huì)發(fā)展[7-8],因此 AD的早期研究、早期防控、對(duì)癥治療具有很大意義[9]。目前,尚缺乏安全、有效、經(jīng)濟(jì)的AD治療藥物,西藥如鹽酸美金剛、鹽酸多奈哌齊均為單一作用靶點(diǎn),長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)明顯[10-13]。隨著科學(xué)的發(fā)展,醫(yī)學(xué)發(fā)展也開始著重于以預(yù)防為主,傳承了中醫(yī)學(xué)“治未病”的重要思想[14-16]。艾灸療法作為中醫(yī)特色療法,具有延年益壽、保健及預(yù)防疾病的功效[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)艾灸能調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、自由基代謝等,提高機(jī)體的抗病能力[20-23]。研究表明,Aβ1-40寡聚體能夠通過激活 N-甲基-D-天冬氨酸受體,導(dǎo)致在組建突觸后膜致密體和在突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)中起著核心與重要作用的 PSD95(postsynaptic density protein 95,PSD95)和發(fā)動(dòng)機(jī)蛋白(motor proteins, MP)的降解,擾亂突觸的可塑性和完整性,并且能夠加重 Tau蛋白的過度磷酸化,影響 AD小鼠早期行為記憶功能[24]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察在AD病理早期介入麥粒灸治療對(duì)可以共同表達(dá)5個(gè)家族性阿爾茨海默病(familial Alzheimer's disease,FAD)基因突變的 5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)β淀粉樣蛋白1-40(β-amyloid protein1-40,Aβ1-40)表達(dá)的影響,對(duì)艾灸防治AD的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799 Vas/J品系轉(zhuǎn)基因AD小鼠雜合體種鼠4只,由中科院上海生命科學(xué)院生化所景乃禾研究員惠贈(zèng),配種鼠由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心/上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(滬)2007-0005]。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心 SPF級(jí)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物室,并進(jìn)行保種、繁衍后代。繁殖體系為雄性的雜合子小鼠與野生型雌性小鼠交配。出生的子代小鼠在3～4星期后剪尾鑒定。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查所依據(jù)的動(dòng)物保護(hù)原則、動(dòng)物福利原則、倫理原則和綜合性科學(xué)評(píng)估原則。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑

艾絨(中國漢醫(yī)艾絨);瓊脂糖凝膠、溴乙錠(EB)(上海生工生物工程有限公司);10%水合氯醛(批號(hào)02030,上海化學(xué)試劑有限公司);PBS磷酸鹽緩沖液(ZLI-9062)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗Aβ1-40(批號(hào)為 bs-0877R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司);SP試劑盒(批號(hào)為 13152A10,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);濃縮型 DAB試劑盒(ZLI-9032)(批號(hào)為60882801,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2 主要儀器

PTC-200 PCR擴(kuò)增儀(Biorad公司);臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Thermo公司);脫水機(jī)STP120(Micron公司);包埋機(jī) AP280-2(Micron公司);切片機(jī) HM335E(Micron公司)。

1.3 方法

1.3.1 PCR法鑒定APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型

繁殖所產(chǎn)生雌性后代共29只,3周齡時(shí)剪取小鼠鼠尾(約 0.5 cm)放入 1.5 mL離心管內(nèi)。每管中加入 0.5 mL裂解液,56℃轉(zhuǎn)動(dòng) 2 h以上或過夜。離心20 min,取上清,加入等體積異丙醇混勻,放置30 min; 12000 rmp離心10 min,沉淀DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA片段,制備2%瓊脂糖凝膠加溴化乙錠5 μL,加入擴(kuò)增后 DNA10 μL,120 V,30 min 電泳,觀察PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度。

1.3.2 動(dòng)物分組和治療方法

PCR檢測(cè)結(jié)束后,共有APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鑒定結(jié)果為陽性的雌性小鼠17只,1.5月齡時(shí)將17只雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組和治療組(模型組9只,治療組8只)。同齡、同背景的C57BL/6J陰性純合子(野生型)雌性小鼠9只(1.5月齡)為正常組。

1.5 月齡時(shí)開始進(jìn)行治療。治療組,人工固定小鼠,以麥粒大小圓錐形艾炷(直徑5 mm,高8 mm)灸雙側(cè)心俞穴和腎俞穴,艾炷燃燒至3/5,即去除,每次灸1壯,每壯時(shí)間約25～30 s。正常組和模型組給予抓取、固定及放置未燃燒的艾炷等刺激。小鼠治療時(shí)間均為每日1次,10次為1個(gè)療程,共治療9個(gè)療程,療程之間間隔2 d(治療全部結(jié)束后小鼠為5月齡)。在治療過程中,治療組小鼠死亡1只,模型組死亡2只,考慮是因體質(zhì)虛弱而死亡。

1.3.3 樣本取材處理

治療結(jié)束后,各組小鼠腹腔注射 10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)進(jìn)行麻醉,打開胸腔,經(jīng)升主動(dòng)脈及左心室灌注生理鹽水及 4%多聚甲醛,灌注固定后斷頭,完整取出小鼠腦,置4%多聚甲醛中固定24 h后常規(guī)石蠟包埋。包埋完成后,于每只小鼠腦組織包埋蠟塊視交叉前、后連續(xù)冠狀切片。

1.4 觀察指標(biāo)

免疫組化法檢測(cè)Aβ1-40表達(dá)。石蠟切片脫蠟至水,3%H2O2孵育10 min;PBS洗 5 min×3次。滴加封閉用正常山羊血清孵育1 h,傾棄,勿洗,滴加適合濃度稀釋的一抗(Aβ1-401：150),移至 4℃冰箱孵育過夜。次日 PBS沖洗,滴加二抗,37℃孵育1 h,PBS洗5 min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP),37℃孵育1 h,PBS沖洗5 min×3次;滴加DAB顯色劑,顯微鏡下觀察顯色情況,蘇木素復(fù)染,脫水,樹脂封片,顯微鏡觀察。采用Carl Zeiss Imaging Systems圖像分析儀拍照,每張切片海馬區(qū)和額葉皮層各取 6個(gè)視野(×40),采用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Image Pro-plus5.0進(jìn)行分析,測(cè)量其陽性面積(area)、總光密度值(Integrated optical density, IOD)并進(jìn)行匯總。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSSl7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組數(shù)據(jù)結(jié)果描述均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析(One-Way-ANOVA),組間兩兩比較,方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn);方差不齊,采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)所用的 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠表型穩(wěn)定,PCR法鑒定子代小鼠基因型,PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為Tg(APP),轉(zhuǎn)基因 377bp,野生型324bp;Tg(PS1),轉(zhuǎn)基因 608bp,野生型324bp。

圖1 PCR法鑒定APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的凝膠電泳分析

所生雌性子代小鼠共29只,其中PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為Tg(APP)377bp、Tg(PS1)608bp的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因陽性雌性小鼠17只作為本次實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象,隨機(jī)分組為模型組(9只)和治療組(8只)。

2.2 各組小鼠額葉皮層及海馬區(qū)Aβ1-40表達(dá)的變化

各組小鼠海馬區(qū)和額葉皮層均可見棕黃色陽性表達(dá),反應(yīng)部位位于細(xì)胞胞漿和胞膜,細(xì)胞核呈陰性。與正常組比較,模型組小鼠額葉皮層及海馬區(qū)Aβ1-40表達(dá)陽性面積明顯增加,差異顯著(P＜0.01),總光密度值增高(P＜0.01);與模型組比較,艾灸治療后,治療組小鼠海馬區(qū) Aβ1-40表達(dá)顯著下降(P＜0.01),額葉皮層Aβ1-40表達(dá)的陽性面積和總光密度值也明顯減少(P＜0.05,P＜0.01);與正常組比較;治療組小鼠腦內(nèi)Aβ1-40表達(dá)水平無顯著性差異(P＞0.05),見圖2、圖3、圖4。

圖2 各組小鼠額葉皮層Aβ1-40表達(dá)的陽性面積和總光密度比較

圖3 各組小鼠海馬區(qū)Aβ1-40表達(dá)的陽性面積和總光密度比較

圖4 各組小鼠額葉皮層及海馬區(qū)Aβ1-40表達(dá)(免疫組化,×40,箭頭示Aβ1-40陽性細(xì)胞)

3 討論

β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)異常堆積形成的老年斑(senile plaque,SP)是AD的主要病理特征之一[25]。目前AD的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,Hardy JA等[26]提出的“淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說”是目前較為公認(rèn)的AD發(fā)病機(jī)制學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為Aβ的產(chǎn)生與清除失衡引起的Aβ沉積是AD病理改變過程的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié),可以引起氧化應(yīng)激、軸突損傷和突觸丟失等一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終造成神經(jīng)元死亡,導(dǎo)致癡呆[27-29]。目前很多國內(nèi)外研究都論證了這一學(xué)說,并證明 Aβ可以激活細(xì)胞炎癥因子引起神經(jīng)炎癥反應(yīng),誘發(fā)tau蛋白磷酸化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng),破壞突觸可塑性[30-31],因此減少或消除 Aβ的形成和沉積,增加 Aβ的清除,延緩或抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生是研究篩選防治AD的重要趨勢(shì)[32]。Aβ作為AD病理過程的一種觸發(fā)分子,它是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)通過蛋白酶水解途徑裂解而來[33]。在病理情況下,APP在β分泌酶和γ分泌酶的先后作用下形成 Aβ,根據(jù)切割位點(diǎn)不同,可形成不同長(zhǎng)度的Aβ,一般由39～43個(gè)氨基酸組成,其中最常見的類型是 Aβ1-40和 Aβ1-42[34]。Aβ1-42具有很強(qiáng)的聚集能力,神經(jīng)毒性大,是老年斑的主要成份,但其本身并不能形成成熟的老年斑塊,只有在Aβ1-40聚集的作用下,才能形成成熟的具有神經(jīng)毒性的老年斑[35]。Aβ1-40可經(jīng)過血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腦,促進(jìn) Aβ1-42的積聚,加速 Aβ引起的 AD病理過程[36]。大腦皮質(zhì)和海馬的突觸損傷是AD腦內(nèi)另一個(gè)突出的神經(jīng)病理學(xué)改變,在AD早期即可出現(xiàn)。在AD腦中,突觸數(shù)量減少較神經(jīng)元喪失更顯著,研究發(fā)現(xiàn),不論是可溶性的Aβ1-40還是不可溶性的Aβ1-40與AD腦內(nèi)的突觸損傷均有著很強(qiáng)的相關(guān)性,且引起突觸損傷的相關(guān)性要大于 Aβ1-42[37]。θ節(jié)律被認(rèn)為是與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦電波,實(shí)驗(yàn)研究表明,Aβ1-40隔閡內(nèi)注射后,不僅可以引起膽堿能神經(jīng)元及谷氨酸能神經(jīng)元的大量丟失,抑制突觸之間的傳遞聯(lián)系,還可以引起海馬區(qū)θ節(jié)律的紊亂,從而造成學(xué)習(xí)記憶能力功能下降[38]。本研究所選用的5XFAD(familial Alzheimer's disease,FAD)轉(zhuǎn)基因小鼠可共表達(dá)β-APP Swedish突變(K670N,M671L)、Florida突變(I716V)、London突變(V717I)以及突變的早老素蛋白 1(Presinilinl,PS1)M146L、L286V 5個(gè)突變位點(diǎn)的基因突變,可全面、快速地模擬AD的病理過程和行為學(xué)特征[39]。5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在短期內(nèi)產(chǎn)生APP、大量的Aβ沉積、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生,并隨年齡的增加逐漸加重,逐漸出現(xiàn)神經(jīng)元死亡、行為學(xué)異常[40]。其中Tg6799模型鼠在1.5月齡時(shí)腦內(nèi)已經(jīng)開始出現(xiàn) Aβ1-42的聚積,隨后逐漸發(fā)生Aβ1-40的顯著聚積,在2月齡時(shí),開始出現(xiàn)明顯可見的淀粉樣蛋白沉積物和膠質(zhì)細(xì)胞過度增生的神經(jīng)炎性反應(yīng),另研究表明,在4～5月齡時(shí),5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠開始表現(xiàn)出空間認(rèn)知功能障礙[39,41]。因此,本研究選擇在5XFAD轉(zhuǎn)基因1.5月齡時(shí)介入麥粒灸治療,探討艾灸早期干預(yù)對(duì)AD病理過程進(jìn)展的影響。

阿爾茨海默病屬中醫(yī)學(xué)“癡呆”“愚癡”“善忘”“郁證”等范疇[42-44],中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“心主神明”“腦為元神之府”,《素問·靈蘭秘典論》：“腎者,作強(qiáng)之官,伎巧出焉?！惫手嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為癡呆的發(fā)病與心、腦、腎關(guān)系密切,腎精不足、髓?？仗撌瞧涑Ｒ姴∫騕45-47],治療上常以培補(bǔ)腎元、填精益髓、健脾養(yǎng)心、補(bǔ)虛扶正為主[48]。艾灸作為傳統(tǒng)特色療法,已有數(shù)千年歷史。在身體尚未出現(xiàn)病癥之前或者還處于初發(fā)病階段,采用艾灸療法,可通過艾葉辛溫之性,激發(fā)人體經(jīng)絡(luò)之氣,溫陽補(bǔ)虛,以達(dá)到補(bǔ)益人體正氣,防病保健“治未病”的目的[49]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,艾絨燃燒過程中輻射的近紅外線可穿透機(jī)體組織,誘導(dǎo)局部肌肉產(chǎn)生熱休克蛋白,激活機(jī)體的免疫系統(tǒng),達(dá)到治病強(qiáng)身健體的作用[50]。此外,有研究表明,艾灸可以阻止海馬線粒體膜電位的耗散,抑制神經(jīng)元凋亡,抑制氧化應(yīng)激,改善腦能量的代謝障礙[51]。因此本研究選用心俞、腎俞進(jìn)行麥粒灸法早期干預(yù),利用艾灸灸火熱力對(duì)機(jī)體的溫?zé)岽碳そY(jié)合兩穴調(diào)節(jié)臟腑功能的作用以期達(dá)到養(yǎng)心安神、填精益髓之功。

隨著疾病醫(yī)學(xué)向健康醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)變,醫(yī)學(xué)發(fā)展的方向也逐漸轉(zhuǎn)向預(yù)防為主,醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)將是“防患于未然”“防微杜漸”,傳承了中醫(yī)學(xué)“治未病”的重要思想。“治未病”思想被歷代醫(yī)家奉為行醫(yī)治病的最佳境界,包含著未病先防、既病防變及瘥后防復(fù)三種觀念。在疾病發(fā)生之前,看見疾病征兆,提前介入中醫(yī)傳統(tǒng)治療,可預(yù)防疾病的進(jìn)一步傳變[52]。本研究在5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠1.5月齡時(shí)腦內(nèi)剛開始發(fā)生Aβ聚集的AD病理過程早期介入麥粒灸治療,通過艾灸治療后,與模型組比較,治療組小鼠額葉皮層和海馬區(qū)Aβ1-40的表達(dá)明顯減少。研究結(jié)果表明,艾灸治療AD的機(jī)制可能是通過早期抑制Aβ1-40的產(chǎn)生,進(jìn)一步影響Aβ積聚形成成熟的具有神經(jīng)毒性的產(chǎn)物,從而延緩 AD病理過程進(jìn)展,達(dá)到“既病防變”的目的。

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Effect of Early Moxibustion Intervention on the Expression of Amyloid β-protein1-40in 5XFAD Transgenic Mice

YU Jing1,BAO Y e-hua1,ZHANG Y ong-sheng2,CHU Jia-mei1.1.Hangzhou Hosp ital o f T raditional Chinese Medicine,Hangzhou310007,China; 2.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou310053,China

ObjectiveTo explore effect of early moxibustion intervention on cerebral Aβ1-40in a mouse model of Alzheimer disease (AD) and the mechanism of action of moxibusion in preventing and treating AD. Method Gene phenotype in transgenic AD passage mice was identified using PCR. One and a half-month-old female Tg6799 transgenic mice were randomly allocated, including nine mice to a model group and eight mice to a treatment group.Nine C57BL/6J wild type female mice of the same age and background constituted a normal control group.Wheat-grain-sized moxa cone moxibustion on bilateral points Xinshu(BL15) and Shenshu(BL23) was given to the treatment group. After the completion of treatment, Aβ1-40expression in mouse frontal cortex and hippocampal region was determined using the immunohistochemical method.ResultAβ1-40expression in mouse frontal cortex and hippocampal region decreased significantly in the treatment group compared with the model group (P＜0.01,P＜ 0.05).ConclusionEarly moxibustion intervention can decrease cerebral Aβ1-40expression and delay AD pathological process in a mouse model of AD.

Alzheimer disease; 5XFAD transgenic mice; Wheat-grain-sized moxa cone moxibustion; Early intervention; Amyloid β-protein1-40

R2-03

A

2017-03-12

1005-0957(2017)10-1253-07

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.10.1253

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY13H270002)

余靜(1989—),女,醫(yī)師,碩士,Email：zegnajing@163.com

包燁華(1972—),女,主任醫(yī)師,碩士,研究方向?yàn)獒樉闹委熌X功能障礙性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究,Email：13336101400@163.com