牙齦卟啉單胞菌脂多糖對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟及功能影響的體外研究

蘇 寒，毛 釗，陳 偉，郭 婷，閆 翔

·論 著·

牙齦卟啉單胞菌脂多糖對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟及功能影響的體外研究

蘇 寒1，毛 釗1，陳 偉1，郭 婷1，閆 翔2

目的研究牙齦卟啉單胞菌脂多糖(P. gingivalis-LPS)的刺激對(duì)大鼠樹突狀細(xì)胞(DCs)成熟及功能的影響，為探索DCs在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)P. gingivalis-LPS和大腸桿菌脂多糖(E.coli-LPS)刺激下，CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+和CD11c+CD40+DCs的比率；采用ELISA法檢測(cè)DCs分泌白介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)和白介素-13(IL-13)的量。采用CCK8法檢測(cè)與上述DCs共培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞的增殖；采用ELISA法檢測(cè)T細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-13的量。在上述的培養(yǎng)系統(tǒng)中加入Toll樣受體4(TLR4)抑制劑(polymyxin B, PmB)或TLR2/TLR4抑制劑(oxidation of 1-palmitoyl-2-arachidonyl-sn- glycero-3-phosphorylcholine ,OxPAPC)，觀察TLR抑制劑對(duì)上述DCs成熟及功能的影響。結(jié)果P.gingivalis-LPS與E.coli-LPS均能刺激DCs成熟。TLR4抑制劑明顯抑制E.coli-LPS組DCs成熟和抗原提呈功能，對(duì)P.gingivalis-LPS組DCs成熟和抗原提呈功能沒有顯著抑制。TLR2/TLR4抑制劑對(duì)P.gingivalis-LPS組DCs成熟和抗原提呈功能顯著抑制。P.gingivalis-LPS組DCs分泌IL-12和IFN-γ的量低于E.coli-LPS組(P<0.05)；P.gingivalis-LPS組DCs分泌IL-10 和IL-13的量高于E.coli-LPS組(P<0.05)。與P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS共培養(yǎng)的DCs均能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖。與P.gingivalis-LPS組DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的量低于E.coli-LPS組(P<0.05)；其分泌IL-10的量高于E.coli-LPS組(P<0.05)。結(jié)論P(yáng).gingivalis-LPS能促進(jìn)DCs的成熟和抗原提呈功能。P.gingivalis-LPS刺激下的DCs促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答；E.coli-LPS刺激下的DCs促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答。P.gingivalis- LPS通過TLR2通路刺激DCs成熟；E.coli-LPS通過TLR4通路刺激DCs成熟。

樹突狀細(xì)胞；牙齦卟啉單胞菌脂多糖；大腸桿菌脂多糖；細(xì)胞表型；抗原提呈

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展的病原微生物，其致病成分包括脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、莢膜多糖、菌毛蛋白和牙齦素。P.gingivalis-LPS是牙周炎的主要致病因素之一，在牙周炎的病程中可引起不同類型的免疫和炎癥反應(yīng)[1]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)廣泛分布于組織和器官，是體內(nèi)的專效抗原提呈細(xì)胞。未成熟DCs 攝取抗原,成熟DCs向na?ve T淋巴細(xì)胞提呈抗原并刺激na?ve T細(xì)胞分化為效應(yīng)性T細(xì)胞。因此，DCs是先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答之間的重要橋梁[2]。微生物成分對(duì)DCs的刺激可上調(diào)DCs表面共刺激分子的表達(dá)并促進(jìn)DCs分泌炎性細(xì)胞因子，促使輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)分化為Th1或Th2細(xì)胞[3-4]。上述過程始于DCs通過其表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識(shí)別不同的抗原物質(zhì)(包括病原微生物成分)，因此PRRs及它們的配體在DCs成熟和發(fā)揮抗原提呈功能的過程中具有重要作用。目前已知牙周炎的發(fā)病機(jī)制為宿主對(duì)牙周病原體感染的免疫反應(yīng)，宿主免疫系統(tǒng)在此過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者的牙齦上皮組織中存在著DCs，然而，這些DCs在牙周炎的發(fā)展過程中的確切作用機(jī)制還不清楚[5]。本研究擬對(duì)P. gingivalis-LPS對(duì)SD大鼠骨髓源性DCs成熟及功能的影響進(jìn)行研究，為探索DCs在牙周炎病程中的可能作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只6～8周齡雄性SD大鼠(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK2012-0014)，體重200～220 g，養(yǎng)育在南京總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特定病原體(specific pathogen-free,SPF)環(huán)境中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的所有步驟均得到了南京大學(xué)動(dòng)物使用和保護(hù)委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、熱滅活胎牛血清(FBS)、青鏈霉素 (均購自 HyClone公司)；重組大鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rrGM-CSF)、重組大鼠IL-4(rrIL-4)，IFN-γ、IL-12、IL-2、IL-10、IL-13大鼠ELISA試劑盒(均購自R&D公司)；牙齦卟啉單胞菌脂多糖(P.gingivalis-LPS ,standard LPS from P. gingivalis)、TLR4信號(hào)抑制劑—Polymyxin B (PmB)、TLR2/TLR4 信號(hào)抑制劑—OxPAPC (均購自Invivogen公司)；大腸桿菌脂多糖(E.coli-LPS,standard LPS from E.coli 0111:B4) (購自Sigma-Aldrich公司)；anti-CD11c-PE,anti-MHCⅡ-APC,anti-CD86-FITC,anti-CD80-APC,anti-CD40-FITC抗大鼠單克隆流式抗體(均購自eBioscience公司)；CD4抗大鼠單克隆抗體磁珠(購自Miltenyi公司)；CCK8試劑盒(購自Dojindo公司)。

1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從SD大鼠的脛骨、股骨和肱骨新鮮收集全骨髓細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)于加入了10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，并在其中加入10 ng/mL rrGM-CSF和1 ng/mL rrIL-4以促進(jìn)DCs的生成。細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃飽和濕度、5%CO2的細(xì)胞孵育箱內(nèi)，每隔1 d進(jìn)行半量換液并保持所有的試劑濃度不變，收集懸浮的細(xì)胞。 培養(yǎng)6 d后，將收獲的細(xì)胞以2×106/孔的密度培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將這些細(xì)胞隨機(jī)分為7組：對(duì)照組、E.coli-LPS組、P.gingivalis-LPS組、E.coli-LPS+PmB組、E.coli-LPS+OxPAPC組、P.gingivalis- LPS+PmB組和P.gingivalis-LPS+OxPAPC組。依據(jù)分組將試劑按以下濃度加入培養(yǎng)基：E.coli-LPS 100 ng/mL；P.gingivalis-LPS 100 ng/mL；PmB 30 μg/mL；OxPAPC 30 μg/mL。其中，PmB和OxPAPC作為TLR抑制劑，均于E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS加入培養(yǎng)基30 min前被添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞懸浮液和粘附松散的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD11c的表達(dá)，結(jié)果顯示CD11c+細(xì)胞比例高于90%，這些細(xì)胞可被認(rèn)為是DCs。

1.2.2細(xì)胞表型分析 細(xì)胞培養(yǎng)的第8天，收集、計(jì)數(shù)并用PBS沖洗各組細(xì)胞，將其再懸浮后以5×105/mL轉(zhuǎn)至流式管。根據(jù)制造商的說明書分別將anti-CD11c-PE,anti-MHCⅡ-APC,anti-CD86-FITC,anti-CD80-APC,anti-CD40-FITC抗大鼠單克隆抗體加入流式管，陰性對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體，在4 ℃黑暗環(huán)境中孵育細(xì)胞30 min，用PBS沖洗2次使細(xì)胞充分懸浮。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表面分子的表達(dá)，采用flowjo7.6.1軟件處理實(shí)驗(yàn)中獲得的原始數(shù)據(jù)，分析各組雙標(biāo)CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD40+細(xì)胞的百分比。所有檢測(cè)均一式3份進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。1.2.3細(xì)胞因子檢測(cè) DCs分泌的細(xì)胞因子可影響DCs的后續(xù)功能，采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)、IL-10和IL-13的含量，以研究E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS刺激DCs分泌細(xì)胞因子的能力。細(xì)胞培養(yǎng)的第8天，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液以檢測(cè)DCs分泌的細(xì)胞因子。采用大鼠IFN-γ、IL-12、IL-10和IL-13 ELISA試劑盒，按照制造商的說明，在酶標(biāo)儀上采用450 nm波長測(cè)量各孔上清液的吸光值(A450)，判定結(jié)果。所有檢測(cè)均一式3份進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.4混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 取SD大鼠脾細(xì)胞，按照制造商的說明書，采用CD4+T細(xì)胞磁珠分選系統(tǒng)獲取純化的CD4+T細(xì)胞。采用PE-CD4抗體經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，獲得的CD4+T細(xì)胞純度為90%～95%。將前述實(shí)驗(yàn)所獲得的各組DCs與密度為2×106/mL的CD4+T細(xì)胞按照1∶10的比例在96孔培養(yǎng)板中共培養(yǎng)。每孔加入含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素 和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL，輕吹吸、混勻細(xì)胞懸液以保證DCs和T細(xì)胞充分有效的接觸。將培養(yǎng)板放置于37 ℃飽和濕度、5% CO2的細(xì)胞孵育箱內(nèi)培育72 h。細(xì)胞培育結(jié)束前4 h，按照制造商的說明書，在培養(yǎng)板的每孔內(nèi)加入10 μL CCK-8。孵育4 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定A450 nm值，以確定T細(xì)胞的增殖。測(cè)定重復(fù)3次，取其平均值為最終結(jié)果。

如前所述，每一組的DCs均與CD4+T細(xì)胞按照1∶10的比例共培養(yǎng)72 h。采用ELISA試劑盒按照制造商的說明測(cè)定上清液中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-13 A450 nm值，判定結(jié)果。所有檢測(cè)均一式3份進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1E.coli-LPS和P. gingivalis-LPS促進(jìn)DCs表面MHCⅡ、CD80、CD86和CD40分子的表達(dá) 各組CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+和CD11c+CD40+DCs比率如圖1～4所示。將結(jié)果以直方圖的形式表示如圖5所示，與對(duì)照組相比，相同濃度的P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS(100 ng/mL)均能顯著上調(diào)DCs MHCⅡ、CD80、CD86、CD40的表達(dá)水平(P<0.05)。P. gingivalis-LPS和E.coli-LPS組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果表明，P. gingivalis-LPS和E.coli-LPS均能刺激DCs成熟。

圖1 各組 CD11c+MHCⅡ+ DCs流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果

圖2 各組 CD11c+CD80+ DCs 流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果

圖3 各組 CD11c+CD86+ DCs 流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果

圖4 各組 CD11c+CD40+ DCs 流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果

E.coli-LPS和P. gingivalis-LPS均能促進(jìn)DCs的成熟；PmB抑制E.coli-LPS的作用；OxPAPC抑制P. gingivalis-LPS的作用；*P<0.05圖5 各組CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+ 和CD11c+CD40+ DCs流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果直方圖比較

2.2E.coli-LPS和P. gingivalis-LPS通過不同的TLRs通路刺激DCs成熟 E.coli-LPS+PmB組和E.coli-LPS+OxPAPC 組DCs MHCⅡ、CD80、CD86和 CD40表達(dá)均明顯低于E.coli-LPS組(P<0.05)；E.coli-LPS+PmB組和E.coli-LPS+ OxPAPC 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這些結(jié)果表明，在E.coli-LPS培養(yǎng)系統(tǒng)中加入TLR4抑制劑后，DCs 表達(dá)MHCⅡ、CD80、CD86和 CD40能力下降，即TLR4抑制劑可以抑制E.coli-LPS誘導(dǎo)的DCs成熟。P.gingivalis-LPS+PmB組與P.gingivalis-LPS組相比，DCs MHCⅡ、CD80、CD86和CD40表達(dá)未見明顯下降(P>0.05)。P.gingivalis-LPS+ OxPAPC 組DCs MHCⅡ、CD80、CD86和CD40表達(dá)明顯低于P.gingivalis-LPS組與P.gingivalis-LPS+PmB組(P<0.05)。這些結(jié)果表明，TLR4信號(hào)抑制劑不能抑制P.gingivalis-LPS刺激DCs成熟，而TLR2/TLR4信號(hào)通路抑制劑可明顯抑制P.gingivalis-LPS刺激DCs成熟。以上結(jié)果表明，E.coli-LPS對(duì)DCs的刺激依賴TLR4信號(hào)通路而P.gingivalis-LPS對(duì)DCs的刺激依賴TLR2信號(hào)通路。見圖5。

2.3E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS刺激DCs分泌不同類型的細(xì)胞因子 P.gingivalis-LPS組DCs分泌IL-12和IFN-γ的能力低于E.coli-LPS組(P<0.05)，同時(shí)，P.gingivalis-LPS組DCs分泌IL-10和IL-13的能力高于E.coli-LPS組(P<0.05)。這些結(jié)果表明，E.coli-LPS刺激下的DCs誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，P.gingivalis-LPS刺激下的DCs誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)。TLR4抑制劑(PmB)和TLR2/TLR4抑制劑(OxPAPC)的加入都可使E.coli-LPS組DCs IL-12、IFN-γ，IL-10和IL-13的分泌明顯降低(P<0.05)；E.coli-LPS+PmB組和E.coli-LPS+OxPAPC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。P.gingivalis-LPS組加入PmB后，DCs分泌IL-12、IFN-γ，IL-10和IL-13的量未見明顯下降(P>0.05)；P.gingivalis-LPS組加入OxPAPC后，DCs分泌IL-12、IFN-γ，IL-10和IL-13的量均顯著下降(P<0.05)；P.gingivalis-LPS+OxPAPC組這些細(xì)胞因子的量也明顯低于P.gingivalis-LPS+PmB組。這些結(jié)果與前述流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果相一致，即E.coli-LPS通過TLR4信號(hào)通路刺激DCs而P.gingivalis-LPS通過TLR2信號(hào)通路刺激DCs。見圖6。

E.coli-LPS促進(jìn)DCs分泌IL-12和IFN-γ, P.gingivalis-LPS促進(jìn)DCs分泌IL-10和IL-13; PmB抑制E.coli-LPS的作用；OxPAPC抑制P. gingivalis-LPS的作用；*P<0.05圖6 各組DCs分泌的細(xì)胞因子結(jié)果比較

2.4E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS刺激后的DCs觸發(fā)不同類型的T細(xì)胞反應(yīng) 各組DCs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后的CCK8法細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。在促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖方面，E.coli-LPS組DCs和P.gingivalis-LPS組DCs差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。E.coli-LPS+PmB組DCs和E.coli-LPS+OxPAPC組DCs較E.coli-LPS組T細(xì)胞增殖均有明顯下降(P<0.05)，E.coli-LPS+PmB組和E.coli-LPS+OxPAPC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。P.gingivalis-LPS+PmB組DCs刺激T細(xì)胞增殖與P.gingivalis-LPS組相較未見明顯下降(P>0.05)。P.gingivalis-LPS+OxPAPC組DCs刺激T細(xì)胞增殖較P.gingivalis-LPS組和P.gingivalis-LPS+PmB組可見明顯下降(P<0.05)。

與各組DCs共培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的定量分析結(jié)果見圖8。P.gingivalis-LPS組T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的量低于E.coli-LPS組(P< 0.05)，P. gingivalis-LPS組T細(xì)胞分泌IL-10的量高于E. coli-LPS組(P<0.05)，2組T細(xì)胞分泌IL-13的量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這些結(jié)果與E.coli-LPS或P. gingivalis-LPS刺激DCs分泌不同類型細(xì)胞因子的結(jié)果相一致，說明受E.coli-LPS刺激的DCs具有激發(fā)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)；受P.gingivalis-LPS刺激的DCs具有激發(fā)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。與E.coli-LPS+PmB組DCs和E.coli-LPS+OxPAPC組DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-13與E.coli-LPS組相比均明顯下降，E.coli-LPS+PmB組和E.coli-LPS+OxPAPC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與P.gingivalis-LPS+ PmB組DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-13與P.gingivalis-LPS組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。P.gingivalis-LPS+OxPAPC組T細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-13明顯低于P.gingivalis-LPS組和P.gingivalis-LPS+PmB組(P<0.05)。這些結(jié)果與前述結(jié)果相一致，表明E.coli-LPS通過TLR4信號(hào)通路刺激DCs而P.gingivalis- LPS通過TLR2信號(hào)通路刺激DCs。

1：E.coli-LPS組；2：E.coli-LPS+PmB組；3：E.coli-LPS+OxPAPC組；4：P.gingivalis-LPS組；5：P.gingivalis-LPS+PmB組；6：P.gingivalis-LPS+OxPAPC；7：對(duì)照組 E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS均可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖；PmB抑制E.coli-LPS的作用；OxPAPC抑制P. gingivalis-LPS的作用；*P<0.05

圖7 CCK-8法檢測(cè)各組DCs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)的T細(xì)胞增殖結(jié)果

E.coli-LPS促進(jìn)與DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ, P.gingivalis-LPS促進(jìn)與DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞分泌IL-10; PmB抑制E.coli-LPS的作用；OxPAPC抑制P. gingivalis-LPS的作用；*P<0.05

圖8與各組DCs共培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子結(jié)果比較

3 討 論

P.gingivalis-LPS是牙周炎的主要致病因素之一，其對(duì)于牙周組織細(xì)胞的作用一直是研究的熱點(diǎn)[6]。E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS雖然同為LPS，其兩者對(duì)于不同細(xì)胞系的作用途徑和作用結(jié)果不盡相同。Kirikae等[7]研究表明，P.gingivalis-LPS能夠刺激TLR4缺失的C3H/HeJ小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用。Jones等[8]研究指出，E.coli-LPS刺激大鼠牙齦成纖維細(xì)胞分泌更多的IL-6、iNOS和MCP-1而P.gingivalis-LPS刺激大鼠巨噬細(xì)胞分泌更多的IL-6、IL-1和MCP-1。Barksby等[9]研究表明，E.coli-LPS通過TLR4通路激活單核細(xì)胞而P.gingivalis-LPS通過TLR2通路激活單核細(xì)胞。Jotwani等[10]研究指出，P.gingivalis-LPS刺激單核細(xì)胞來源DCs成熟需要TLR2和TLR4雙通路。Diya等[11]研究表明，E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS通過不同的信號(hào)通路刺激THP-1細(xì)胞，TLR2-JNK通路在P.gingivalis-LPS引起的慢性牙周炎病程中起重要作用。Sun等[12]研究指出，P.gingivalis-LPS通過TLR2通路刺激THP-1細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受而E.coli-LPS通過TLR4通路刺激THP-1細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受。這些差異產(chǎn)生的原因可能在于P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS脂質(zhì)A的親水性二磷酸鹽構(gòu)架不同導(dǎo)致P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)有所不同，致使P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS對(duì)TLR的親和力產(chǎn)生差異[13]。

有研究證實(shí)，健康牙齦、牙齦炎牙齦和牙周炎牙齦的上皮和結(jié)締組織中都存在著朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells,LCs)和DCs[14]。DCs作為先天性免疫和獲得性免疫之間的橋梁在抗微生物感染方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在牙周病的病程中，DCs的分布和表型的變化調(diào)節(jié)著牙周免疫應(yīng)答[15]。P.gingivalis-LPS是公認(rèn)的牙周主要致病成分，為了研究在牙周病的發(fā)生、發(fā)展過程中，P.gingivalis-LPS和DCs的相互作用，我們進(jìn)行了本研究。

近期已發(fā)表的研究中，學(xué)者們普遍采用濃度為10～200 ng/mL的LPS以研究其對(duì)于不同細(xì)胞系的作用[16-17]。本研究中，我們采用100 ng/mL的P.gingivalis-LPS及100 ng/mL的E.coli-LPS在體外與DCs共培養(yǎng)，以評(píng)價(jià)P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS在促進(jìn)DCs成熟和發(fā)揮抗原提呈功能方面的作用。

Polymyxin B (PmB)是由類芽孢桿菌polymixa產(chǎn)生的環(huán)狀陽離子抗生素肽，PmB已經(jīng)被證實(shí)可阻斷TLR4通路從而抑制LPS的作用[18]。LPS是G-細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，脂質(zhì)A是其有效致病成分。陽離子屬性的PmB與陰離子屬性的脂質(zhì)A相結(jié)合，從而抑制LPS生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮[19]。OxPAPC由1-棕櫚酰-2-花生四烯-sn-甘油-3-磷酰膽堿(phosphorylcholine,PAPC)氧化而來，是含有sn-2全長的氧化磷脂及其殘留碎片的混合物。OxPAPC可同時(shí)抑制細(xì)菌脂肽和LPS的信號(hào)通路，已經(jīng)被證實(shí)為TLR2和TLR4的抑制劑[20]。細(xì)胞上的CD14、LPS結(jié)合蛋白(LPS-binding protein，LBP)和髓樣分化蛋白2(myeloid differential protein 2,MD2)可與細(xì)菌脂質(zhì)相結(jié)合，這些蛋白與TLR共同構(gòu)成LPS受體復(fù)合物，被稱為TLR輔助蛋白。OxPAPC通過與這些TLR輔助蛋白相結(jié)合，導(dǎo)致LPS無法與LPS受體復(fù)合物相結(jié)合，從而抑制TLR2和TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]。

本研究結(jié)果顯示，在E.coli-LPS培養(yǎng)系中加入PmB后，DCs成熟、分泌細(xì)胞因子及其與CD4+T共培養(yǎng)后T細(xì)胞增殖、分泌炎癥因子均被明顯抑制，這些結(jié)果表明，對(duì)于DCs，E.coli-LPS是其TLR4配體。在P.gingivalis-LPS培養(yǎng)系中加入PmB后，DCs成熟、分泌細(xì)胞因子及其與CD4+T共培養(yǎng)后T細(xì)胞增殖、分泌炎癥因子均未見明顯下降；而在P.gingivalis-LPS培養(yǎng)系中加入OxPAPC后，DCs成熟、分泌細(xì)胞因子及其與CD4+T共培養(yǎng)后T細(xì)胞增殖、分泌炎癥因子均被明顯抑制，這些結(jié)果表明，對(duì)于DCs，P.gingivalis-LPS是其TLR2配體。

在DCs抗原提呈功能方面，本研究結(jié)果顯示，P.gingivalis-LPS組DCs分泌的IFN-γ和IL-12較E.coli-LPS組少，P.gingivalis-LPS組DCs分泌的IL-10和IL-13較E.coli-LPS組多。其后的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示，與P.gingivalis-LPS組DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2的量少于與E.coli-LPS組DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞，與P.gingivalis-LPS組DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞分泌IL-10的量多于與E.coli-LPS組DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞。這些結(jié)果表明，較之E.coli-LPS，P.gingivalis-LPS刺激下的DCs具有更強(qiáng)的促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)的能力。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)揭示了P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS在促進(jìn)DCs成熟和抗原提呈功能方面的不同作用途徑。同時(shí)，本研究闡釋了P.gingivalis-LPS刺激下DCs的免疫反應(yīng)，其結(jié)果提示P.gingivalis-LPS刺激導(dǎo)致的DCs成熟和抗原提呈并促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)可能是牙周炎病程中細(xì)胞免疫和體液免疫共同發(fā)生的重要發(fā)病機(jī)制。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明DCs在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用機(jī)制。

[1] Marchesan JT,Morelli T,Lundy SK,etal. Divergence of the systemic immune response following oral infection with distinct strains of Porphyromonas gingivalis[J]. Mol Oral Microbiol,2012,27(6): 483-495.

[2] Vroman H,van den Blink B,Kool M. Mode of dendritic cell activation: the decisive hand in Th2/Th17 cell differentiation. Implications in asthma severity? [J] Immunobiology，2015,220(2): 254-261.

[3] 陳 哲,胡明道,田大廣,等.重組腺病毒介導(dǎo)人類白細(xì)胞抗原-G基因轉(zhuǎn)染恒河猴樹突狀細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的增殖作用[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2017,30(1):5-9.

[4] 周建光,楊 梅,曹海濤,等.淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)在臨床的應(yīng)用[J]. 東南國防醫(yī)藥,2015,17(3):298-300,321.

[5] Hajishengallis G,Tapping RI,Harokopakis E,etal. Differential interactions of fimbriae and lipopolysaccharide from Porphyromonas gingivalis with the Toll-like receptor 2-centred pattern recognition apparatus[J]. Cellular Microbiol, 2006,8(10): 1557-1570.

[6] Kocgozlu L,Elkaim R,Tenenbaum H,etal. Variable Cell Responses to P-gingivalis Lipopolysaccharide[J]. J Dent Res,2009,88(8): 741-745.

[7] Kirikae T,Nitta T,Kirikae F,etal.Lipopolysaccharides (LPS) of oral black-pigmented bacteria induce tumor necrosis factor production by LPS-refractory C3H/HeJ macrophages in a way different from that of Salmonella LPS[J]. Infect Immun,1999,67(4): 1736-1742.

[8] Jones KJ,Ekhlassi S,Montufar-Solis D,etal. Differential cytokine patterns in mouse macrophages and gingival fibroblasts after stimulation with porphyromonas gingivalis or Escherichia coli lipopolysaccharide[J]. J Periodontol,2010,81(12): 1850-1857.

[9] Barksby HE,Nile CJ,Jaedicke KM,etal. Differential expression of immunoregulatory genes in monocytes in response to Porphyromonas gingivalis and Escherichia coli lipopolysaccharide[J]. Clin Exp Immunol,2009,156(3): 479-487.

[10] Jotwani R,Moonga BS,Gupta S,etal. Nuclear factor-kappa B p50 subunits in chronic periodontitis and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide-pulsed dendritic cells[J]. Ann N Y Acad Sci,2010,1192: 278-285.

[11] Diya Z,Lili C,Shenglai L,etal. Lipopolysaccharide (LPS) of Porphyromonas gingivalis induces IL-1beta,TNF-alpha and IL-6 production by THP-1 cells in a way different from that of Escherichia coli LPS[J]. Innate Immun, 2008,14(2): 99-107.

[12] Sun Y,Li H,Sun MJ,etal. Endotoxin tolerance induced by lipopolysaccharides derived from Porphyromonas gingivalis and Escherichia coli: alternations in Toll-like receptor 2 and 4 signaling pathway[J]. Inflammation,2014,37(1): 268-276.

[13] Andrukhov O,Ertlschweiger S,Moritz A,etal. Different effects of P. gingivalis LPS and E.coli LPS on the expression of interleukin-6 in human gingival fibroblasts[J]. Acta Odontol Scand,2014,72(5): 337-345.

[14] Cutler CW,Jotwani R. Dendritic cells at the oral mucosal interface[J]. J Dent Res,2006,85(8):678-689.

[15] Cury PR,Furuse C,Rodrigues AE,etal. Interstitial and Langerhans' dendritic cells in chronic periodontitis and gingivitis[J]. Braz Oral Res,2008,22(3): 258-263.

[16] Kowsar R,Hambruch N,Marey MA,etal. Evidence for a novel,local acute-phase response in the bovine oviduct: progesterone and lipopolysaccharide up-regulate alpha 1-acid-glycoprotein expression in epithelial cells in vitro[J]. Mol Reprod Dev, 2014,81(9): 861-870.

[17] Padial-Molina M,Volk SL,Rios HF. Periostin increases migration and proliferation of human periodontal ligament fibroblasts challenged by tumor necrosis factor -alpha and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharides[J]. J Periodontal Res,2014,49(3): 405-414.

[18] Knobloch J,Feldmann M,Wahl C,etal. Endothelin receptor antagonists attenuate the inflammatory response of human pulmonary vascular smooth muscle cells to bacterial endotoxin[J]. J Pharmacol Exp Ther,2013,346(2): 290-299.

[19] Dadaglio G,Fayolle C,Zhang X,etal. Antigen Targeting to CD11b(+) Dendritic Cells in Association with TLR4/TRIF Signaling Promotes Strong CD8(+) T Cell Responses[J]. J Immunol,2014,193(4): 1787-1798.

[20] von Schlieffen E,Oskolkova OV,Schabbauer G,etal. Multi-Hit Inhibition of Circulating and Cell-Associated Components of the Toll-Like Receptor 4 Pathway by Oxidized Phospholipids[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2009,29(3): 356-362.

[21] Erridge C,Kennedy S,Spickett CM,etal. Oxidized phospholipid inhibition of Toll-like receptor (TLR) signaling is restricted to TLR2 and TLR4 - Roles for CD14,LPS-binding protein,and MD2 as targets for specificity of inhibition[J]. J Biol Chem, 2008,283(36): 24748-24759.

EffectsofPorphyromonasgingivalis-lipopolysaccharideonthematurationandfunctionsofdendriticcells

SU Han1,MAO Zhao1,CHEN Wei1,GUO Ting1,YAN Xiang2

( 1.DepartmentofStomatology，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion，PLA,Nanjing210002，Jiangsu，China; 2.DepartmentofOrthodontics,NanjingStomatologicalHospital,MedicalSchoolofNanjingUniversity,Nanjing210008,Jiangsu，China)

AbstractObjectivedy the roles of P.gingivalis-LPS on the maturation and functions of DCs to provide experimental evidences to explore the possible mechanism of DCs in periodontitis.MethodsFlow cytometry was used to detect CD11c, MHCⅡ, CD80, CD86 and CD40 expression on DCs which were stimulated by P.gingivalis-LPS or E.coli-LPS and ELISA was used to detect IL-12, IFN-γ, IL-10 and IL-13 secreted by DCs. CCK8 was used to assay CD4+T cells proliferation after co-cultured with DCs stimulated by P.gingivalis-LPS or E.coli-LPS and ELISA was used to detect IL-2, IFN-γ, IL-10 and IL-13 secreted by T cells. TLR4 inhibitor (polymyxin B) or TLR2 and TLR4 inhibitor (OxPAPC) was added to P.gingivalis-LPS group and E.coli-LPS group to observe the effects of these two TLR inhibitors on the maturation and antigen-presenting functions of DCs.ResultsThe capacity of P.gingivalis-

LPS to stimulate DCs maturation was similar to that of E.coli-LPS. When TLR4 inhibitor was added to E.coli-LPS group, maturation and antigen-presenting functions of DCs were significantly inhibited. When TLR4 inhibitor was added to P.gingivalis-LPS group, maturation and antigen-presenting functions of DCs were not significantly inhibited. When TLR2 and TLR4 inhibitor was added to P.gingivalis-LPS group,maturation and antigen-presenting functions of DCs were significantly inhibited.The level of IL-12 and IFN-γ secreted by DCs in P.gingivalis-LPS group was significantly lower than that of E.coli-LPS group (P<0.05), meanwhile, IL-10 and IL-13 secreted by DCs in P.gingivalis-LPS group was significantly higher than that of E.coli-LPS group (P<0.05). DCs stimulated by both P.gingivalis-LPS and E.coli-LPS could promote the proliferation of CD4+T cells. The amount of IL-2 and IFN-γ secreted by T cells stimulated by DCs in P.gingivalis-LPS group was significantly lower than that of E.coli-LPS group (P<0.05), meanwhile, IL-10 secreted by T cells stimulated by DCs in P.gingivalis-LPS group was significantly higher than that of E.coli-LPS group (P<0.05).ConclusionP.gingivalis-LPS could promote DCs maturation and antigen-presenting functions. DCs stimulated by P.gingivalis-LPS are prone to induce a stronger Th2 cell responses while DCs stimulated by E.coli-LPS are prone to induce a stronger Th1 cell responses. P.gingivalis-LPS triggers DCs through TLR2 pathway while E.coli-LPS triggers DCs through TLR4 pathway.

Dendritic cells; P.gingivalis-LPS; E.coli-LPS; Phenotype; Antigen-presenting

R780.2

A

1672-271X(2017)05-0465-08

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.05.005

2017-03-12;

2017-08-08)

(本文編輯：葉華珍; 英文編輯：王建東)

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(zkx15035);南京市第七批科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(201507043)

1.210002 南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院口腔科；2.210008 南京，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院正畸科

閆 翔，E-mail: nj12345@126.com

蘇 寒，毛 釗，陳 偉，等.牙齦卟啉單胞菌脂多糖對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟及功能影響的體外研究[J].東南國防醫(yī)藥，2017,19(5):465-472.