雅魯藏布江中游6種裂腹魚乳酸脫氫酶同工酶的比較研究

魏玉眾，張桂蓉，霍 斌，謝從新，陳生熬,

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 新疆阿拉爾 843300；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 武漢 430070)

雅魯藏布江中游6種裂腹魚乳酸脫氫酶同工酶的比較研究

魏玉眾1，張桂蓉2，霍 斌2，謝從新2，陳生熬1,2

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 新疆阿拉爾 843300；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 武漢 430070)

采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)雅魯藏布江中游6種裂腹魚(尖裸鯉Oxygymnocyprisstewartii、拉薩裸裂尻魚Schizopygopsisyounghusbandi、巨須裂腹魚Schizothoraxmacropogon、拉薩裂腹魚S.waltoni、雙須葉須魚Ptychobarbusdipogon和異齒裂腹魚S.o’connori)的心肌、肌肉、肝臟、腎臟和晶狀體5種組織的LDH(乳酸脫氫酶)同工酶進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明LDH同工酶的表達(dá)具有明顯的組織和種間差異性。尖裸鯉、拉薩裸裂尻魚和雙須葉須魚由LDH-A、LDH-B和LDH-B1基因編碼，5種組織中分別檢測(cè)到16、13和9條酶帶；拉薩裂腹魚和巨須裂腹魚由LDH-A、LDH-B和LDH-C基因編碼，5種組織中分別檢測(cè)到9和6條酶帶；異齒裂腹魚由LDH-A和LDH-B基因編碼，5種組織中檢測(cè)到6條酶帶。根據(jù)酶譜特征對(duì)其生物演化進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)尖裸鯉和拉薩裸裂尻魚特化程度最高，其次是雙須葉須魚，巨須裂腹魚、拉薩裂腹魚和異齒裂腹魚特化程度最低，與形態(tài)學(xué)特征所劃分的三個(gè)類群吻合。

裂腹魚；LDH同工酶；聚丙烯酰胺凝膠電泳；組織差異性；種間差異性

Abstract：In order to compare the expression of lactate dehydrogenase (LDH) isozymes amongOxygymnocyprisstewartii,Schizopygopsisyounghusbandi,Schizothoraxmacropogon,S.waltoni,PtychobarbusdipogonandS.o’connori,five tissues (cardiac muscle,muscle,liver,kidney and lens) were analyzed by using discontinuous polyacrylamide gel electrophoresis technology.The results indicated that LDH isozyme expression of the six schizothoracinae fishes has tissue and species specificity.16,13 and 9 LDH isozyme bands encoded by LDH-A,LDH-B and LDH-B1loci were detected in all the 5 tissues ofO.stewartii,S.younghusbandiandP.dipogon,respectively.9 and 6 LDH isozyme bands encoded by LDH-A,LDH-B and LDH-C loci were observed in all the 5 tissues ofS.waltoniandS.macropogon,respectively.6 LDH isozymebandsencodedbyLDH-AandLDH-Blociweredetectedinallthe5tissuesofS.o’connori.According to the characteristics of enzyme spectrum,O.stewartiiandS.younghusbandiwere characterized by the highest specialization degree,thenP.dipogon,and finallyS.macropogon,S.waltoniandS.o’connori.The LDH isozymes evolutionary characteristics of the six Schizothoracinae fishes were corresponded with morphological division of the three groups.

Keywords：Schizothoracinae；LDH isozyme；polyacrylamide gel electrophoresis；tissue specificity；species specificity

分布于西藏雅魯藏布江中游干支流及附屬水體的尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewartii)、拉薩裸裂尻魚(Schizopygopsisyounghusbandi)、巨須裂腹魚(Schizothoraxmacropogon)、拉薩裂腹魚(S.waltoni)、雙須葉須魚(Ptychobarbusdipogon)和異齒裂腹魚(S.o’connori)同屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚亞科(Schizothoracinae)，為我國(guó)特有種，也是青藏高原地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)魚類[1]。近年來(lái)由于人類活動(dòng)和自然環(huán)境因素的影響，數(shù)量急劇下降，合理開發(fā)和利用該種漁業(yè)資源刻不容緩。

同工酶，作為一種生化指標(biāo)，已廣泛應(yīng)用于魚類的種群遺傳結(jié)構(gòu)和物種親緣關(guān)系的分析、物種及雜種鑒定[2-8]，是魚類種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)參數(shù)之一。本研究利用電泳技術(shù)對(duì)6種裂腹魚LDH(乳酸脫氫酶)同工酶進(jìn)行比較研究，以期為它們的種質(zhì)鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

實(shí)驗(yàn)用魚均于2015年11月采自西藏雅魯藏布江曲水段，采集6種裂腹魚，共計(jì)146尾，活體運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，未分雌雄，活體解剖，取實(shí)驗(yàn)用的心肌、肌肉、肝臟、腎臟和晶狀體5種組織。將各組織編號(hào)放入離心管內(nèi)，于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)用魚大小分布范圍，尖裸鯉30尾，體長(zhǎng)180.2～432.5 mm，體重76.2～1 050.6 g；巨須裂腹魚30尾，體長(zhǎng)205.3～346.7 mm，體重146.2～690.4 g；雙須葉須魚30尾，體長(zhǎng)247.3～369.2 mm，體重197.4～590.2 g；異齒裂腹魚30尾，體長(zhǎng)280.3～355.5 mm，體重300.4 ～640.6 g；拉薩裂腹魚12尾，體長(zhǎng)232.5～316.1 mm，體重154.6～340.2 g；拉薩裸裂尻魚14尾，體長(zhǎng)153.3～205.5 mm，體重57.3～160.2 g。

取各組織0.5 g于研缽內(nèi)，并按1∶2(W∶V)的比例加20%的蔗糖在冰浴條件下進(jìn)行勻漿并分裝于離心管內(nèi)。將各組織的勻漿液于4 ℃，12 000 r/min條件下離心40 min，后取其上清液按1∶1(V∶V)的比例加入氯仿，再次離心30 min，取其上清液，并分裝于離心管內(nèi)(每個(gè)離心管取樣量50 μL)，于-20 ℃中短時(shí)間保存。臨用前加入7 μL的溴酚藍(lán)作指示劑進(jìn)行電泳。

1.2 電泳

采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)各組織進(jìn)行電泳。電泳參數(shù)和電泳緩沖系統(tǒng)為：分離膠濃度為7.5%，pH 8.9；濃縮膠濃度為3%，pH 6.7；電極液為pH 8.3，濃度1%的Tris-Gly緩沖液，使用前稀釋10倍。加樣量為10 μL，采用10 mA電流預(yù)泳，待其指示劑過濃縮膠，電流調(diào)為20 mA，電泳時(shí)間為6 h。電泳的整個(gè)過程在10 ℃條件下進(jìn)行。

1.3 染色方法

電泳結(jié)束后，取出凝膠，放在染色液中在37 ℃條件下進(jìn)行染色，顯帶清晰后立刻用蒸餾水沖洗，然后拍照(Nikon4500)保存。染色液的配制為：1% NAD 3 mL、6%乳酸鈉2 mL、1% NBT 4.8 mL和1% PMS 0.4 mL。

1.4 分析方法

LDH同工酶以區(qū)帶數(shù)目、染色強(qiáng)度和相對(duì)遷移特性為指標(biāo)進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 異齒裂腹魚各組織LDH同工酶的表達(dá)

異齒裂腹魚的肌肉組織表達(dá)A4、A3B、A2B2和顯帶極弱的A14共4條酶帶；晶狀體、肝臟、心肌和腎臟組織均表達(dá)A4、A3B、A2B2、AB3和B4共5條酶帶(圖1)。

圖1 異齒裂腹魚各組織的LDH酶譜Fig.1 LDH enzyme spectrum of S.o’connoriE:晶狀體,L:肝臟,H:心肌,K:腎臟,M:肌肉,下圖同

2.2 雙須葉須魚各組織LDH同工酶的表達(dá)

雙須葉須魚LDH同工酶酶譜，除A4和A3B主帶間沒有副帶表達(dá)，各組織在每2條主帶間均有顯色深度弱于主帶的副帶表達(dá)。肌肉組織表達(dá)A4、A3B和A14共3條酶帶；晶狀體組織表達(dá)A4、A3B、A2B2、AB3、B2B12、BB13共6條酶帶；肝臟、心肌和腎臟組織表達(dá)A4、A3B、B2B12、A2B2、BB13、AB3、B14和B4共8條酶帶(圖2)。

圖2 雙須葉須魚各組織的LDH酶譜Fig.2 LDH enzyme spectrum of P.dipogon

2.3 拉薩裸裂尻魚各組織LDH同工酶的表達(dá)

拉薩裸裂尻魚各組織酶帶較纖細(xì)。肌肉組織表達(dá)A4、A3B、A2B2和A14共4條酶帶；晶狀體、肝臟、心肌和腎臟組織均表達(dá)A4、A3B、A2B2、A3B1、AB3、B4、B12A2、B1B3、B12B2、B13A、B13B和B14共12條酶帶(圖3-a)，其中，晶狀體組織不同個(gè)體間表達(dá)的酶帶數(shù)有差異(圖3-b)。

圖3 拉薩裸裂尻魚各組織的LDH酶譜Fig.3 LDH enzyme spectrum of S.younghusbandi

2.4 拉薩裂腹魚各組織LDH同工酶的表達(dá)

拉薩裂腹魚肌肉組織表達(dá)A4及A3A1、A2A12、AA13和A14共5條酶帶；心肌和腎臟組織表達(dá)A4、A3B、A2B2、AB3、A3A1、A2A12、AA13和A14B4共9條酶帶；晶狀體組織表達(dá)A4、A3B、A2B2、AB3和B4共5條酶帶；肝臟組織表達(dá)A4、A3B、A2B2、AB3和B4酶帶以及C基因表達(dá)的3條酶帶，靠近負(fù)極，共8條酶帶(圖4-a)，且不同個(gè)體間表達(dá)的酶帶數(shù)有差異(圖4-b)。

圖4 拉薩裂腹魚各組織的LDH酶譜Fig.4 LDH enzyme spectrum of S.waltoni

2.5 巨須裂腹魚各組織LDH同工酶的表達(dá)

巨須裂腹魚肌肉組織表達(dá)A4和A14 共2條酶帶；晶狀體組織表達(dá)A3B、A2B2、AB3和B4共4條酶帶，沒有A4酶帶；肝臟組織表達(dá)很弱的A4和A3B酶帶以及C基因表達(dá)的3條酶帶共5條酶帶；心肌和腎臟組織均表達(dá)A4、A3B、A2B2、AB3和B4共5條酶帶(圖5)。

2.6 尖裸鯉各組織LDH同工酶的表達(dá)

尖裸鯉各組織表達(dá)的酶帶纖細(xì)。肌肉組織表達(dá)A4、A3B、A2B2、AB3、B4、和A14共6條酶帶；晶狀體、肝臟、心肌和腎臟組織表達(dá)A4、A3B、A2B2、A3B1、AB3、B4、B12A2、B1B3、B12B2、B13A、B13B和B14共12條酶帶(圖6-a)，其中，心肌組織除上述酶帶外，還表達(dá)了A14、AA13、A2A12和A3A1酶帶，共16條酶帶(圖6-b)。

圖6 尖裸鯉各組織的LDH酶譜Fig.6 LDH enzyme spectrum of O.stewartii

3 討論

3.1 裂腹魚LDH同工酶組織差異性分析

LDH是研究最為廣泛和深入的同工酶，在魚類中多有LDH-A、LDH-B和LDH-C基因編碼，LDH-A和LDH-B基因可隨機(jī)形成5種同工酶，分別是A4、A3B、A2B2、AB3和B4，LDH-B基因編碼的蛋白遷移率速率大于LDH-A基因編碼的蛋白[9]。LDH-C基因在魚類中多具有組織特異性，一般不與LDH-A和LDH-B基因雜合，鯉形目魚類中多為肝臟組織所特有，電泳時(shí)多趨向于陰極[10]。本研究中，LDH-A和LDH-B基因在各組織中均有表達(dá)，LDH-C基因僅在巨須裂腹魚和拉薩裂腹魚肝臟組織中特異表達(dá)，可能與其肝臟代謝旺盛密切相關(guān)[9]；其他4種裂腹魚中未見LDH-C基因的表達(dá)，可能是這幾種裂腹魚沒有LDH-C基因的存在或該基因處于失活狀態(tài)[11]。

表1 LDH同工酶在6種裂腹魚5種組織中的分布和活性比較Tab.1 Distribution and activity of LDH isozyme in 5 tisues of 6 species of Schizothoracinae

續(xù)表

注：“*”表示活性,越多表示活性越強(qiáng);“-”表示無(wú)

表2 LDH同工酶在各組織中表達(dá)的帶數(shù)Tab.2 Number of LDH isozyme band expressed invarious organizations

LDH同工酶是催化乳酸脫氫生成丙酮酸的酶，在有氧氧化和無(wú)氧酵解之間起著重要作用，幾乎存在于所有組織的一種糖酵解酶，LDH-A基因表達(dá)的酶類多在厭氧組織骨骼肌中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，其功能是將丙酮酸還原為乳酸；LDH-B基因表達(dá)的同工酶多在含氧組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，其功能是將乳酸氧化為丙酮酸[11]。6種裂腹魚肌肉組織中A4酶帶占明顯優(yōu)勢(shì)，這可能是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，參與無(wú)氧代謝，為其適應(yīng)高原冷水環(huán)境肌肉的快速反應(yīng)提供能量保證；B4酶帶在心肌、肝臟和腎臟組織中占明顯優(yōu)勢(shì)，LDH-B基因編碼的酶類活性也是最高的，這是代謝功能旺盛的好氧性組織有氧代謝的必要條件[12]。

經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尖裸鯉和雙須葉須魚晶狀體組織LDH同工酶酶帶較多且電泳圖譜不穩(wěn)定，可能是組織制備及保存等問題造成的；拉薩裸裂尻魚晶狀體組織和拉薩裂腹魚肝臟組織，不同個(gè)體間表達(dá)的酶帶數(shù)有明顯的差異，可能是酶的編碼基因因活性表現(xiàn)程度不同或基因表達(dá)后由于酶受到不同因子的調(diào)控造成的；巨須裂腹魚晶狀體組織中沒有A4酶帶的表達(dá)，可能是由于酶的編碼基因不是同時(shí)表達(dá)，而造成酶帶數(shù)量不同造成的[13]。6種裂腹魚肌肉組織、尖裸鯉的心肌與拉薩裂腹魚的心肌和腎臟組織LDH-A基因位點(diǎn)所編碼的酶帶數(shù)個(gè)體間均有差異，且靠近陰極，說明LDH-A基因位點(diǎn)在不同個(gè)體中有變異，存在多態(tài)性[14]。

裂腹魚類LDH同工酶的組織差異性，是機(jī)體在特定環(huán)境下適應(yīng)高原氣候寒冷多變的生態(tài)環(huán)境及組織分化并特異性執(zhí)行各自功能的結(jié)果。

3.2 裂腹魚LDH同工酶種間差異性分析

同工酶本質(zhì)上是基因的產(chǎn)物，同工酶譜的不同反映著基因型的不同，同工酶結(jié)構(gòu)的變化是由同工酶基因變異所導(dǎo)致的[6]。本研究顯示，不同裂腹魚的同工酶譜有所不同，這種差異稱之為同工酶的種屬差異性。一般認(rèn)為酶譜越相似，說明亞基中氨基酸組成也相似，進(jìn)而可推測(cè)其親緣關(guān)系相近程度[15]。通過對(duì)6種裂腹魚5種組織的LDH酶譜比較(表1)發(fā)現(xiàn)，本研究中的6種裂腹魚可分為2個(gè)類群，尖裸鯉、拉薩裸裂尻魚和雙須葉須魚為一類；拉薩裂腹魚、異齒裂腹魚和巨須裂腹魚為一類。除肌肉組織外，心肌、肝臟、腎臟和晶狀體4種組織中，尖裸鯉和拉薩裸裂尻魚的譜帶最相似，共有12條酶帶；其次是與雙須葉須魚心肌、肝臟和腎臟組織共有8條酶帶，晶狀體組織共有6條酶帶，且共有的酶帶多在LDH-B和LDH-B1基因位點(diǎn)處，說明三者中尖裸鯉和拉薩裸裂尻魚的親緣關(guān)系最近。拉薩裂腹魚和異齒裂腹魚譜帶最相似，共有5條酶帶；其次是與巨須裂腹魚心肌、肝臟和腎臟組織共有5條酶帶，晶狀體組織共有4條酶帶，且共有的酶帶多在LDH-B基因位點(diǎn)處，說明三者中拉薩裂腹魚和異齒裂腹魚親緣關(guān)系較近。從6種裂腹魚同工酶的表達(dá)特征上發(fā)現(xiàn)，具有明顯種間差異性，在生化水平上已有分化，物種形態(tài)上也有所表現(xiàn)，可作為裂腹魚類分類指標(biāo)之一。

3.3 LDH同工酶在不同裂腹魚中的表達(dá)與生物演化的探討

本研究的6種裂腹魚中，尖裸鯉、拉薩裸裂尻魚和雙須葉須魚的酶帶數(shù)顯著多于5條(表2)，這與其他裂腹魚類研究相一致[16-20]。通常，二倍體魚類中，LDH同工酶由LDH-A、LDH-B基因編碼的A、B亞基構(gòu)成的5條酶帶[11]，但在多倍體中重復(fù)基因(duplicate gene)的存在和表達(dá)、某些位點(diǎn)存在共顯性的等位基因(allele gene)或是翻譯后化學(xué)飾變，共同點(diǎn)是以多條亞帶形式出現(xiàn)等情況下，會(huì)多于5條帶；若存在共顯性等位基因，則群體中會(huì)出現(xiàn)多態(tài)性[11,18，21-22]。6種裂腹魚中，除雙須葉須魚染色體數(shù)2n在400～440之間，高于四倍體外，其他5種裂腹魚類均為四倍體[22，23]。因此，本研究中尖裸鯉、拉薩裸裂尻魚和雙須葉須魚的酶譜多于5條酶帶是重復(fù)基因的表達(dá)。

重復(fù)基因事件發(fā)生后，重復(fù)基因一般會(huì)經(jīng)歷3個(gè)過程：(1)假基因化，即失去功能的重復(fù)拷貝；(2)亞功能化，即重復(fù)基因通過降解和功能分化使每個(gè)拷貝僅保留部分祖先功能，只有當(dāng)兩個(gè)拷貝都存在的情況下才能很好地履行祖先基因的功能；(3)新功能化，即獲得適應(yīng)環(huán)境的正向選擇作用，與祖先基因功能不同的新基因，起初都是以多態(tài)的形式在個(gè)體中出現(xiàn)，隨后沉積于整個(gè)群體[24]。Gracia等[25]認(rèn)為，同工酶酶帶數(shù)越多的種分化程度越高，是較進(jìn)化種，同工酶酶帶數(shù)越少的種分化程度越低，是較原始種。通過對(duì)6種裂腹魚的LDH酶譜比較發(fā)現(xiàn)，尖裸鯉、拉薩裸裂尻魚和雙須葉須魚中存在重復(fù)基因LDH-B1，不同的是雙須葉須魚以2條主帶間出現(xiàn)一條副帶的形式出現(xiàn)，酶帶數(shù)上尖裸鯉和拉薩裸裂尻魚最高，說明尖裸鯉和拉薩裸裂尻魚可能處于重復(fù)基因的亞功能化時(shí)期，分化程度較高，而雙須葉須魚的分化程度低于尖裸鯉和拉薩裸裂尻魚；異齒裂腹魚、拉薩裂腹魚和巨須裂腹魚中沒有重復(fù)基因的表達(dá)，酶帶數(shù)也較少，可能處于重復(fù)基因的假基因化時(shí)期，分化程度較低，比較原始。

裂腹魚屬為原始等級(jí)類群，葉須魚屬為特化等級(jí)類群，尖裸鯉屬和裸裂尻魚屬為高度特化等級(jí)類群[26]，LDH同工酶的演化特點(diǎn)與根據(jù)形態(tài)學(xué)特征所劃分的三個(gè)類群極為相似。這也說明生物的演化不僅只是表現(xiàn)在形態(tài)上，還表現(xiàn)在分子水平上。

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AcomparativestudyonlactatedehydrogenaseisozymesinsixspeciesofSchizothoracinae

WEI Yu-zhong1，ZHANG Gui-rong2，HUO Bin2，XIE Cong-xin2，CHEN Sheng-ao1,2

(1.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,843300Xinjiang,China；2.CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

2016-07-31；

2017-07-10

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203086)

魏玉眾(1992- )，男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)轸~類生物化學(xué)。E-mail：weiyuzhongtarim@163.com

陳生熬。E-mail：shengaochen@163.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)05-0003-06