蒙藥檳榔十三味丸(高尤-13)對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠肝腎毒性的影響

佟海英，范盎然，李 婧，烏吉斯古冷，張 月，張少乾，于 雪，呼日樂巴根，陳潮光

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 100029；2 北京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029；3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 蒙醫(yī)藥學(xué)院，呼和浩特 010110；4 內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，呼和浩特 010020)

蒙藥檳榔十三味丸(高尤-13)對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠肝腎毒性的影響

佟海英1，范盎然2，李 婧3，烏吉斯古冷4，張 月2，張少乾2，于 雪2，呼日樂巴根3，陳潮光2

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 100029；2 北京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029；3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 蒙醫(yī)藥學(xué)院，呼和浩特 010110；4 內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，呼和浩特 010020)

為觀察檳榔十三味丸(高尤-13)對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠肝腎毒性的影響，隨機(jī)將48只Wistar雄性大鼠根據(jù)蔗糖水消耗量分為6組：檳榔十三味丸低、中、高劑量組(0.25，0.5，1.0 g·kg-1)，氟西汀組(3.3 mg·kg-1)，模型組和正常對照組，每組8只. 除正常對照組外，其余大鼠均采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)方法制備抑郁模型，造模同時灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥28 d后，檢測大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)含量，HE染色法觀察肝腎組織形態(tài)學(xué)變化.結(jié)果顯示：模型組大鼠較正常對照組血清ALT含量顯著升高(P<0.01)，肝細(xì)胞輕度腫脹、變性，肝竇縮窄，細(xì)胞界限不清(P<0.05).檳榔十三味丸低、中、高劑量組較模型組血清ALT含量顯著降低(P<0.01或P<0.05),給藥各組與氟西汀組大鼠的肝臟未見與藥物相關(guān)的毒性病變(P>0.05).各組大鼠血清AST、UREA、CREA含量無顯著差異，腎臟病理變化不顯著(P>0.05).說明檳榔十三味丸對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠無肝腎毒性，并具有肝損傷修復(fù)作用.

檳榔十三味丸；抑郁癥；肝腎功能；肝腎病理變化

AbstractIn order to observe the effects of Betel Shisanwei ingredients pill (Gao-You-13) on the liver and kidney toxicity of chronic stress depression model rats,48 male Wistar rats were randomly divided into six groups according to the sugar consumption test (8 rats in each group): low，medium and high dose group (0.25,0.5,1.0 g·kg-1) of Gao-You-13 group,fluoxetine group (3.3 mg·kg-1),model group and normal control. Each group was treated with the chronic unpredictable mild stress stimulation under separation except the normal control group. Meanwhile,the rats were given the drugs once daily for 28 days. Then the contents of ALT,AST,UREA and CREA in rats′ serum were tested. The liver and kidney tissue morphological changes were observed by HE staining. The results showed that compared with the normal control,ALT levels in model group increased significantly (P<0.01) and most liver cells appeared mild swelling and degeneration,hepatic sinus narrowed,cell boundaries were unclear(P<0.05); while ALT levels in Gao-You-13 group decreased significantly compared with the model group (P<0.01 orP<0.05). Drug related toxicity lesions did not appear in Gao-You-13 and fluoxetine treatment group (P>0.05). AST,UREA,CREA contents and kidney pathological changes did not show significant differences in each group (P>0.05). It was confirmed that Gao-You-13 could repair liver damages without liver and kidney toxicity for the chronic stress depression model rats.

KeywordsBetel Shisanwei ingredients pill; depression; hepatorenal function; liver and kidney pathological changes

檳榔十三味丸(高尤-13)源自19世紀(jì)蒙醫(yī)方劑學(xué)經(jīng)典著作《蒙醫(yī)金匱》(又名方海)，由檳榔、肉豆蔻、沉香、當(dāng)歸、木香、草烏(制)、蓽茇、紫硇砂、葶藶子、丁香、廣棗、干姜、胡椒等13味藥組成[1].本方能夠調(diào)節(jié)赫依、安神止痛，用于心悸、失眠、精神失常、游走刺痛等癥[2].目前臨床常用檳榔十三味丸治療抑郁癥，療效甚佳[3].本課題組發(fā)現(xiàn)該方在小鼠強(qiáng)迫游泳、懸尾、利血平拮抗抑郁模型實(shí)驗(yàn)中，具有確切的抗抑郁作用[4].檳榔十三味丸對慢性應(yīng)激致抑郁模型大鼠行為學(xué)、海馬和額葉皮層5-HT、NE、DA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，以及下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)和AC-cAMP-PKA信號通路也具有顯著的改善作用[5-7].通過上述研究，明確了該方治療抑郁癥的確切療效以及部分機(jī)制.但檳榔十三味丸中含有毒性藥材草烏(制)以及礦物藥紫硇砂，在臨床長期應(yīng)用后是否產(chǎn)生肝腎毒性等尚不清楚.故本文觀察了檳榔十三味丸對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠肝腎功能以及肝腎組織形態(tài)學(xué)的影響，初步探討該方的肝腎毒性，為臨床長期安全用藥提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1材料和儀器

檳榔十三味丸[檳榔60 g，沉香120 g，肉豆蔻60 g，丁香48 g，木香36 g，廣棗60 g，草烏(制)60 g，干姜42 g，蓽撥42 g，胡椒42 g，紫硇砂30 g，當(dāng)歸60 g，葶藶子60 g，內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司,批號120805，國藥準(zhǔn)字Z15020412]；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑，批號20120330)；鹽酸氟西汀分散片(Patheon France，批號2076A)；蔗糖(北京化工廠，批號20110303).肌酐(CREA)測定試劑盒、尿素(UREA)測定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(中生北控生物科技).

48只180～200 g清潔級Wistar雄性大鼠[北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2011-0004]，SPF級動物房飼養(yǎng)，室溫20～22 ℃(除冷熱刺激)自由攝食和飲水(除造模過程中禁食禁水)，60%～70%相對濕度.12 h光照周期，7∶00～19∶00光照，19∶00～7∶00黑暗(晝夜顛倒刺激除外).

半自動生化分析儀(Microlab300，荷蘭威圖科學(xué)公司)，1/10萬電子天平(ES125SM，瑞士precisa)，電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)，離心機(jī)(Sigma公司).

1.2分組和給藥

Wistar雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后禁水24 h，給予1%蔗糖水，測1 h內(nèi)的消耗量，依據(jù)蔗糖水消耗量隨機(jī)分為6組：檳榔十三味丸低、中、高劑量(0.25,0.5,1.0 g·kg-1·d-1)組、氟西汀組(3.3 mg·kg-1·d-1)、模型組和正常對照組(灌胃0.5% CMC-Na)，每組8只.除正常對照組每籠4只外其他各組孤養(yǎng)，按10 mL·kg-1連續(xù)給藥28 d.

1.3制備模型

參照文獻(xiàn)[8-10]并改良建立慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)模型，除正常對照組外各組大鼠共接受刺激28 d，包括禁食禁水24 h，晝夜顛倒24 h，4 ℃冰水游泳5 min ，45 ℃熱環(huán)境5 min，夾尾1 min，電擊足底(電壓36 V，1 min刺激1次，每次10 s，共30次).

1.4肝腎功能檢測

禁食禁水24 h后處死大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血8～10 mL，室溫下放置1 h后，4℃ 3000 r·min-1離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明書測定血清ALT、AST、UREA和CREA含量.

1.5肝腎組織形態(tài)學(xué)

取大鼠同一部位肝組織和同側(cè)的腎組織，福爾馬林固定后用石蠟包埋，切片4 μm再HE染色，光鏡下觀察肝腎組織病理變化.

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)，單因素方差分析法進(jìn)行組間比較，非參數(shù)秩和檢驗(yàn)比較肝腎組織形態(tài)學(xué)檢測組間差異，P<0.05有顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1檳榔十三味丸對大鼠肝腎功能的影響

檳榔十三味丸對大鼠肝腎功能的影響結(jié)果見表1.由表1可知：應(yīng)激處理后第28 d，模型組大鼠血清ALT含量較正常組顯著升高(P<0.01)；檳榔十三味丸低、中、高劑量組血清ALT含量較模型組顯著降低(P<0.01和P<0.05)；各組大鼠血清AST、CREA、UREA含量無顯著差異(P>0.05).

表1 檳榔十三味丸對大鼠肝腎功能相關(guān)生化指標(biāo)變化的影響

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.2檳榔十三味丸對大鼠肝腎組織形態(tài)學(xué)的影響

檳榔十三味丸對大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響結(jié)果見圖1.由圖1可見，正常對照組除個別動物(4號動物)匯管區(qū)多發(fā)灶狀炎癥細(xì)胞浸潤外，均未見肝細(xì)胞腫脹、變性和壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈放射狀圍繞中央靜脈排列，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)正常；模型組大部分動物(7/8只)的肝細(xì)胞輕度腫脹、變性，肝竇縮窄，細(xì)胞界限不清，個別動物(1/8只)肝組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病變，較正常組有顯著性差異(P=0.019<0.05)；氟西汀以及檳榔十三味丸給藥各組的肝臟未見與藥物相關(guān)的毒性病變(P>0.05).

a) 正常對照組; b) 模型組; c) 氟西汀組; d～f) 檳榔十三味丸低、中、高劑量組圖1 各組大鼠肝臟組織病理結(jié)果(HE×200)Fig.1 Pathological results of rat liver tissue in each group (HE×200)

檳榔十三味丸對大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響結(jié)果見圖2.由圖2可見，正常對照組動物腎小球和腎小管未見明顯病變，組織結(jié)構(gòu)正常；模型組動物除個別動物(8號動物)腎間質(zhì)灶狀炎癥細(xì)胞浸潤外，其余動物腎小球、腎小管未見明顯病變，組織結(jié)構(gòu)正常(P>0.05)；氟西汀以及檳榔十三味丸給藥各組的腎組織未見明顯病變(P>0.05).

a) 正常對照組; b) 模型組; c) 氟西汀組; d～f) 檳榔十三味丸低、中、高劑量組圖2 各組大鼠腎臟組織病理結(jié)果(HE×200)Fig.2 Pathological results of rat renal tissue in each group (HE×200)

3 討論

目前廣泛應(yīng)用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)建立大鼠抑郁模型，研究抑郁癥發(fā)病機(jī)制和抗抑郁藥物作用機(jī)制[11].文中實(shí)驗(yàn)大鼠通過敞箱、蔗糖水消耗等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，基本模擬了抑郁癥的臨床表現(xiàn)，造模成功，給予藥物檳榔十三味丸和氟西汀治療有效地改善了其抑郁癥狀[12].本文重點(diǎn)關(guān)注該方的肝腎毒性，以ALT、AST、UREA、CREA 4個反映肝腎功能的生化指標(biāo)為毒性評價指標(biāo)，并結(jié)合組織形態(tài)學(xué)觀察.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組大鼠血清ALT含量較正常組顯著升高，給予檳榔十三味丸后，各劑量組ALT較模型組顯著降低，其余指標(biāo)無顯著差異.

ALT、AST是臨床上常用來反映肝功能的酶學(xué)指標(biāo)，是檢測肝功能受損的首選指標(biāo).ALT主要存在于肝細(xì)胞漿，1%的肝細(xì)胞壞死能使血清中ALT活力增加1倍[13].AST在肝細(xì)胞漿內(nèi)僅占20%，其余80%存在于線粒體中，當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重病變、壞死時，線粒體內(nèi)AST便釋放出來[14].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠血清中ALT的含量顯著升高，同時肝組織形態(tài)學(xué)顯示，其大部分動物(7/8只)的肝細(xì)胞輕度腫脹、變性，肝竇縮窄，細(xì)胞界限不清.因此CUMS結(jié)合孤養(yǎng)誘導(dǎo)的抑郁模型能損害大鼠的肝臟功能，在28 d模型中，尤其對ALT的影響更顯著.王國力等[15]經(jīng)CUMS造模28 d后，大鼠血清ALT、AST含量顯著升高，肝組織切片HE染色顯示，大鼠中央靜脈擴(kuò)張，肝細(xì)胞中度水腫，肝細(xì)胞體積明顯增大，局部胞漿內(nèi)可見凋亡細(xì)胞，肝血竇受壓明顯變窄，匯管區(qū)血管擴(kuò)張明顯，中等量炎細(xì)胞浸潤，纖維組織増生.本實(shí)驗(yàn)中，僅ALT顯著升高，AST和肝組織病理學(xué)變化不顯著，由于AST在肝臟發(fā)生嚴(yán)重破壞或壞死時會顯著升高，故本結(jié)果的不同與大鼠種類、造模方法、刺激強(qiáng)度、檢測方法等有關(guān).經(jīng)檳榔十三味丸干預(yù)后，ALT含量下降，組織形態(tài)學(xué)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了其對肝功能的修復(fù)作用，與本方中肉豆蔻[16]、當(dāng)歸[17]、蓽茇[18]、干姜[19]、胡椒[20]等的保肝作用以及木香[21]的利膽作用有關(guān)，充分體現(xiàn)了經(jīng)典名方安全有效的合理性，值得深入研究.陽性藥氟西汀對大鼠的肝功能未產(chǎn)生顯著影響.

CREA和UREA是常用的腎功能評價指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CUMS結(jié)合孤養(yǎng)誘導(dǎo)的抑郁模型對大鼠腎功能無顯著影響，模型組動物除個別動物腎間質(zhì)灶狀炎癥細(xì)胞浸潤外，其余動物腎小球、腎小管未見明顯病變，組織結(jié)構(gòu)正常.經(jīng)檳榔十三味丸干預(yù)后，大鼠腎功能和組織形態(tài)學(xué)未見顯著變化.說明檳榔十三味丸對抑郁模型大鼠腎功能無顯著的毒性作用.

綜上，大鼠經(jīng)CUMS結(jié)合孤養(yǎng)建立抑郁模型后，大鼠血清ALT含量顯著升高，肝細(xì)胞輕度腫脹、變性，肝竇縮窄，細(xì)胞界限不清.檳榔十三味丸能降低ALT的升高，對腎臟無顯著影響，亦無肝腎毒性，并具有肝損傷修復(fù)作用，故為該復(fù)方的臨床長期安全應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

[1] 占布拉卻吉丹森普日勒.蒙醫(yī)金匱(蒙文版)[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，1977：6.

[2] 內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳.內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)[S].赤峰：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社，1984：354-355.

[3] 薩仁圖雅，孟 根，烏仁其木格.蒙西醫(yī)結(jié)合診治精神疾病[J].中國蒙醫(yī)藥，2006，2(4)：49-54.

[4] 佟海英，王大偉，王 斌，等.檳榔十三味丸對小鼠抗抑郁作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2011，17(2)：49-52.

[5] 佟海英，烏吉斯古冷，白亮鳳，等.蒙藥檳榔十三味丸(高尤-13)對抑郁模型大鼠神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(9)：194-198.

[6] 佟海英，蓮 花，高玉峰，等.檳榔十三味丸對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)及下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響觀察[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2012，31(1)：42-46.

[7] 佟海英，烏吉斯古冷，白亮鳳，等.檳榔十三味丸對抑郁模型大鼠海馬和前額葉皮層AC-cAMP-PKA信號通路的影響[J].中國中藥雜志，2014，39(10)：1946-1949.

[8] Kaye J,Morton J,Bowcutt M,et al. Stress,depression and psychoneuroimmunology[J]. J Neurosci Nurs,2000,32(2):93-100.

[9] 王建醒，周 麗，徐華鋒，等.慢性應(yīng)激大鼠抑郁模型的建立及其評價[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，27(6)：644-646.

[10] Willner P. Validity,reliability and utility of the chronic mild stre-ss model of depression: a 10-year review and evaluation[J]. Psychopharmacology,1997,134(4):319-329.

[11] Mao Q Q,Xian Y F,Ip SP,et al. Long-term treatment with peony glycosides reverses chronic unpredictable mild stress-induced depressive-like behavior via increasing expression of neurotrophins in rat brain.[J].Bahav Brain Res,2010,210(2):171-177.

[12] 烏吉斯古冷，佟海英，斯日古楞，等.蒙藥檳榔十三味丸(高尤-13)對慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為學(xué)及海馬神經(jīng)元凋亡的影響實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)學(xué)報，2014，29(193)：759-762.

[13] 俸家富，涂植光.肝功能相關(guān)的血清酶學(xué)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(3)：225-230.

[14] 孫志強(qiáng)，毛遠(yuǎn)麗.肝病酶學(xué)指標(biāo)及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28(6)：659-663.

[15] 王國力.慢性應(yīng)激誘發(fā)抑郁大鼠肝實(shí)質(zhì)損傷機(jī)制及疏肝中藥的保護(hù)作用[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2016:32-34.

[16] 李德智，昌友權(quán)，昌喜濤，等．肉豆蔻乙醇提取物對D-氨基半乳糖中毒大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].吉林工程技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(工程技術(shù)版)，2003，19(6)：41-45.

[17] 李 青，鄧長生，朱尤慶，等.當(dāng)歸注射液對實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的防治作用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2000，19(2)：110.

[18] 昭日格圖，白朝魯門，博格日勒圖，等.蓽茇寧對小鼠酒精性脂肪肝的預(yù)防作用[J].食品科學(xué)，2014，35(13)：232-235.

[19] 張竹心，劉連生，王貴林.生姜油對肝損害的保護(hù)作用[J].中成藥，1989,11(8)：25-26.

[20] Koul I B,Kapil A.Evaluation of the liver protective potential of piperine,an active principle of black and long peppers[J].Planta Med,1993,59(5):413-417.

[21] 邵 蕓，黃 芳，王 強(qiáng)，等.木香醇提取物的抗炎利膽作用[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2005，13(4)：5-6.

EffectofMongolianBetelShisanweiIngredientsPill(Gao-You-13)onLiverandKidneyToxicityofChronicStressDepressionModelRats

TongHaiying1,FanAngran2,LiJing3,Wujisiguleng4,ZhangYue2,ZhangShaoqian2,YuXue2,Hurilebagen3,ChenChaoguang2

(1 Institute of Ethnic Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2 School of Basic Medical Science,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;3 College of Mongolian Medicine and Pharmacy,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010110,China;4 Inner Mongolia International Mongolian Medicine Hospital,Hohhot 010020,China)

Q956; R965.3

A

1672-4321(2017)03-0057-04

2016-12-20

佟海英(1976-)，女，主任醫(yī)師，副研究員，博士，研究方向：蒙藥基本理論與臨床應(yīng)用，E-mail：haiyingtong@sohu.com

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202998)