西番蓮果皮中果膠的復(fù)合酶法提取工藝研究

, ,*,,妙云

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2.潮州市正一品生物科技有限公司,廣東潮州 521000)

西番蓮果皮中果膠的復(fù)合酶法提取工藝研究

劉運(yùn)花1,黃葦1,*,郭美媛2,黃妙云2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州510642;2.潮州市正一品生物科技有限公司,廣東潮州521000)

實(shí)驗(yàn)以西番蓮果皮為原料,以酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶濃度與液料比為單因素,分別研究了四種酶(纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶)對(duì)西番蓮果皮中果膠提取的影響,并確定將纖維素酶、半纖維素酶與木質(zhì)素酶三者進(jìn)行復(fù)配,然后以酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度和液料比為因子進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn),以優(yōu)化復(fù)合酶酶解工藝,最后通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),確定了復(fù)合酶的添加量。實(shí)驗(yàn)優(yōu)選得復(fù)合酶最適配比和最適酶解提取條件為:將纖維素酶0.8 g/100 g、半纖維素酶1.2 g/100 g、木質(zhì)素酶0.2 g/100 g進(jìn)行復(fù)配,液料比為6∶1 mL/g,pH為4,提取溫度40 ℃,提取3.5 h,此時(shí)西番蓮果皮的果膠提取得率可以達(dá)到2.63%±0.021%。

西番蓮,果膠,酶,提取

Abstract:Passionflower peel was used as raw materials in the reseach.With enzyme solution pH,hydrolysis time,hydrolysis temperature,enzyme concentration and ratio of liquid to material as single factors,the effects of four kinds of enzyme(cellulase,hemicellulase and lignin enzymes,amylase)on pectin extraction from the passionflower peel were studied. And the enzyme combination consists cellulose,hemicellulase and lignin enzymes were determined. Through L9(34)orthogonal experiment and response surface test,the enzymatic hydrolysis and enzyme concentration were optimized. the optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows:cellulose enzymes 0.8 g/100 g,hemicellulase 1.2 g/100 g,and lignin 0.2 g/100 g,ratio of liquid to material(mL/g)6∶1,pH value 4,extraction lasts for 3.5 h under the temperature of 40 ℃,the pectin gain rate can reach 2.63%±0.021%.

Keywords:Passionflower;pectin;enzyme;extraction

果膠(pectin)是以D-吡喃半乳糖醛酸為基本單位,由α-1,4-糖苷鍵鏈接而成的聚合高分子親水性膠狀雜多糖,其結(jié)構(gòu)中還含有部分中性糖,如木糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖等以及少量非糖成分[1],如甲醇、乙酸、阿魏酸。果膠具有穩(wěn)定、凝膠、增稠、乳化等作用,被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[2];果膠還具有殺菌、止血、解毒、抗輻射等功能,可作為一種天然的藥物制劑[3],在醫(yī)學(xué)工業(yè)上也廣有應(yīng)用[4];此外,果膠優(yōu)良的成膜性能也被應(yīng)用到了制膜工業(yè)[5]和日用品工業(yè)中[6]。果膠的安全性與利用價(jià)值促成果膠資源的開發(fā)成為近年來的研究熱點(diǎn)[7]。

果膠在高等植物的根、莖、葉、果中廣泛存在,如柑橘、檸檬、柚子等果皮中約含30%果膠,是果膠的豐富來源,其中西番蓮果皮作為一種新型果膠資源,有待進(jìn)一步開發(fā)[8-9]。西番蓮果皮果膠含量豐富,果皮重占整個(gè)果實(shí)鮮重的53%～71%[10],加工過程中,果皮常以廢物的形式被丟棄,既浪費(fèi)了資源又增加了排污成本[11]。鄭榮珍等[12]探究了酸法提取紫果西番蓮果皮中果膠的提取工藝,其鮮皮提取得率達(dá)到了2.5%、干皮提取得率可達(dá)12.0%。酸法、草酸銨逆流法[13]等果膠提取工藝常常導(dǎo)致工業(yè)污染,且提取得率較低,而離子交換法[14]、微波法[15]等溫和型提取方法對(duì)工藝操作與設(shè)備要求高,相比而言生物酶法具有設(shè)備成本低、綠色環(huán)保[16]的優(yōu)點(diǎn)。蘇東林[17-18]等以酶法提取橘皮果膠,不僅提高了果膠提取得率,且由于提取條件更溫和,得到的果膠性質(zhì)也明顯高于酸法。

表2 酶濃度的單因素實(shí)驗(yàn)參數(shù)Table 2 Parameters for enzyme concentration single factor experiment

本研究以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),結(jié)合正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)探究西番蓮果皮中果膠的酶法的提取工藝,并以響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)[19]確定復(fù)合酶添加比例,以得出一種溫和高效的西番蓮果皮果膠提取方法,為進(jìn)一步開發(fā)果膠資源充分利用西番蓮果皮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紫果西番蓮 產(chǎn)自廣西榮棠;纖維素酶(酶活20萬U/g) 上海博奧生物科技有限公司;半纖維素酶酶(酶活20 U/g) 河南銳陽(yáng)生物科技有限公司;木質(zhì)素酶(酶活40萬U/g) 河南盛泰源化工廠;淀粉酶(酶活3700 U/g) 廣州齊云生物技術(shù)有限公司;無水乙醇(Ar) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

12-ND型冷凍干燥機(jī) 購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司;pHS-3C 型數(shù)顯pH計(jì) 購(gòu)自上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司;TU-1800紫外可見分光光度計(jì) 購(gòu)自北京普析通用儀器有限公司;RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海錦華層析設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程 果皮→滅酶(沸水浴處理5 min)→破碎加酶→酶解→滅酶(沸水浴處理10 min)→膠渣分離(真空泵抽濾)→濾液(果膠提取液)→無水乙醇沉淀→過濾、脫色、烘干→粉碎→果膠

1.2.2 果膠的測(cè)定 采用硫酸咔唑分光光度法[20]。

1.2.2.1 果膠標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg,溶解于水中,加入0.5 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液,定容至100 mL,混勻移取上述原液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL,分別注入100 mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度。分別取各濃度稀釋液進(jìn)行比色測(cè)定并繪制曲線,即取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液于25 mL比色管,加入0.5 mL 0.1%的咔唑-乙醇溶液,搖勻后立刻加入濃硫酸溶液6 mL,于85 ℃水浴反應(yīng)5 min后冷卻至室溫,立刻用分光光度計(jì)在525 nm波長(zhǎng)處用1 cm比色皿測(cè)量吸光值,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0067x+0.0295(R2=0.9997),其中y為吸光值;x為果膠含量(μg/mL)。

1.2.2.2 樣品果膠的測(cè)定 取果膠提取液25 mL,加25 mL水,活性炭1 g/100 mL,60 ℃攪拌15 min,抽濾,取1 mL樣液加入0.5 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液水解消化2 h以上,定容至250 mL,得到提取樣品稀釋液。取1 mL樣品稀釋液進(jìn)行比色測(cè)定。

1.2.3 西番蓮果皮果膠的酶提取工藝

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 pH對(duì)果膠提取得率的影響 酶的添加量(g/100 g)以果皮重量(100 g)計(jì)(下文同),按照表1所示的參數(shù)設(shè)計(jì)pH的單因素實(shí)驗(yàn)。

表1 pH單因素實(shí)驗(yàn)參數(shù)Table 1 Parameters for pH single factor experiment

1.2.4.2 酶濃度對(duì)果膠提取得率的影響 按照表2所示的參數(shù)條件設(shè)計(jì)酶濃度的單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.3 溫度對(duì)果膠提取得率的影響 按照表3所示的參數(shù)條件設(shè)計(jì)酶解溫度的單因素實(shí)驗(yàn)。

表3 酶解溫度的單因素實(shí)驗(yàn)參數(shù)Table 3 Parameters for temperature single factor experiment

1.2.4.4 時(shí)間對(duì)果膠提取得率的影響 按照表4所示的參數(shù)條件設(shè)計(jì)酶解時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)。

表4 酶解時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)參數(shù)Table 4 Parameters for temperature single factor experiment

1.2.4.5 液料比對(duì)果膠提取得率的影響 按照表5所示的參數(shù)條件設(shè)計(jì)酶解溫度的單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 復(fù)合酶酶解條件的正交優(yōu)化 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取纖維素酶0.4 g/100 g、半纖維素酶0.6 g/100 g、木質(zhì)素酶0.1 g/100 g復(fù)合添加進(jìn)行酶解,以液料比、提取時(shí)間、pH、溫度為因子,提取得率為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),因素水平見表6。

表5 液料比單因素實(shí)驗(yàn)參數(shù)Table 5 Parameters for liquid ratio single factor experiment

表6 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 6 Independent variables and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.6 復(fù)合酶添加比例的響應(yīng)面優(yōu)化 以纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶三種的酶濃度為因子,提取得率為指標(biāo)設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),因素水平見表7。

表7 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 7 Independent variables and levels of Box-Behnken experiment

1.2.7 果膠提取得率的計(jì)算 公式如下:

其中:A-吸光值,12500-稀釋倍數(shù),M-果皮重量(g)；0.0295、0.0067分別為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距和斜率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),以O(shè)rigin、Design-expert、SPSS處理分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 pH對(duì)果膠提取得率的影響 從圖1可以看到,不同pH對(duì)四種酶提取果膠的提取得率均有影響。其中淀粉酶較為敏感,在pH為4時(shí)提取得率較高,之后隨著pH增大呈急劇下降趨勢(shì)。纖維素酶與半纖維素酶均在pH6處提取得率較高。木質(zhì)素酶的提取能力與pH呈拋物線關(guān)系,并在pH4處表現(xiàn)較好。由此得出纖維素酶與半纖維素酶的較適提取pH為6,木質(zhì)素酶與淀粉酶的較適pH為4。

圖1 pH對(duì)各單一酶提取果膠能力的影響Fig.1 Effect of pH on extraction of pectin by single enzyme

2.1.2 酶濃度對(duì)果膠提取得率的影響 由圖2知,酶濃度對(duì)四種酶的果膠提取得率均有影響,果膠提取得率隨著酶的添加量增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。在供試濃度水平下,酶濃度對(duì)淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶的果膠提取得率影響較大,木質(zhì)素酶作用受酶濃度影響較小。纖維素酶提取西番蓮果皮果膠的最適濃度為0.4 g/100 g，木質(zhì)素酶為0.1 g/100 g,淀粉酶為0.3 g/100 g,半纖維素酶的較適添加濃度為0.6 g/100 g。

圖2 酶濃度對(duì)果膠提取得率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on extraction rate of pectin

2.1.3 溫度對(duì)果膠提取得率的影響 從圖3可以看出,溫度對(duì)四種酶的果膠提取得率均有顯著影響,在供試的溫度范圍內(nèi),果膠提取得率隨溫度升高呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)。其中纖維素酶和半纖維素酶均在溫度40 ℃時(shí),果膠的提取得率達(dá)到最大,但在溫度70 ℃時(shí),提取得率略有提升,這是因?yàn)橐环矫?熱效應(yīng)能增加果膠溶出的傳質(zhì)動(dòng)力[21];另一方面,果膠黏度隨溫度上升而下降的流變性質(zhì)導(dǎo)致提取液黏度降低[22],果膠的溶出阻力進(jìn)一步減小。纖維素酶、半纖維素酶的較適提取溫度均為40 ℃,木質(zhì)素酶為50 ℃,淀粉酶為60 ℃。

圖3 溫度對(duì)果膠提取得率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of pectin

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)果膠提取得率的影響 由圖4可以看出,提取時(shí)間對(duì)酶提取果膠提取得率有影響,果膠提取得率隨著時(shí)間的增加而逐漸增大,然后趨于平穩(wěn)。纖維素酶和淀粉酶在提取時(shí)間小于3 h,果膠的提取得率均隨著時(shí)間的增加而上升;之后基本穩(wěn)定。對(duì)于木質(zhì)素和半纖維素酶，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)4 h后,果膠的提取得率逐漸趨于平穩(wěn),但有略微下降,這是因?yàn)?一方面,隨著果膠濃度增大,提取液的黏度增大,果膠的溶出受到一定程度的阻礙;另一方面,果膠提取充分后,在過度酶解作用下,果膠可能會(huì)發(fā)生裂解、酯解,酶制劑中存在的雜酶也可能對(duì)果膠的降解產(chǎn)生影響[23]。由此得出,纖維素酶和淀粉酶的較適酶解時(shí)間為3 h,半纖維素酶和木質(zhì)素酶的較適酶解時(shí)間為4 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)果膠提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of pectin

2.1.5 液料比對(duì)果膠提取得率的影響 由圖5可以看出,不同液料比對(duì)酶提取果膠的提取得率有一定影響,其中對(duì)半纖維素酶及木質(zhì)素酶的影響較大,對(duì)淀粉酶及纖維素酶的影響較小,不同的酶的最適液料比略有不同。當(dāng)液料比較小時(shí),由于溶劑過少,高粘度的果膠質(zhì)阻止了纖維組織中果膠的進(jìn)一步溶出;當(dāng)液料比適當(dāng)時(shí)果膠和酶分子充分接觸,果膠的提取效果好,果膠的提取得率達(dá)到最大;當(dāng)液料比過大,酶分子由于稀釋作用,不能與底物充分接觸,導(dǎo)致果膠的提取效果逐漸降低[18]。在供試液料比范圍內(nèi),半纖維素酶最適液料比是4∶1,纖維素酶最適液料比為3∶1，木質(zhì)素酶最適液料比為6∶1,淀粉酶最適液料比為5∶1。

圖5 液料比對(duì)果膠提取得率的影響Fig.5 Effect of liquid ratio on pectin extraction rate

2.2 酶解能力的比較分析

如圖6所示,通過比較,得出纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶在較優(yōu)條件下的提取能力大小依次為:木質(zhì)素酶(2.27%)>纖維素酶(1.83%)>淀粉酶(1.81%)>半纖維素酶(1.63%)。鑒于淀粉酶的最適作用溫度與其他酶相差甚遠(yuǎn),不利于多種酶復(fù)配后酶解條件的協(xié)調(diào),實(shí)驗(yàn)選擇木質(zhì)素酶、纖維素酶、半纖維素酶三種酶組成復(fù)合酶系。

圖6 單一酶果膠提取能力的對(duì)比Fig.6 Comparison of pectin extraction capacity of single enzyme

2.3 復(fù)合酶酶解條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

優(yōu)選的三種酶進(jìn)行復(fù)配,其酶解條件的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示。由K值可得最優(yōu)組合為

表8 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 The results of orthogonal experiment L9(34)

表9 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 9 Variance analysis results of orthogonal experiment

注:α=0.01的顯著性水平標(biāo)注為**，表11同。A3B2C1D1,即液料比為6∶1 mL/g,提取時(shí)間為3.5 h,pH為4,提取溫度為40 ℃。

表11 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 11 Variance analysis response surface test results

由方差分析結(jié)果表9可知四種因素對(duì)果膠提取得率的影響均極顯著,其影響大小依次為D>B>C>A,即溫度>提取時(shí)間>pH>液料比。經(jīng)三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,提取得率可達(dá)到2.61%。

2.4 酶濃度的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

在復(fù)合酶最優(yōu)提取條件下對(duì)三種酶的添加量進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如表10所示。

表10 酶濃度的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果Table 10 Box-Behnken optimizationresults for enzyme additions

運(yùn)用Design-Expert 8.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸分析,得到回歸方程:Y=2.304+0.14625X1+0.07375X2+0.15X3+0.0475X1X2+0.105X1X3+0.06X2X3-0.18825X12-0.16825X22-0.13575X32,由表11響應(yīng)面回歸模型與方差分析表可知,實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚿<0.001,失擬項(xiàng)不顯著p=0.0681,決定系數(shù)R2=0.855,說明所建模型比較理想,回歸方程預(yù)測(cè)性良好,能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)各酶的添加量對(duì)果膠提取得率的影響。

由方差分析顯著性結(jié)果可見,一次項(xiàng)和二次項(xiàng)p<0.01,說明各因素對(duì)果膠的提取效果影響均為極顯著,三種酶濃度對(duì)結(jié)果的影響并非單一的線性關(guān)系,存在交互作用(p<0.01),且三因素間交互響應(yīng)面(圖7)呈現(xiàn)橢圓,均有最值,表明因素間交互作用影響極為顯著。

圖7 各因素交互影響果膠提取得率的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of pectin extraction rate affected by each factor

通過響應(yīng)面軟件預(yù)測(cè)得到最佳的復(fù)合酶濃度為:纖維素酶0.8 g/100 g,半纖維素酶1.2 g/100 g,木質(zhì)素酶濃度為0.2 g/100 g,此時(shí)果膠提取得率可達(dá)2.81%,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明果膠實(shí)際提取得率可達(dá)2.63%±0.021%。

3 結(jié)論

綜合考慮復(fù)合酶作用條件的協(xié)調(diào)性,通過正交實(shí)驗(yàn)得出優(yōu)選酶類復(fù)合酶解條件為:液料比為6∶1 mL/g,提取時(shí)間為3.5 h,pH為4,提取溫度為40 ℃。在該條件下,通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)獲得復(fù)合酶各組分最佳添加量為:纖維素酶0.8 g/100 g,半纖維素酶1.2 g/100 g,木質(zhì)素酶濃度為0.2 g/100 g。在上述優(yōu)條件下,果膠提取得率可達(dá)到2.63%±0.021%。

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Researchonthecompoundenzymaticextractionprocessofpectinfrompassionflowerpeel

LIUYun-hua1,HUANGWei1,*,GUOMei-yuan2,HUANGMiao-yun2

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,China;2.ZhengYiPin Biological Technology Co.,Ltd. of Chaozhou City,Chaozhou 521000,China)

TS201.1

A

1002-0306(2017)18-0117-07

2017-01-09

劉運(yùn)花(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)加工與貯藏工程，E-mail:jlaufefe10109@163.com。

*通訊作者:黃葦(1967-)，女，碩士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail:weih007@scau.edu.cn。

廣東省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B010102002)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.023