高產(chǎn)類胡蘿卜素的蛹蟲草液體培養(yǎng)基優(yōu)化及其提取工藝研究

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(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院&食品生物技術(shù)研究所,廣東廣州 510640;2.廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510640;3.廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司,廣東廣州 510760)

高產(chǎn)類胡蘿卜素的蛹蟲草液體培養(yǎng)基優(yōu)化及其提取工藝研究

殷林1,2,林俊芳1,2,3,錢璟1,葉志偉1,2,羅詩華1,郭麗瓊1,2,3,*,云帆3

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院&食品生物技術(shù)研究所,廣東廣州510640;2.廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心,廣東廣州510640;3.廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司,廣東廣州510760)

以類胡蘿卜素含量為目標(biāo),采用谷物類為培養(yǎng)基對(duì)蛹蟲草CM-03、CM-04和CM-11三株菌株進(jìn)行了液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化,結(jié)果表明:三株菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基配方分別為CM-03:1.4 g·L-1小麥、2.8 g·L-1玉米、0.3 g·L-1大豆、0.1 g·L-1MgSO4·7H2O、0.1 g·L-1KH2PO4、0.05 mg·L-1VB1、pH自然,類胡蘿卜素含量為(694.8±15.4) μg/g;CM-04:1.2 g·L-1大米、0.6 g·L-1玉米、0.3 g·L-1大豆,0.1 g·L-1MgSO4·7H2O、0.1 g·L-1KH2PO4、0.05 mg·L-1VB1、pH自然,類胡蘿卜素含量為(708.5±25.8) μg/g;CM-11:1.7 g·L-1小麥、2.6 g·L-1玉米、0.3 g·L-1大豆,0.1 g·L-1MgSO4·7H2O、0.1 g·L-1KH2PO4、0.05 mg·L-1VB1、pH自然,類胡蘿卜素含量為(700.5±19.1) μg/g。同時(shí),使用乙醇提取法對(duì)類胡蘿卜素提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明乙醇提取法的最佳工藝條件為:采用石英砂研磨破壁,乙醇濃度60%、料液比1∶40,水浴提取溫度80 ℃,提取級(jí)數(shù)2級(jí),提取率達(dá)到92.8%。

蛹蟲草,類胡蘿卜素,液體發(fā)酵,培養(yǎng)基,提取

Abstract:The cereal-based medium for liquid fermentation was optimized according to the carotenoids production of three strains ofCordycepsmilitarisCM-03,CM-04 and CM-11. The media components of this work contained several kinds of grains such as wheat(W),corn(C),bean(B),rice(R),bran(Br)and inorganic salts like MgSO4·7H2O(Mg),KH2PO4(KHP)and vitamin B1(VB1). The results showed that the best culture medium formula for the carotenoids accumulation byCordycepsmilitarisCM-03 consisted of W(1.4 g·L-1),C(2.8 g·L-1),B(0.3 g·L-1),Mg(0.1 g·L-1),KHP(0.1 g·L-1)and VB1(0.05 mg·L-1),with natural pH,with the carotenoids yield of(694.8±15.4) μg/g. ForCordycepsmilitarisCM-04,its highest carotenoids output was(708.5±25.8) μg/g under the formula consisted of R(1.2 g·L-1),C(0.6 g·L-1),B(0.3 g·L-1),Mg(0.1 g·L-1),KHP(0.1 g·L-1),VB1(0.05 mg·L-1)with natural pH. The highest carotenoids output ofCordycepsmilitarisCM-11 was(700.5±19.1) μg/g with natural pH,the formula formed by W(1.7 g·L-1),C(2.6 g·L-1),B(0.3 g·L-1),Mg(0.1 g·L-1),KHP(0.1 g·L-1)and VB1(0.05 mg·L-1). The extraction process with ethanol was also optimized in this work,and the results showed that the optimal extraction condition was as follows:grinding with quartz sand,ethanol concentration 60%,material to liquid ratio 1∶40,water bath temperature 80 ℃,extraction level 2,and extraction rate of 92.8%.

Keywords:Cordycepsmilitaris;carotenoids;liquid fermentation;medium;extraction

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又名北冬蟲夏草,與冬蟲夏草同屬異種,是一種珍貴的藥用真菌。蛹蟲草含有多種生物活性物質(zhì),如豐富的氨基酸、蟲草素、蟲草酸和蟲草多糖等,在抗炎、抗腫瘤、抗衰老、提高機(jī)體免疫力上具有多種生理學(xué)功能[1],被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療及保健行業(yè)中。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)在蛹蟲草中有類胡蘿卜素的存在,付鳴佳[2]首先報(bào)道了蛹蟲草在光照條件下培養(yǎng),其菌落呈橙黃色是由于菌絲含有高含量的類胡蘿卜素。如今,類胡蘿卜素已成為蛹蟲草新的研究熱點(diǎn)。

目前,已報(bào)到的蛹蟲草類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)的有葉黃素[3]、玉米黃素[4]和北蟲草黃素[5],前兩者屬于脂溶性類胡蘿卜素,后者具有很強(qiáng)的親水性。類胡蘿卜素具有抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫力等功能,現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)750多種類胡蘿卜素,主要存在于植物、藻類、細(xì)菌、非光營(yíng)養(yǎng)型真菌中[6-8],其中利用杜氏鹽藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素已成功實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[9-11]。然而絕大部分的類胡蘿卜素是脂溶性質(zhì),存在不易被人體吸收且遇熱不穩(wěn)定等缺點(diǎn),因此提高生物利用度需要采用一些修飾方法,比如制成乳劑、納米乳劑、混合納米凝膠、納米分散體、微膠囊等來應(yīng)用脂溶性類胡蘿卜素[12-16]。而蛹蟲草中被發(fā)現(xiàn)含有水溶性成分的色素,與大部分脂溶性色素相比能更好地被人體吸收,生物利用度更高[5]。在蛹蟲草的類胡蘿卜素研究中,以谷物類作為培養(yǎng)基,通過液體發(fā)酵來高產(chǎn)類胡蘿卜素還未有人嘗試。本文以谷物類原料作為培養(yǎng)基配方,通過液體發(fā)酵的方式對(duì)三株蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素進(jìn)行了培養(yǎng)基優(yōu)化。同時(shí),使用綠色安全的乙醇提取法對(duì)蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的提取工藝進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草菌株CM-03、CM-04 保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物煉制實(shí)驗(yàn)室;CM-11 寧陽縣海鑫生物科技有限公司;谷物(大米、小麥、玉米、大豆和麩皮,粉碎過30目) 購(gòu)自本地超市;果膠酶(100 U/mg) 江蘇銳陽生物科技有限公司;纖維素酶(400 U/mg) 廣州齊云生物技術(shù)有限公司;葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素B1、瓊脂粉、無水乙醇等 均為分析純,購(gòu)自成碩化學(xué)試劑公司。

SPH-2102C新穎立式小容量恒溫?fù)u床 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;ME104E/02電子分析天平 廣州市正一科技公司;GXZ-288B光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器制造;MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;JY92-2D超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物有限公司;UV1102紫外可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;FZ102粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 液體PDA培養(yǎng)基:200 g去皮馬鈴薯,20 g葡萄糖、1.0 g磷酸二氫鉀、2.0 g蛋白胨和0.5 g硫酸鎂,水1000 mL,pH自然,高壓滅菌后備用。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:每100 mL液體中含有2 g蔗糖,0.3 g蛋白胨,0.1 g MgSO4·7H2O,0.1 g KH2PO4,0.5 mg VB1,pH自然,高壓滅菌后備用。

1.2.2 菌株的活化 取菌種管或斜面保存的原種接種于PDA培養(yǎng)基平板上,25 ℃避光培養(yǎng),待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后放至25 ℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行轉(zhuǎn)色培養(yǎng),得到活化的蛹蟲草母種。

1.2.3 種子液的制備 從活化好的蛹蟲草母種平板用小刀取2塊0.5 cm×0.5 cm的菌塊菌種接種于PDB液體培養(yǎng)基中,25 ℃,150 r/min黑暗搖瓶培養(yǎng)3 d,獲得均勻大小的菌絲球分布于培養(yǎng)基中可用于后續(xù)接種。

1.2.4 液體發(fā)酵 采用兩步法發(fā)酵(搖瓶發(fā)酵加靜態(tài)培養(yǎng))的方式進(jìn)行蛹蟲草的液體發(fā)酵,在250 mL三角瓶中按培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確稱取各類谷物,加入100 mL三級(jí)水?dāng)嚢杈鶆?121 ℃高壓滅菌30 min,冷卻后接入5%的種子液,25 ℃,150 r/min黑暗搖瓶培養(yǎng)5 d。之后將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至已滅菌的平板中,在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)至轉(zhuǎn)色。

1.2.5 類胡蘿卜素含量的測(cè)定 類胡蘿卜素含量的測(cè)定在Dong等[5]的方法上略有修改,稱取0.5 g液體發(fā)酵菌絲,加入1∶20的60%乙醇作為提取溶劑,50 ℃水浴提取30 min,8000 r/min離心10 min,上清液即為類胡蘿卜素提取液,在紫外-分光光度計(jì)上進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,在400～600 nm中選擇最大吸收波長(zhǎng)445 nm作為類胡蘿卜素的測(cè)定吸光值的波長(zhǎng),按以下公式計(jì)算類胡蘿卜素含量:

式中,A:吸光度;V:提取劑用量(mL);D:提取液稀釋陪數(shù);E:消光系數(shù)(0.16);W:樣品干重(g)。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 以可食用的谷物粉(大米、小麥、大豆等)作為蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素液體發(fā)酵培養(yǎng)基的原料,蛹蟲草生長(zhǎng)合適的C/N為20∶1作為設(shè)計(jì)原則[17],以大米、小麥、玉米和麩皮按不同比例組合作為主要C源,大豆作為N源,根據(jù)各谷物的碳氮比[18](表1)按以下公式設(shè)計(jì)出表2的培養(yǎng)基配方,以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照,根據(jù)類胡蘿卜素含量作為響應(yīng)值得到3株蛹蟲草的最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

式中，Ci為各谷物原料的含碳量,Ni為各谷物原料的含碳量,Xi為谷物質(zhì)量。

表1 各谷物原料的碳氮比Table 1 C/N of each cereal material

表2 各培養(yǎng)基配方的原料組成Table 2 Raw material composition of each medium

注:碳源比例指大米、小麥、玉米和麩皮兩兩之間的比例組合;%是指每100 mL發(fā)酵液中各谷物的含量(g)。

1.2.7 類胡蘿卜素提取工藝的研究 稱取0.5 g的烘干蛹蟲草菌絲,破壁處理之后,加入乙醇進(jìn)行提取,8000 r/min離心10 min,取上清液于445 nm處測(cè)定吸光值,根據(jù)1.2.5中公式計(jì)算類胡蘿卜素含量。

1.2.7.1 破壁方法對(duì)類胡蘿卜素含量的影響 取烘干蛹蟲草發(fā)酵菌絲0.5 g,破壁避光處理方法分別為超聲處理、研磨處理和酶處理三種。研磨處理為加入0.5 g石英砂研磨10 min;超聲處理為在500 W功率下超聲10 min;酶處理包含纖維素酶、果膠酶,加入2%酶量處理,50 ℃水浴提取10 min,各處理方法完成后加入40%乙醇,料液比1∶20,室溫提取30 min。

1.2.7.2 提取劑濃度對(duì)類胡蘿卜素含量的影響 取烘干蛹蟲草菌絲0.5 g,石英砂研磨10 min,加入乙醇濃度分別為0、20%、40%、60%、80%、100%,料液比1∶20,避光室溫提取30 min。

1.2.7.3 料液比對(duì)類胡蘿卜素含量的影響 取烘干蛹蟲草菌絲0.5 g,石英砂研磨10 min,按照料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 (g/mL)加入60%乙醇,避光室溫提取30 min。

1.2.7.4 提取溫度對(duì)類胡蘿卜素含量的影響 取烘干蛹蟲草菌絲0.5 g,石英砂研磨10 min,加入料液比1∶40的60%乙醇,分別在4、30、50、70、90 ℃下避光提取30 min。

1.2.7.5 提取時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素含量的影響 取烘干蛹蟲草菌絲0.5 g,石英砂研磨10 min,加入料液比1∶40的60%乙醇,在70 ℃下分別避光提取0.25、0.5、0.75、1、2和3 h。

1.2.8 正交實(shí)驗(yàn) 對(duì)提取劑濃度(A)、料液比(B)和提取溫度(C)進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),因素水平表見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)與水平因素Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.9 提取級(jí)數(shù) 在最佳提取條件下,進(jìn)行多次提取,按以下公式測(cè)定各級(jí)的提取率,確定提取級(jí)數(shù)。

提取率(%)=各級(jí)的提取含量/總提取含量×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形的制作;使用IBM SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析(p<0.05)

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

蛹蟲草CM-03、CM-04和CM-11在各培養(yǎng)基中所產(chǎn)的類胡蘿卜素含量結(jié)果如圖1所示。從圖1(A)可以看出,蛹蟲草CM-03在大米-小麥培養(yǎng)基(配方E、F、G和H)和小麥-玉米培養(yǎng)基(配方I、J、K和L)中高產(chǎn)類胡蘿卜素穩(wěn)定,其中配方L含量最高,達(dá)到(694.8±15.4)μg/g,是對(duì)照基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基313.1±16.3 μg/g的2.2倍。在大米-玉米培養(yǎng)基(A、B、C和D)中隨著大米/玉米比例的減少而類胡蘿卜素含量減少,在大米-麩皮培養(yǎng)基(M、N、O和P)中也隨著大米/麩皮比例的減少而類胡蘿卜素含量減少,這說明蛹蟲草CM-03偏好大米作為產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)基。從圖1(B)可以看出,蛹蟲草CM-04在大米-玉米培養(yǎng)基、小麥-玉米培養(yǎng)基和大米-麩皮培養(yǎng)基中高產(chǎn)類胡蘿卜素穩(wěn)定,且在大米-玉米培養(yǎng)基中含量最高,達(dá)到(708.5±25.8) μg/g,是對(duì)照(259.0±9.0) μg/g的2.7倍。在大米-小麥培養(yǎng)基中隨著大米/小麥比例的減少而類胡蘿卜素含量減少,說明蛹蟲草CM-04也偏好大米作為產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)基。從圖1(C)可以看出,蛹蟲草CM-11在大米-玉米培養(yǎng)基、大米-小麥培養(yǎng)基和小麥-玉米培養(yǎng)基中產(chǎn)類胡蘿卜素穩(wěn)定,其中配方K產(chǎn)量最高,達(dá)到(700.5±19.1) μg/g,是對(duì)照(346.8±22.0) μg/g的2.0倍。在大米-麩皮培養(yǎng)基中產(chǎn)類胡蘿卜素不穩(wěn)定,在大米/麩皮比例分別為1∶0.25和1∶1時(shí)含量高,而在1∶0.5和1∶0.75時(shí)產(chǎn)量較低。

本實(shí)驗(yàn)以可食用的谷物作為培養(yǎng)基來優(yōu)化蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基,研究發(fā)現(xiàn),相比于使用速效碳源作為培養(yǎng)基,遲效碳源更適合蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的研究。在通常情況下,速效碳源能被蛹蟲草菌絲吸收利用并快速合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì),但代謝產(chǎn)物合成則受到抑制。而菌體對(duì)于一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的碳源則吸收速度較慢,菌體生長(zhǎng)緩慢,節(jié)約的原料和能源可以用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[19]。因此,遲效碳源更適合產(chǎn)物的積累,這在本文研究中也有相同的發(fā)現(xiàn)。付鳴佳[2]在PDA中添加蠶蛹粉通過平板培養(yǎng)的方式獲得了472.3 μg/g的類胡蘿卜素含量。沈俊良[20]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2.5%玉米粉獲得了558.4 μg/g的類胡蘿卜素含量。在本研究中,發(fā)現(xiàn)在使用不同谷物的復(fù)合培養(yǎng)基時(shí)能有效提高類胡蘿卜素的含量,并且在不同的配方比例下產(chǎn)量穩(wěn)定。

圖1 三株蛹蟲草在各培養(yǎng)基中所產(chǎn)類胡蘿卜素的含量比較Fig.1 Comparison of carotenoid contents of three strains of Cordyceps militaris in each culture medium注:A為蛹蟲草CM-03在各培養(yǎng)基中所產(chǎn)類胡蘿卜素的含量圖;B為蛹蟲草CM-04在各培養(yǎng)基中所產(chǎn)類胡蘿卜素的含量圖;C為蛹蟲草CM-11在各培養(yǎng)基中所產(chǎn)類胡蘿卜素的含量圖;CK為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,大寫字母代表不同的配方；不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05)，圖2～圖6同。

2.2 提取工藝的研究

2.2.1 破壁方法的選擇 選取了三種破壁處理方法提取蛹蟲草發(fā)酵菌質(zhì)中的類胡蘿卜素,結(jié)果如圖2所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,與對(duì)照相比,石英砂研磨、超聲波破碎和酶處理可以提高類胡蘿卜素的含量。其中相比于超聲波破碎和酶處理,石英砂研磨成本最低且操作簡(jiǎn)單可行,所以選擇石英砂研磨處理作為最優(yōu)的破壁方法。

圖2 破壁方法對(duì)類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.2 Effect of wall-breaking methods on extraction yield of carotenoids

2.2.2 乙醇濃度的確定 圖3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí),蛹蟲草的提取量達(dá)到最高,此時(shí),類胡蘿卜素最大提取含量為(714.6±10.8) μg/g,低于或高于這個(gè)濃度時(shí),類胡蘿卜素的提取含量會(huì)顯著降低(p<0.05),可能是由于蛹蟲草類胡蘿卜素中含有親水性成分。雖然80%乙醇與60%乙醇在提取含量上并無顯著差異,但出于用料成本的考慮,本研究選擇60%乙醇作為最佳的提取液濃度。

圖3 乙醇濃度對(duì)類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of carotenoids

2.2.3 料液比的確定 由圖4的結(jié)果可知,隨著料液比的增加,蛹蟲草類胡蘿卜素的提取含量逐漸增加,直至料液比達(dá)到1∶40。隨后,類胡蘿卜素的提取含量出現(xiàn)下降。所以,選擇1∶40作為最佳的料液比。

圖4 料液比對(duì)類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.4 Effect of ratios of material to liquid on extraction yield of carotenoids

2.2.4 提取溫度的確定 如圖5所示,類胡蘿卜素提取含量隨著提取溫度的增加而升高,這在張杰等[21]的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)。但當(dāng)提取溫度超過70 ℃時(shí),提取量開始出現(xiàn)下降,這一方面可能是由于高溫能減少提取劑的體積,從而導(dǎo)致提取含量下降;另一方面可能是因?yàn)楦叩臏囟葘?dǎo)致類胡蘿卜素出現(xiàn)降解。因此,選擇70 ℃作為最佳的提取溫度。

圖5 提取溫度對(duì)類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction yield of carotenoids

2.2.5 提取時(shí)間的確定 提取時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素提取含量的影響如圖6所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素提取含量和提取劑體積并無顯著影響,在提取3 h后含量并未顯著減少,說明蛹蟲草中類胡蘿卜素耐高溫,在70 ℃下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,這在許多研究中也有相同的發(fā)現(xiàn)[22]。

表5 類胡蘿卜素提取級(jí)數(shù)的影響Table 5 Effect of extraction grade on extraction yield of carotenoids

圖6 提取時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.6 Effect of time on extraction yield of carotenoids

2.2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析 由表4可得,對(duì)蛹蟲草類胡蘿卜素提取量的3個(gè)影響因素的主次順序是A>C>B,表明乙醇濃度的影響對(duì)類胡蘿卜素提取效果影響最大,其次是提取溫度和料液比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示最佳提取工藝為A2B2C3,即乙醇濃度60%,料液比1∶40和提取溫度80 ℃。在最佳的提取工藝下,類胡蘿卜素的提取含量為(1249.2±26.5) μg/g,符合實(shí)際提取結(jié)果。

表4 蛹蟲草類胡蘿卜素提取正交實(shí)驗(yàn)分析表Table 4 Orthogonal test of carotenoidsproduction from Cordyceps militaris

2.2.7 提取級(jí)數(shù)的確定 在最佳的提取工藝下,進(jìn)行多次提取,測(cè)定各次的提取率,確定提取級(jí)數(shù),結(jié)果見表5。由表5可知,第一次提取率達(dá)到了73.5%,第二次為19.3%,第三次為7.2%。前兩次提取率可達(dá)92.8%,色素產(chǎn)量為1455.3 μg/g,因此確定提取級(jí)數(shù)為2級(jí)。

3 討論

目前,在蛹蟲草的液體發(fā)酵的研究中,大部分都是利用無機(jī)化學(xué)物質(zhì)作為培養(yǎng)基來生產(chǎn)活性物質(zhì),如蟲草素、蟲草多糖等[23-25],很少有對(duì)有機(jī)復(fù)合物質(zhì)進(jìn)行研究,而利用谷物類作為培養(yǎng)基來生產(chǎn)類胡蘿卜素未見報(bào)道。若能優(yōu)化出適合某種活性物質(zhì)高產(chǎn)的有機(jī)復(fù)合碳氮源培養(yǎng)基,那么就能減少很多化學(xué)試劑的使用,也能大大簡(jiǎn)化培養(yǎng)方法,普通大眾的接受程度也會(huì)更高。在本文研究中,發(fā)現(xiàn)復(fù)合的遲效碳氮源比單一的速效碳氮源更有利于蛹蟲草類胡蘿卜素的產(chǎn)出,而且產(chǎn)量得到了顯著的提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,不同蛹蟲草在同一配方中類胡蘿卜素積累量存在差距,同一蛹蟲草在不同配方中也存在顯著差異,說明蛹蟲草對(duì)不同谷物培養(yǎng)基的親和性存在差異,其中蛹蟲草CM-03和CM-04偏好大米作為培養(yǎng)基,蛹蟲草CM-11偏好小麥、玉米作為培養(yǎng)基。這在香菇、猴頭菇和靈芝等食用菌中也有類似的發(fā)現(xiàn)[26]。

在蛹蟲草類胡蘿卜素的提取研究中,目前大部分都采用丙酮或石油醚等有機(jī)溶劑作為提取劑,雖然提取量較高,但難以去除,成本較高,其毒性也限制了其在食品中的應(yīng)用[27-28]。在本文研究中,相比較于丙酮提取法,乙醇提取法更安全,可以獲得食用級(jí)別的類胡蘿卜素。同時(shí),嘗試了使用水為溶劑提取蛹蟲草類胡蘿卜素,結(jié)果表明在發(fā)酵菌絲、烘干子實(shí)體和新鮮子實(shí)體中只有在新鮮子實(shí)體中提取到類胡蘿卜素的特征峰,這說明蛹蟲草在不同的生長(zhǎng)階段可能所合成的類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同,在子實(shí)體階段其類胡蘿卜素親水性強(qiáng),而新鮮子實(shí)體烘干后水溶性降低可能是由于烘干處理會(huì)影響其結(jié)構(gòu)性質(zhì)。而蛹蟲草類胡蘿卜素中具有哪些分子結(jié)構(gòu),有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

蛹蟲草中含有的類胡蘿卜素是一種稀有的天然色素,具有很強(qiáng)的親水性,且耐高溫。本實(shí)驗(yàn)為開發(fā)這一色素,從發(fā)酵培養(yǎng)基到提取工藝的研究都做了系統(tǒng)的優(yōu)化。在培養(yǎng)基上,利用可食用的谷物作為培養(yǎng)基,研究了三株蛹蟲草高產(chǎn)類胡蘿卜素的最優(yōu)配方。其中CM-03在小麥-玉米作為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)量最高且穩(wěn)定;CM-04在大米-玉米培養(yǎng)基上產(chǎn)量最高且穩(wěn)定;CM-11也在小麥-玉米培養(yǎng)基上產(chǎn)量最高且穩(wěn)定。在提取方法上,使用安全的乙醇提取法對(duì)類胡蘿卜素的提取工藝進(jìn)行了研究。通過正交實(shí)驗(yàn)確定了蛹蟲草色素最佳提取工藝:采用石英砂研磨破壁,乙醇濃度60%,料液比1∶40,提取溫度80 ℃,提取級(jí)數(shù)為2級(jí),提取率達(dá)到92.8%。

[1]CUI J D. Biotechnological production and applications of Cordyceps militaris,a valued traditional Chinese medicine[J]. Critical Reviews in Biotechnology,2015,35(4):475-484.

[2]付鳴佳. 蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的研究[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2005,24(5):107-110.

[3]閆喜濤,包海鷹,圖力古爾. 人工培養(yǎng)蛹蟲草中一種天然色素的分離和結(jié)構(gòu)鑒定[J].菌物學(xué)報(bào),2010,29(5):777-781.

[4]陳策,圖力古爾,包海鷹. 人工蛹蟲草的化學(xué)成分分析[J].食品科學(xué),2013,34(11):36-40.

[5]DONG J Z,WANG S H,AI X R,et al. Composition and characterization of cordyxanthins from Cordyceps militaris fruit bodies[J]. Journal of Functional Foods,2013,5(3):1450-1455.

[6]NISAR N,LI L,LU S,et al. Carotenoid metabolism in plants[J]. Moleculer Plant,2015,8(1):68-82.

[7]孫玉敬,喬麗萍,鐘烈洲,等. 類胡蘿卜素生物活性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2012,12(1):160-166.

[8]YEN H W,YANG Y C. The effects of irradiation and microfiltration on the cells growing and total lipids production in the cultivation of Rhodotorula glutinis[J]. Bioresource Technology,2012,107:539-541.

[9]Rao A V,RAO L G. Carotenoids and human health[J]. Pharmacological Research,2007,55(3):207-216.

[10]牟春琳,郝曉華,劉鑫,等. 類胡蘿卜素細(xì)胞工廠-杜氏藻養(yǎng)殖研究進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué)進(jìn)展,2010,28(4):554-562.

[11]RAJA R,HEMAISWARYA S,RENGASAMY R. Exploitation of Dunaliella for beta-carotene production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2007,74(3):517-523.

[12]MASAYUKI N,MAKOTO S,YOSHIYUKI M,et al. Effects of Emulsifiers on the Photostability of Lycopene[J]. Food Sci Technol,2013,19(6):983-987.

[13]LIANG R,SHOEMAKER C F,YANG X Q,et al. Stability and Bioaccessibility ofβCarotene in Nanoemulsions Stabilized by Modified Starches[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(6):1249-1257.

[14]HINDUPUR R,VALLIKANNAN B. Biodegradable chitosan-glycolipid hybrid nanogels:A novel approach to encapsulate fucoxanthin for improved stability and bioavailability[J]. Food Hydrocolloids,2015,43:717-725.

[15]NAVIDEH A,IMEDEDDINE A N,HASSEN M S,et al. Preparation of Astaxanthin Nanodispersions Using Gelatin-Based Stabilizer Systems[J]. Molecules,2014,19(9):14257-14265.

[16]DONHOWE E G,KONG F. Beta-carotene:Digestion,Microencapsulation,andInVitroBioavailability[J]. Food Bioprocess Technol,2014,7(2):338-354.

[17]宋仙妹,常繼東. 蛹蟲草菌絲體培養(yǎng)特性的研究[J].食用菌,2008(3):12-14.

[18]彭志妮. 蛹蟲草固體發(fā)酵及其抗氧化活性研究[D]. 廣州:華南農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[19]簡(jiǎn)利茹,杜雙田. 不同碳源下蛹蟲草的產(chǎn)量及蟲草素和腺苷的含量[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(12):110-112.

[20]沈俊良,金華燕,高雅. 蛹蟲草藍(lán)光誘導(dǎo)兩步法發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素[J].中國(guó)生物工程雜志,2013,33(2):83-87.

[21]張杰,范志微,王濱松. 蛹蟲草培養(yǎng)基色素的提取與穩(wěn)定性[J]. 食用菌學(xué)報(bào),2012,19(4):17-20.

[22]左銀虎,趙怡紅.北冬蟲夏草色素的提取與穩(wěn)定性[J]. 食品研究與開發(fā),2010,31(9):237-239.

[23]KANG C,WEN T C,KANG J C,et al. Optimization of large-scale culture conditions for the production of cordycepin with Cordyceps militaris by liquid static culture[J]. The Scientific World Journal,2014,2014:1-15.

[24]TANG J P,LI Y T,ZHU L. Optimization of fermentation conditions and purification of cordycepin from Cordyceps militaris[J]. Preparative Biochemistry and Biotechnology,2014,44(1):90-106.

[25]YANG S,JIN L,REN X D,et al. Optimization of fermentation process of Cordyceps militaris and antitumor activities of polysaccharidesinvitro[J]. Journal of Food and Drug Analysis,2014,22(4):468-476.

[26]溫魯. 幾種食用菌與不同谷物培養(yǎng)基的親和性[J]. 食品科學(xué),2006,27(10):132-134.

[27]YANG T,SUN J,LIAN T T,et al. Process optimization for extraction of carotenoids from medicinal caterpillar fungus,Cordyceps militaris(Ascomycetes)[J]. International Journal of Medicinal Mushrooms,2014,16(2):125-135.

[28]王陶,李文,楊克. 蛹蟲草類胡蘿卜素的熱酸-超聲復(fù)合提取工藝的研究[J]. 食品工業(yè),2011(9):54-58.

Optimizationoftheliquidculturemediumcomposition
forhighcarotenoidproductionbyCordycepsmilitaris
andtheinvestigationontheimprovementofcarotenoidextraction

YINLin1,2,LINJun-fang1,2,3,QIANJing1,YEZhi-wei1,2,LUOShi-hua1,GUOLi-qiong1,2,3,*,YUNFan3

(1.College of Food Science & Institute of Food Biotechnology,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,China;2.Research Center for Micro-Ecological Agent Engineering and Technology of Guangdong Province,Guangzhou 510640,China;3.Alchemy Biotechnology Co.,Ltd.,of Guangzhou City,Guangzhou 510760,China)

TS201.2

A

1002-0306(2017)18-0079-06

2017-03-20

殷林(1991-),男,在讀碩士研究生,研究方向:微生物資源的應(yīng)用,E-mail:649431351@qq.com。

*通訊作者:郭麗瓊(1962-),女,博士,研究方向:食藥用菌活性物質(zhì)的開發(fā)與利用,E-mail:guolq@scau.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372116,31572178);廣東省自然科學(xué)基金(2016A030313404)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B02 0205003;2014B050505018)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.016