高效液相色譜法測定甘孜州大蒜有效成分蒜氨酸的含量

夏 陳，朱永清*，楊開俊,羅孝貴,李 娟，鄧俊琳 ，張盈嬌，陳 建

(1．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；2．甘孜州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,四川 康定 626000)

高效液相色譜法測定甘孜州大蒜有效成分蒜氨酸的含量

夏 陳1，朱永清1*，楊開俊2,羅孝貴2,李 娟1，鄧俊琳1，張盈嬌1，陳 建1

(1．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；2．甘孜州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,四川 康定 626000)

建立了高效液相色譜(HPLC)法測定大蒜中蒜氨酸含量的方法。色譜條件為：Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相A-水溶液，B-甲醇，95%B等度洗脫；檢測波長214 nm。對四川省甘孜州種植的紅七星、道孚、金蒜一號、曲Ⅰ4個大蒜品種進(jìn)行測定，并與市售大蒜和市售獨頭蒜進(jìn)行比較。該方法重復(fù)性好(RSD=1.95%)，穩(wěn)定性好(RSD=0.90%)，精密度高(RSD=0.36%)，加標(biāo)回收率較好(RSD=5.4%)。結(jié)果表明，紅七星中蒜氨酸含量最高，為3.67%；道孚、金蒜一號、曲Ⅰ中蒜氨酸含量較接近，均在1.70%～1.80%；市售獨頭蒜中蒜氨酸含量為2.44%；市售大蒜蒜氨酸含量最低，僅為1.58%。

大蒜；蒜氨酸；高效液相色譜

Abstract：We established a high performance liquid chromatography(HPLC) method for the determination of the content of alliin from garlic.The chromatographic conditions were as follows: an Eclipse XDB-C18column (250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，mobile phase A was water，mobile phase B was methanol,95%B isocratic elution，and the detection wavelength was 214 nm.We determined the alliin contents in four kinds of garlics，namelyHongqixing，Daofu，Jinsuan1，andQuⅠ，which were planted in Garzê of Sichaun Province.We also compared their alliin contents with the common garlic and single garlic purchased in market.The method was of good repeatability(RSD=1.95%),good stability (RSD=0.90%)，high precision (RSD=0.36%),and good adding standard recovery(RSD=5.4%).Among the four kinds of garlics,Hongqixinggarlic had the highest alliin content of 3.67%.The contents of alliin inDaofu,Jinsuan1，andQuⅠgarlics were closer，and the contents ranged from 1.70% to 1.80%.The single garlic contains 2.44% alliin.The common garlic contains the lowest alliin of 1.58%.

Keywords：garlic;alliin;HPLC

大蒜(AlliumsativumL.)為百合科蔥屬草本植物，是重要的蔥蒜類蔬菜，以鱗莖、花莖和嫩葉作為其食用器官。我國是世界大蒜種植的第一大國，產(chǎn)量和出口量均居世界前列[1]。大蒜營養(yǎng)豐富，其化學(xué)成分包括：揮發(fā)性硫醚類化合物、糖類、氨基酸類、肽類、甾體苷類、硫苷類化合物、維生素和微量元素等[2-3]。研究表明，大蒜具有抑菌[4]、防癌[2]、抗氧化[5]、護(hù)心和免疫調(diào)節(jié)[6]等多種生物功效。蒜氨酸化學(xué)名為S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜(S-allyl-L-cysteine sulfoxide)，是大蒜中主要的含硫氨基酸[7]。蒜氨酸為大蒜的原始功效成分，在蒜氨酸裂解酶的作用下裂解產(chǎn)生大蒜素和阿霍烯等含硫化合物[8-9]。蒜氨酸不僅是大蒜中主要的風(fēng)味前體物質(zhì)[10]，且與大蒜的抗癌、抗炎癥、抗糖尿病、抗菌、抗氧化[11-12]等多種生理活性有關(guān)。

蒜氨酸作為大蒜的重要功效成分以及其它功效成分的前體物質(zhì)，其含量對大蒜的品質(zhì)有重要影響。作者建立了高效液相色譜法(HPLC)快速檢測大蒜中蒜氨酸含量的方法，并對四川省甘孜州種植的紅七星、道孚、金蒜一號、曲Ⅰ4個大蒜品種，市售獨頭蒜和市售大蒜中的蒜氨酸含量進(jìn)行定量分析，以期為大蒜中蒜氨酸的檢測提供準(zhǔn)確、可靠的快速檢測方法，并為大蒜的種植及精深加工產(chǎn)業(yè)提供科學(xué)的質(zhì)量控制參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

大蒜，由甘孜州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，北京索萊寶科技有限公司；甲醇,色譜純；超純水。

電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；KH2200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 蒜氨酸的提取

選取10顆完整大蒜，每顆取下3瓣，共計30瓣，稱重m1；微波滅蒜氨酸酶1 min，冷卻，稱重m2；打漿，稱取質(zhì)量m3(約8 g)，加入50 mL蒸餾水，打漿，用20 mL蒸餾水洗滌打漿機，15 ℃超聲提取20 min，定容至100 mL；取上清液100 μL稀釋至1 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣5 μL，HPLC分析，檢測波長為214 nm。

1.2.2 蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，置于25 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別配制濃度(μg·mL-1)梯度為1.53、6.13、12.25、19.60、49.00、98.00、196.00、392.00標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測。

按下式計算蒜氨酸含量：

式中：c為蒜氨酸濃度。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；DAD檢測器，檢測波長214 nm；柱溫30 ℃；流速0.8 mL·min-1；流動相：水(A)+甲醇(B)；等梯度洗脫：0～15 min，95%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜(圖1)

圖1 蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(a)和6種大蒜樣品(b)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of alliin standard(a) and six kinds of garlic samples(b)

從圖1可以看出，在此色譜條件下，蒜氨酸得到較好地分離。紅七星、道孚、金蒜一號、曲Ⅰ、市售獨頭蒜、市售大蒜在4 min處均有色譜峰(圖1b)，其保留時間與蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(圖1a)的色譜峰保留時間一致。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系

在1.2.3色譜條件下分別對不同濃度的蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析。以濃度(x，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，蒜氨酸的線性方程為：y=7.2771x+17.59，R2=0.9995。表明在蒜氨酸濃度為1.53～392.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 重復(fù)性實驗

按照1.2.1方法平行制備5份大蒜提取液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣5 μL進(jìn)行測定，計算蒜氨酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.95%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3 精密度實驗

按照1.2.2方法制備標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計算蒜氨酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.36%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實驗

按照1.2.1方法制備1份大蒜提取液，按1.2.3色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h進(jìn)樣，計算蒜氨酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.90%，表明蒜氨酸在該實驗條件下8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 回收率實驗

按1.2.1方法制備樣品，按1.2.3色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1大蒜中蒜氨酸的加標(biāo)回收率

Tab.1 Adding standard recovery of the alliin in garlic

由表1可知，蒜氨酸的加標(biāo)回收率在92%～104%，RSD為5.4%，表明該方法有較好的回收率。

2.3 不同品種大蒜中蒜氨酸含量

6種大蒜中蒜氨酸含量見表2。

表26種大蒜中蒜氨酸含量/%

Tab.2 Alliin contents of six kinds of garlics/%

由表2可知，紅七星中蒜氨酸含量最高(3.67%)，其次為市售獨頭蒜(2.44%)，道孚、金蒜一號和曲Ⅰ中蒜氨酸含量較接近，均在1.70%～1.80%，含量最低為市售大蒜(1.58%)。

2.4 討論

新鮮大蒜中蒜氨酸的提取通常對整顆大蒜隨機取樣，由于樣本量少，導(dǎo)致檢測結(jié)果誤差大，本次實驗中，隨機選取10顆完整大蒜，每顆取下3瓣，共計30瓣，對這30瓣大蒜再做滅酶、打漿處理，有效降低取樣誤差。Huchette等[13]研究發(fā)現(xiàn)基因型與光照對大蒜中蒜氨酸的積累有顯著影響，而溫度則通過影響蔗糖濃度影響大蒜中蒜氨酸的積累。Tang等[14]報道新鮮大蒜中蒜氨酸含量約為1.29%，本實驗中所測的6種大蒜中蒜氨酸含量均超過1.29%，且甘孜州種植的4種大蒜中蒜氨酸含量均高于普通市售大蒜(1.58%)。4種大蒜種植地海拔約3 700 m，晝夜溫差大，日照時間長，這些氣候因素可能與甘孜州大蒜中高含量蒜氨酸的形成有直接聯(lián)系。紅七星、道孚和金蒜一號都種植于道孚縣八美鎮(zhèn)，但紅七星中蒜氨酸含量顯著高于道孚和金蒜一號，這很有可能是品種差異造成的。種植于道孚縣八美鎮(zhèn)的金蒜一號和爐霍宜木鄉(xiāng)的曲Ⅰ的蒜氨酸含量較接近，道孚縣和爐霍縣位于甘孜藏族自治州的西北方向，且二者毗鄰，種植氣候、環(huán)境無巨大差異，因此就蒜氨酸含量而言，這2種大蒜品質(zhì)較接近。因此推測，紅七星比道孚、金蒜一號、曲Ⅰ更適合種植于該地區(qū)，或者其品質(zhì)優(yōu)于其它大蒜。獨頭蒜是沒有分瓣的大蒜，其形成的原因主要是播種的蒜瓣未經(jīng)低溫階段完成春化作用而導(dǎo)致花芽不分化，且在鱗芽分化時缺乏足夠的光照和營養(yǎng)物質(zhì)[15]。研究發(fā)現(xiàn)獨頭蒜比大蒜中的蒜氨酸含量高5.9%[16]，本實驗中市售獨頭蒜中蒜氨酸含量高于道孚、金蒜一號和曲Ⅰ，但遠(yuǎn)低于紅七星，這也表明紅七星品質(zhì)較好。大蒜品質(zhì)性狀受到品種的遺傳特性、生態(tài)環(huán)境條件、栽培技術(shù)等多方面的影響，而蒜氨酸作為大蒜中重要的功效成分，對大蒜的品質(zhì)有重要影響[10]。在大蒜栽培過程中，應(yīng)當(dāng)重視大蒜品種、生態(tài)環(huán)境和種植條件等，以達(dá)到生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的大蒜。

3 結(jié)論

采用HPLC法測定大蒜中蒜氨酸含量。以甲醇和水為流動相，采用等梯度洗脫的方式，較好地將蒜氨酸在15 min內(nèi)進(jìn)行了分離，且測定結(jié)果的重復(fù)性好(RSD=1.95%)，穩(wěn)定性好(RSD=0.90%)，精密度高(RSD=0.36%)，加標(biāo)回收率較好(RSD=5.4%)。測定了6種大蒜樣品中蒜氨酸含量，結(jié)果表明：6種大蒜樣品中蒜氨酸含量差異較大，紅七星中蒜氨酸含量最高，為3.67%，道孚、金蒜一號、曲Ⅰ中蒜氨酸含量較接近，均在1.70%～1.80%，市售獨頭蒜中蒜氨酸含量為2.44%，市售大蒜中蒜氨酸含量為1.58%。

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DeterminationofEffectiveComponentAlliinfromGarlicPlantedinGarzêbyHPLC

XIA Chen1,ZHU Yong-qing1*,YANG Kai-jun2,LUO Xiao-gui2,LI Juan1,DENG Jun-lin1,ZHANG Ying-jiao1,CHEN Jian1

(1.InstituteofAgro-ProductsProcessingScienceandTechnology,SichuanAcademyofAgriculturalSciences,Chengdu610066,China；2.GarzêAgriculturalResearchInstitute,Kangding626000,China)

O657.72

A

1672-5425(2017)09-0067-04

四川省財政創(chuàng)新能力提升工程，四川省農(nóng)科院條件建設(shè)專項-院人才項目

2017-05-05

夏陳(1983-)，男，四川成都人，助理研究員，研究方向：功能食(藥)品，E-mail:154541462@qq.com；通訊作者：朱永清，副研究員，E-mail:137124551@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.09.015

夏陳，朱永清，楊開俊，等.高效液相色譜法測定甘孜州大蒜有效成分蒜氨酸的含量[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(9)：67-70.