碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌多位點序列分型和不同ST分型感染患者的臨床特點

吳 娜， 田素飛， 褚云卓， 陳佰義， 劉麗文， 張智潔， 王 晶， 肖曉光， 路 娟

碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌多位點序列分型和不同ST分型感染患者的臨床特點

吳 娜1， 田素飛*， 褚云卓*， 陳佰義1， 劉麗文2， 張智潔3， 王 晶4， 肖曉光4， 路 娟5

目的對臨床分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CR-KPN）進行多位點序列分型（MLST），同時研究不同ST分型感染患者的臨床特點。方法收集2013年1月－2015年6月遼寧省為主5所醫(yī)院臨床分離的61株CR-KPN，采用微量肉湯稀釋法測定受試菌株對14種抗菌藥物的敏感性。應用PCR基因擴增技術及DNA測序方法對受試菌株進行碳青霉烯酶基因檢測。通過對受試菌株進行MLST，探討其克隆相關性和分子流行病學特征。同時分析不同ST分型下CR-KPN的耐藥特點、耐藥機制及菌株感染的臨床特點。結果MLST分型顯示61株CR-KPN共有18種ST分型，ST11為優(yōu)勢型別（53.3 %），研究同時發(fā)現這部分ST11型菌株更容易對碳青霉烯類抗生素耐藥且MIC值較高，大部分產KPC-2型碳青霉烯酶。單因素分析提示ST11組患者在ICU接受治療所占的比例及機械通氣的使用率高于非ST11組，差異具有統(tǒng)計學意義。其他ST型中ST2033、ST2135、ST2193、ST2194、ST2195、ST2196為世界范圍內首次注冊，其中ST2193、ST2194、ST2195與ST11有密切的親緣性。臨床資料提示同一所醫(yī)院同一時期以相同克隆流行為主。結論MLST顯示CR-KPN共有18種ST型別，ST11為優(yōu)勢型別，結合臨床資料發(fā)現同一所醫(yī)院同一時期以相同克隆流行為主，提示CR-KPN有局部播散的風險。鑒于臨床資料分析提示接受過ICU治療和機械通氣的患者容易發(fā)生CR-KPN菌株（特別是ST11型）感染的風險，此類患者應引起臨床的廣泛重視。

肺炎克雷伯菌； 多位點序列分型； 碳青霉烯酶

Abstract: ObjectiveTo investigate the homology of carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae(CR-KPN) isolates by multilocus sequence typing (MLST) method, and pro fi le CR-KPN infections in terms of MLST sequence types (STs).MethodsA total of 61 CR-KPN isolates were collected in fi ve hospitals from Liaoning Province from January 2013 to June 2015. The MICs of 14 antimicrobial agents against these isolates were determined by broth microdilution method. The genotypes of carbapenemases were analyzed by PCR and DNA sequencing techniques.The homology of CR-KPN isolates were analyzed by MLST method. The clinical data of patients with CR-KPN infection were reviewed to characterize CR-KPN infections.ResultsA total of 18 STs were identi fi ed among the 61 CR-KPN strains according to MLST data. More than 50 % of the isolates belonged to ST11 (53.3 %). ST11 strains showed higher resistance rate to carbapenems and higher prevalence of KPC-2 type carbapenemase. Univariate analysis indicated that more ST11-infected patients were treated in ICU and with mechanicalventilation than non-ST11 CR-KPN-infected patients (P＜0.05). ST2033, ST2135, ST2193, ST2194, ST2195 and ST2196 were the STs fi rstly registered in the world. The eBURST analysis showed that ST2193, ST2194, ST2195 and ST11 were closely related.Clinical data indicated that the prevalent CR-KPN strains during the same period in the same hospital usually belonged to the same ST clone.ConclusionsMLST of CR-KPN showed 18 sequence types, of which ST11 was the predominant type. Clinical data indicated that the prevalent CR-KPN strains during the same period in the same hospital usually belonged to the same ST clone. This suggests the potential of local CR-KPN outbreak. The ICU patients and those receiving mechanical ventilation may be prone to CRKPN (especially ST11) infection. Such patients should be managed appropriately.

Key words:Klebsiella pneumoniae; multilocus sequence typing; carbapenemase

碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae，CR-KPN）不斷增加的耐藥趨勢和播散形勢引起廣大臨床工作者的關注，已成為全球性公共衛(wèi)生問題。在對耐藥機制研究的同時，研究人員采用多位點序列分型（multilocus sequence typing， MLST）方法對菌株的播散特征進行分子流行病學研究，結合菌株致病性或耐藥性，追蹤菌株間的遺傳特性和宏觀進化過程，為解決細菌耐藥和播散提供指導。本研究將對本地區(qū)臨床分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌進行MLST，掌握本地區(qū)的分子流行病學趨勢。同時針對不同遺傳來源的菌株進行藥物敏感性、耐藥機制及臨床感染特點相結合的方式進行分析，探討不同遺傳來源細菌發(fā)生耐藥的危險因素和感染的臨床特點，指導本地區(qū)CR-KPN的感控防治和臨床治療。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2013年1月－2015年6月5所醫(yī)院的CR-KPN 61株，包括中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院（30株）、中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院（4株）、遼寧省人民醫(yī)院（9株）、大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院（10株）、哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院（8株），均為非重復菌株。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，大腸埃希菌ATCC35218，銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2 儀器與試劑 PCR儀（美國Applied Biosystems公司，9700型），水平電泳儀（美國Bio-Rad公 司 ）；Mueller-Hinton瓊 脂（ 英國OXOID公司）、藥敏試驗所用抗菌藥物購自U.S.Pharmacopeia、European Pharmacopoeia 和Dr.Ehrenstorefer GmbH，美羅培南紙片（10 μg，英國OXOID公司），乙二胺四乙酸（EDTA，pH=8，0.5 mol/L）、EB替代物為北京市普利萊基因技術

1.2 方法

1.2.1藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法測定14種抗菌藥物對受試菌株的最低抑菌濃度（MIC）?？咕幬锇懒_培南、亞胺培南、厄他培南、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林-他唑巴坦、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、磷霉素、阿米卡星、多黏菌素、替加環(huán)素。

1.2.2PCR檢測碳青霉烯類耐藥基因

1.2.2.1DNA模版制備 從血瓊脂培養(yǎng)皿挑取單個受試菌菌落加入5 mL的LB肉湯培養(yǎng)液中，37 ℃、100 r/ min恒溫振蕩培養(yǎng)18～20 h，搜集4 mL菌液。其余具體步驟參照DNA提取試劑盒說明書。

1.2.2.2PCR擴增目的基因反應體系及循環(huán)條件 PCR 擴增引物序列見表1。PCR 反應體系如下 ：取基因組 DNA 為模板 5 μL（10 ng/μL），加入引物 F（20 μmol/L）0.5 μL，引物 R（20 μmol/L）0.5 μL，2×Taq PCR masterMix 12.5 μL， 無 菌純水加至 25 μL，配制 25 μL 反應體系。PCR 反應條件：預變性94 ℃×5 min；循環(huán)94 ℃×30 s，61 ℃×30 s， 72 ℃×30 s，共 30個循環(huán)；最后延伸72 ℃×10 min。不同類型碳青霉烯酶基因的PCR反應條件有所不同，參考文獻[1-6]。

1.2.2.3PCR產物純化及測序 PCR產物交上海生工生物技術有限公司純化及雙向測序。測序得到的基因片段拼接后采用Bioedit軟件進行序列比對和網上相似性檢索分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。

1.2.3MLST PCR 引物參照MLST Pasteur專業(yè)網站設計的肺炎克雷伯菌7個管家基因引物（gapA、infB、rpoB、phoE、mdh、pgi、tonB），見有限公司產品，小量DNA抽提純化試劑盒、DNA marker、2×Taq PCR MasterMix為北京天根生化科技有限公司產品，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。表2。PCR總反應體系同前。反應條件：94 ℃預變性 2 min ；94 ℃變性 30 s，50 ℃復性 1 min，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸7 min。PCR產物交上海生工生物技術有限公司純化及雙向測序，7個管家基因（gapA、infB、rpoB、phoE、mdh、pgi、tonB）的序列與 MLST數據庫（http：//www.mlst.net）中已知的肺炎克雷伯菌的等位基因序列相比，獲得相應的序列號。ST序列數據間的親緣關系使用eBURST V3軟件（http：//eburst.mlst.net）分析。

表1 碳青霉烯酶基因引物名稱、序列、長度及參考文獻Table 1 PCR primers for amplifying carbapenemase genes

表2 肺炎克雷伯菌多位點序列分型7個管家基因所用引物Table 2 PCR primers for amplifying the 7 housekeeping genes inK. pneumoniaeisolates

1.2.4臨床資料的收集 查閱本次收集的61份感染CR-KPN菌株患者的臨床資料，對每例病史進行詳細的信息記錄和收集。

1.2.5統(tǒng) 計 分 析 利 用Microsoft Excel 2003 、SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析。比較ST11型和其他ST分型各自的臨床特點，進行單因素分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 菌株對14種抗菌藥物的敏感性分析

61株CR-KPN對頭孢菌素及β內酰胺-酶抑制劑復合制劑（哌拉西林-他唑巴坦）的耐藥率均＞80 %；對碳青霉烯類抗生素厄他培南耐藥率為100 %，對美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別為78.7 %和70.5 %，有29株對兩者同時耐藥；耐藥率最低的是多黏菌素和替加環(huán)素，分別為14.8 %和19.7 %。見表3。

表3 菌株對14種抗菌藥物的敏感性分析Table 3 Susceptibility ofK. pneumoniaeisolates to antimicrobial agents

2.2 碳青霉烯酶耐藥基因檢測結果

經PCR檢測和DNA測序，61株臨床分離菌中，共檢出51株攜帶碳青霉烯酶基因。其中，產KPC型碳青霉烯酶有40株，均為KPC-2型。產金屬酶包括IMP型酶基因9株，均為IMP-4型酶基因；產NDM型酶基因4株，均為NDM-6型。有3株菌株同時產KPC-2及IMP-4型酶基因。所有菌株中GES、SME、IMI、VIM-2、OXA-48碳青霉烯酶基因檢測均為陰性。

2.3 肺炎克雷伯菌的MLST

61株CR-KPN進行MLST，對其內部7個管家基因片段：rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB進行PCR擴增和DNA測序，與Pasteur網站內的標準序列進行比對，結果見表4。除去3株測序失敗，根據MLST技術檢測，58株CRKPN共18種ST序列型，其中8株細菌無法與數據庫中已知的ST序列比對成功，已向http：//www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/index.html網站提交該序列，獲得新的序列型別，分別為 ST2033、ST2135、ST2193（3株 ）、ST2194、ST2195、ST2196。

ST序列數據間的親緣關系使用eBURST V3軟件（http：//eburst.mlst.net）分析，如果在7個管家基因中僅相差l～3個差異基因型，則認為這2種ST型有親緣關系，在eBURST圖上會呈現各個點之間的連線（圖1）。ST1711、ST2193、ST2194、ST2195起源于ST11，并且親緣性很近。結合菌株ST序列型的時間和空間分布，同一時間段同一所醫(yī)院以相同克隆流行為主（表4）。結合藥敏試驗結果，美羅培南對ST11型菌株的MIC50、MIC90均高于非ST11型。亞胺培南的藥敏結果顯示ST11型的MIC50、MIC90亦高于非ST11型。結合碳青霉烯酶的檢測，大部分ST11型菌株攜帶KPC-2型碳青霉烯酶（29/32，90.6 %），4株ST1型檢測出NDM-6碳青霉烯酶，3株ST17攜帶IMP-4型碳青霉烯酶。

2.4 臨床資料統(tǒng)計分析結果

61株CR-KPN菌株感染的患者中，剔除5份患者的病史資料信息不全和同一患者多次分離的菌株（其中包括5 株菌株均分離自同1例患者、4株菌株均分離自同1例患者、3 株菌株均分離自同1例患者、2株菌株均分離自同1例患者4例），余43份病史資料保存完整。

CR-KPN菌株感染的患者男28例，女15例，平均年齡64歲。臨床分離的菌株標本類型以呼吸道分泌物和尿液為主，分別占58.1 %（25 / 43）和14.0 %（6 / 43），分離自血液、腹水、引流液、腦脊液、分泌物、灌洗液、胸水的標本分別占9.3 %（4 / 43）、4.7 %（2 / 43）、4.7 % （2 / 43）、2.3 % （1 / 43）、2.3 %（1 / 43）、2.3 % （1 / 43）、2.3 % （1 / 43）。送檢的臨床科室主要集中在重癥醫(yī)學科（23 例，53.5 %）和神經外科（6例，14.0 %）。65.1 %患者在住院期間更換過床位。超過60 %患者于ICU接受過治療，治療過程中患者接受過的有創(chuàng)性操作包括：靜脈穿刺（72.1 %）、導尿管留置（72.1 %）、引流管留置（48.8 %）和氣管切開（46.5 %）。菌株分離前使用最多的抗菌藥物為第三代頭孢菌素及酶抑制劑復合制劑（88.4 %）和碳青霉烯類抗菌藥物（60.5 %）。67.4 %患者同時還攜帶其他類型的耐藥菌株，其中以鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌最常見。

圖1 利用eBURST軟件分析18種ST型相互關系Figure 1 The eBURST diagram showing the relationship between the 18 sequence types ofK. pneumoniaeisolates

表4 58株肺炎克雷伯菌的MLST分型Table 4 Multilocus sequence typing of 58Klebsiella pneumoniaeisolates

2.5 單因素分析

剔除3例ST測序失敗的臨床資料，將收集到的40份臨床資料分為ST11組（n=23）和非ST11組（包括ST1，ST37等）（n=17），分別進行統(tǒng)計，兩組患者在年齡、性別、基礎疾病方面差異無統(tǒng)計學意義。ST11組患者在ICU接受治療所占的比例及機械通氣的使用率高于非ST11組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.015、0.042）。兩組患者大部分在治療過程中接受過包括靜脈穿刺、導尿管留置、引流管留置、氣管切開等有創(chuàng)性操作，在菌株分離前應用過頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素，然而兩組間這些臨床特點差異均無統(tǒng)計學意義。兩組的預后方面，ST11組的病死率高于非ST11組（43.4 %，17.6 %），但差異無統(tǒng)計學意義。見表5。

3 討論

目前世界范圍內肺炎克雷伯菌的ST分型已經超過2 000種，美國、挪威、瑞典等歐美國家CRKPN的ST型主要為ST258[7]，國內Qi等[8]2012年的研究發(fā)現我國CR-KPN MLST主要的流行序列型為ST11， 而研究分析發(fā)現ST11和ST258僅有1個管家基因（tonB）的差別，具有較近的親緣關系，屬于同一個克隆復合體CC258。與國內的研究相一致，本實驗菌株仍以ST11（32 / 61， 53.3 %）為主，結合前期的藥敏試驗結果ST11型菌株對美羅培南、亞胺培南的MIC50、MIC90均高于非ST11型，由此推斷ST11型對碳青霉烯類抗生素的耐藥率偏高，需要進一步大樣本試驗證實。碳青霉烯酶的檢測提示ST11型中以KPC-2酶為主，說明STl1型肺炎克雷伯菌可能非常容易獲得編碼KPC-2基因的質粒，并且大規(guī)模流行，應引起重視。

研究中還發(fā)現了6種ST序列型世界范圍內尚未有報道，已將數據提交注冊，分別給予命名ST2033、ST2135、ST2193、ST2194、ST2195、ST2196。 同 時eBURST分 析 發(fā) 現ST2193、ST2194、ST2195與ST11緊密相連，提示有很密切的親緣性。新型ST的發(fā)現提示CR-KPN存在克隆性和多樣性，應隨時進行密切關注和監(jiān)測。

結合本研究的臨床資料發(fā)現在同一時期同一所醫(yī)院以某一ST序列型為主，如2014年中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院分離的菌株以ST11（9 / 17）為主，中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院分離的菌株以ST25（2 / 4）為主，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院以ST17（3 / 6）為主。同時發(fā)現在某些區(qū)域集中時間段內以相同克隆流行為主，如2014年中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院分離的17株肺炎克雷伯菌（ST分 型 分 別 為 ST11、ST2193、ST2194、ST2195、ST1855、ST869、ST45）， 其 中 在 2014年 3月至6月ICU集中分離了14株菌株，ST序列分別為 ST11、ST2193、ST2194和 ST2195， 通 過 等位基因的比較發(fā)現，ST2193、ST2194、ST2195與ST11僅有1個等位基因存在差異， eBURST分析提示具有很近的親緣性，屬于相同克隆，提示ST11型該克隆有在該區(qū)域流行的趨勢，應引起臨床的高度重視，及早進行該克隆的監(jiān)測和預防，避免廣泛傳播。

研究同時回顧性收集了 CR-KPN 菌株感染患者的臨床資料，發(fā)現CR-KPN感染的患者年齡均偏大（平均年齡65歲），高齡患者通?；A疾病較多、免疫力低下、住院時間長，容易成為腸桿菌科細菌感染侵襲的主要對象。研究同時發(fā)現超過60 %患者接受過ICU的治療，由于入住ICU患者多存在多臟器受累，呼吸機輔助通氣、侵襲性操作的應用很頻繁，治療上經常給予多種抗菌藥物、糖皮質激素及靜脈營養(yǎng)液，這些都有可能作為危險因素促成耐藥菌的出現。相關研究也已經表明長時間留住ICU是感染CR-KPN的獨立危險因素[9-11]。

研究還發(fā)現CR-KPN菌株感染的患者常攜帶以鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌為代表的多種病原體。一方面，臨床上針對這部分病原體通常給予多種廣譜抗生素的治療，而抗生素的廣泛使用已被公認是導致耐藥菌感染的危險因素之一[9，12-13]，本次調查中，菌株分離前使用最多的抗菌藥物為第三代頭孢菌素及酶抑制劑復合制劑（88.4 %）和碳青霉烯類抗菌藥物（60.5 %），使得腸桿菌科細菌更易于定植或感染，細菌耐藥性不斷增強。另一方面，一些研究還發(fā)現耐藥基因可通過質粒在不同的細菌種屬間進行轉移播散[2]，導致耐藥菌屬擴大，給臨床治療造成極大的困難。

結合ST分型，分別研究ST11組和非ST11組的臨床資料發(fā)現，ST11組患者在ICU接受治療所占的比例及機械通氣的使用率高于非ST11組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.015、0.042）。由此可以推斷入住ICU、接受機械通氣是CR-KPN（特別是ST11型菌株）感染的危險因素，結合前期的藥敏試驗結果ST11型菌株更容易對碳青霉烯類抗生素耐藥且MIC值較高，給治療帶來極大的挑戰(zhàn)。

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Multilocus sequence typing of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates and its utility in pro filing clinical infections

WU Na, TIAN Sufei, CHU Yunzhuo, CHEN Baiyi, LIU Liwen, ZHANG Zhijie, WANG Jing, XIAO Xiaoguang,LU Juan. （Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001, China）

R378.996

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0509-07

10.16718/j.1009-7708.2017.05.005

2016-11-30

2017-01-17

1. 中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科，沈陽 110001；*檢驗科；

2. 遼寧省人民醫(yī)院檢驗科；

3. 中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院；

4. 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科；

5. 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科。

吳娜（1983—），女，博士，講師，主要從事感染性疾病研究和診治。

陳佰義，E-mail：Chenbaiyi63@163.com。