ZnO納米粒子抑制體外小鼠光感受器細(xì)胞MnSOD的表達(dá)及活性

孫園園，郭大東，劉濱，丁紅燕，徐溢，畢宏生,*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 2500142. 山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所，濟(jì)南 2500023. 淮陰工學(xué)院 江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮安 2230034. 山東大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012

ZnO納米粒子抑制體外小鼠光感受器細(xì)胞MnSOD的表達(dá)及活性

孫園園1，郭大東2，劉濱1，丁紅燕3，徐溢4，畢宏生2,*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 2500142. 山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所，濟(jì)南 2500023. 淮陰工學(xué)院 江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮安 2230034. 山東大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料在生物醫(yī)藥以及化工中已得到廣泛應(yīng)用。作為一類(lèi)新型材料，其安全性也日益受到人們的高度關(guān)注。為探索氧化鋅(ZnO)納米粒子對(duì)小鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的毒性作用，本文通過(guò)MTT、熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等技術(shù)，分別對(duì)經(jīng)不同濃度ZnO納米粒子處理的小鼠光感受器細(xì)胞活性、活性氧水平、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)的基因和蛋白表達(dá)及活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，ZnO納米粒子可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，降低線粒體膜電位，導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞損傷；ZnO納米粒子能顯著減少M(fèi)nSOD在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，降低MnSOD活性，加劇氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。因此，氧化應(yīng)激水平的提高導(dǎo)致了過(guò)量的活性氧產(chǎn)生及MnSOD表達(dá)和活性的下降，與ZnO納米粒子引起的細(xì)胞毒性作用有關(guān)。

氧化鋅納米粒子；小鼠光感受器細(xì)胞；線粒體；活性氧；錳超氧化物歧化酶

ZincOxideNanoparticlesInhibittheExpressionandActivityofMnSODinMurinePhotoreceptorCellsinVitro

Sun Yuanyuan1, Guo Dadong2, Liu Bin1, Ding Hongyan3, Xu Yi4, Bi Hongsheng2,*

1. The Second Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, China2. Eye Institute of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250002, China3. Jiangsu Provincial Key Laboratory for Interventional Medical Devices, Huaiyin Institute of Technology, Huaian 223003, China4. School of Clinical Medicine, Shandong University, Jinan 250012, ChinaReceived29 November 2016accepted5 January 2017

Abstract: Nanomaterials have been widely used in areas of biology, pharmacy and chemical industry due to its rapid development. As a new type of material, the toxicity of nanomaterials is also attracting enormous attention. In the present study, the effects of ZnO nanoparticles (NPs) on murine photoreceptor cell viability and on the expression and activity of MnSOD were investigated by using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, fluorescent analysis, flow cytometry, quantitative real-time PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) techniques. ZnO NPs exhibited high cytotoxicity on the target cells in concentration- and time-dependent manners. ZnO NPs elevated intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) and collapsed the mitochondrial membrane potential, thus leading to murine photoreceptor cell damage. Moreover, ZnO NPs significantly reduced the expression of MnSOD at both mRNA and protein levels, attenuated its activity, and further aggravated the oxidative stress-mediated cell damages. Overall, ZnO NPs-induced cytotoxicity on murine photoreceptor cells was closely associated with elevated levels of oxidative stress via the overproduction of ROS and decreased expression and activity of MnSOD.

Keywords: zinc oxide nanoparticle; murine photoreceptor cell; mitochondrion; reactive oxygen species; manganese superoxide dismutase

目前，氧化鋅(ZnO)納米粒子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用已受到廣泛關(guān)注，研究已證實(shí)ZnO納米粒子具有較強(qiáng)的抗糖尿病[1-2]和抗癌作用[3-5]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，ZnO納米粒子可通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)損傷宿主DNA，進(jìn)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生潛在的基因毒性[6-9]。大量研究表明，納米材料在未進(jìn)入細(xì)胞前，對(duì)細(xì)胞的局部環(huán)境造成損傷；進(jìn)入細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞、基因都存在潛在的損傷和危害[10]。雖然目前對(duì)ZnO納米粒子的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但其作用機(jī)制仍不清楚。

氧化應(yīng)激是由活性氧的生成和抗氧化防御之間的失衡造成的，而線粒體在活性氧的產(chǎn)生和清除過(guò)程中占重要地位[11]。為保護(hù)機(jī)體免受活性氧的有害影響，細(xì)胞進(jìn)化出許多防御機(jī)制，包括具有清除活性氧能力的酶(如過(guò)氧化氫酶)和用于去除過(guò)氧化氫或過(guò)氧化物歧化酶的多種過(guò)氧化物酶，以消除過(guò)氧化物自由基[12]。超氧化物歧化酶(SOD)是一種線粒體內(nèi)清除自由基的酶，在線粒體中調(diào)控細(xì)胞器產(chǎn)生活性氧的類(lèi)型，調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原平衡，以維持正常的線粒體功能[13]。

氧化應(yīng)激可以明顯促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，過(guò)量的活性氧被認(rèn)為是由納米材料介導(dǎo)細(xì)胞毒性中最重要的損傷機(jī)制之一[14-15]。線粒體中存在清除活性氧的各種抗氧化酶系統(tǒng)，其中錳超氧化物歧化酶(MnSOD)是線粒體抗氧化酶中重要的活性氧清除酶[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了ZnO納米粒子對(duì)活性氧的產(chǎn)生和MnSOD表達(dá)的影響，并進(jìn)一步闡釋了ZnO納米粒子介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和通過(guò)放大氧化應(yīng)激來(lái)降低MnSOD表達(dá)及活性的作用機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑和材料

ZnO納米粒子(上海譜振生物科技有限公司，純度大于99.7%)，661W小鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞(美國(guó)俄克拉荷馬大學(xué)健康衛(wèi)生中心Muayyad教授惠贈(zèng))，胎牛血清(HyClone公司，美國(guó))，自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(TC10，Bio-Rad，美國(guó))，倒置熒光顯微鏡(IX71，Olympus，日本)，場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SU8020，Hitachi，日本)，流式細(xì)胞儀(FACSVerse，BD公司，美國(guó))，酶標(biāo)儀(ELX800，BioTek，美國(guó))，Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó))，RevertAid逆轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas，德國(guó))，SYBR Green I(Takara，日本)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Mx3000P，安捷倫科技有限公司，美國(guó))。引物由Primer5.0軟件設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，錳超氧化物歧化酶ELISA試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)，錳超氧化物歧化酶活性檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))，紫外分光光度計(jì)(UV4802，尤尼科上海有限公司，中國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

661W細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(1.0 g·L-1葡萄糖，10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素)中，條件為37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)一用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。

1.3 MTT分析

為研究ZnO納米粒子對(duì)661W細(xì)胞活性的影響，實(shí)驗(yàn)組將661W的細(xì)胞接種于96孔板(每孔1.0×104細(xì)胞)中。培養(yǎng)過(guò)夜后，各組細(xì)胞分別用濃度為0、31.25、62.5和125.0 μmol·L-1的ZnO納米粒子溶液干預(yù)，對(duì)照組細(xì)胞不加入ZnO納米粒子。細(xì)胞均在37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。每天使用倒置相差顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)，到達(dá)指定的培養(yǎng)時(shí)間后，各孔的細(xì)胞中分別添加20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后去除上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)并振搖10 min，然后用酶標(biāo)儀在490 nm(參考650 nm)處測(cè)定吸光度值。細(xì)胞活性計(jì)算公式如下：細(xì)胞活性(%)=[A]實(shí)驗(yàn)組/[A]對(duì)照組×100%，A代表吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，用2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測(cè)ZnO納米粒子對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響。將661W細(xì)胞接種于6孔板(每孔3.0×105細(xì)胞)中，培養(yǎng)過(guò)夜，棄掉上清液，分別用濃度0、31.25、62.5和125.0 μmol·L-1ZnO納米粒子干預(yù)細(xì)胞2 h，然后PBS洗2遍，加入DCFH-DA溶液后37 ℃避光溫育30 min，再用PBS洗2遍后上機(jī)檢測(cè)。用525 nm的熒光檢測(cè)各組細(xì)胞信號(hào)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.5 線粒體膜電位分析

線粒體膜電位是細(xì)胞內(nèi)負(fù)外正的電位差，是反映線粒體功能狀態(tài)的直觀指標(biāo)，正常生理情況下保持穩(wěn)態(tài)，當(dāng)納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞損傷線粒體時(shí)，會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位降低[17]。使用親脂性陽(yáng)離子探針(JC-1)可在各種刺激條件下進(jìn)行線粒體膜電位的測(cè)定。在正常細(xì)胞中，當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1可以聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)并產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1成為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光。在早期的細(xì)胞凋亡中，線粒體膜電位降低導(dǎo)致JC-1聚合物不能聚集在線粒體中，從而失去紅色熒光。因此，紅綠熒光的比率可表明線粒體膜電位的變化。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將661W細(xì)胞接種于6孔板中(密度為2×105細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)過(guò)夜，加入不同濃度(即0，31.25，62.5，125.0 μmol·L-1)的ZnO納米粒子溶液2 mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后用PBS洗2遍，然后加入JC-1染色工作液，37 ℃條件下繼續(xù)孵育20 min。孵育完成后，加入PBS緩沖液漂洗細(xì)胞2～3次，然后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體膜電位的情況。

1.6 MnSOD mRNA的表達(dá)

將661W細(xì)胞接種于6孔板(密度為5×105細(xì)胞/孔)中培養(yǎng)過(guò)夜，加入不同濃度(即0，31.25，62.5，125.0 μmol·L-1)的ZnO納米粒子溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗后，加入Trizol溶液，提取細(xì)胞的總RNA，微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，使用RevertAid逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA。將cDNA樣品與SYBR Green I等溶液配成20 μL的PCR反應(yīng)體系，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列如下：MnSOD，上游引物5′-gtggtggagaacccaaagga-3′，下游引物5′- gcgtgctcccacacatcaat-3′；GAPDH，上游引物5′-gaccacagtccatgacatcact-3，下游引物5′-tccaccaccctgttgctgtag-3′。PCR程序設(shè)置如下：95 ℃ 10 min，95 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸為30 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算661W細(xì)胞MnSOD基因表達(dá)倍數(shù)的變化。

1.7 測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MnSOD蛋白質(zhì)水平和活性

用不同濃度(即0，31.25，62.5，125.0 μmol·L-1)ZnO納米粒子與661W細(xì)胞共培養(yǎng)6 h，然后PBS洗滌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，4 ℃、4 000 g條件下離心收集細(xì)胞，重懸于冷的PBS溶液中，冰浴超聲15 min，5 000 g離心，取上清液100 μL，ELISA檢測(cè)細(xì)胞中MnSOD蛋白水平；取上清液50 μL，用MnSOD活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定MnSOD的活性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)來(lái)自至少3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表示為平均值±SD(標(biāo)準(zhǔn)差)，One-way ANOVA和Dunnett用于顯著性檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 ZnO納米粒子的表征

通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡獲得ZnO納米粒子的形貌圖(如圖1A)；通過(guò)馬爾文激光粒度儀測(cè)量粒子大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZnO納米粒子分布范圍在15到50 nm，平均粒徑為30 nm(如圖1B)。

2.2 細(xì)胞生存率測(cè)定

首先，分析ZnO納米粒子對(duì)661W細(xì)胞活性的影響。倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，ZnO納米粒子干預(yù)組細(xì)胞的數(shù)量均下降，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮。ZnO納米粒子在靶細(xì)胞中的濃度越高，對(duì)細(xì)胞生存率抑制作用越強(qiáng)(圖2A～D)；MTT分析的結(jié)果顯示，隨著ZnO納米粒子濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞生存率明顯降低(圖2E)。

圖1 ZnO納米粒子表征圖(A)和粒子大小分布(B)Fig. 1 Image of ZnO nanoparticles characterized by a field emission scanning electron microscope (A) and the histogram of size distribution determined by a Malvern Zetasizer (B)

圖2 不同濃度的ZnO納米粒子對(duì)小鼠光感受器細(xì)胞生存率的抑制作用注：A為正常對(duì)照組；B為31.25 μmol·L-1 ZnO干預(yù)組；C為62.5 μmol·L-1 ZnO干預(yù)組；D為125.0 μmol·L-1 ZnO干預(yù)組； E為小鼠光感受器細(xì)胞經(jīng)不同濃度的ZnO納米粒子干預(yù)不同時(shí)間后的細(xì)胞生存率。 A～D的干預(yù)時(shí)間為72 h，且標(biāo)尺為20 μm；＊P<0.05，與正常對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fig. 2 Different concentrations of zinc oxide nanoparticles inhibit the viability of photoreceptor cellsNote: A, untreated cells; B, cells treated with 31.25 μmol·L-1 of ZnO NPs; C, cells treated with 62.5 μmol·L-1 of ZnO NPs; D, cells treated with 125.0 μmol·L-1 of ZnO NPs; E, histogram of cell viability determined by MTT assay. For A-D, treatment time is 72 h, and bar = 20 μm. For E, * P < 0.05 versus relevant control samples.

2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化

在不同濃度的ZnO納米粒子干預(yù)661W細(xì)胞2 h后，細(xì)胞內(nèi)活性氧的表達(dá)水平明顯增高，并呈劑量依賴(lài)性(圖3A～D)。ZnO納米粒子處理后細(xì)胞內(nèi)活性氧的表達(dá)水平與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3E)。

2.4 線粒體膜電位的改變

為探索不同濃度ZnO納米粒子對(duì)661W細(xì)胞的影響，我們進(jìn)一步分析了ZnO納米粒子在干預(yù)靶細(xì)胞24 h后線粒體膜電位的改變，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞具有更高的紅色熒光(在細(xì)胞周?chē)t色熒光密度高，圖4A)；在經(jīng)ZnO納米粒子干預(yù)后靶細(xì)胞線粒體膜電位降低(綠色熒光，圖4B～D)，綠色熒光強(qiáng)度與ZnO納米粒子干預(yù)靶細(xì)胞濃度成比例，表明線粒體膜電位的降低與ZnO納米粒子顯著相關(guān)。

圖3 小鼠光感受器細(xì)胞經(jīng)不同濃度ZnO納米粒子干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)活性氧的表達(dá)增加注：A為正常對(duì)照組；B為31.25 μmol·L-1 ZnO干預(yù)組；C為62.5 μmol·L-1 ZnO干預(yù)組；D為125.0 μmol·L-1 ZnO干預(yù)組； E為小鼠光感受器細(xì)胞經(jīng)不同濃度的ZnO納米粒子干預(yù)2 h后的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。Fig. 3 The expression of reactive oxygen species in murine photoreceptor cells was increased after the intervention of ZnO nanoparticles at different concentrationsNote: A, untreated cells; B, cells treated with 31.25 μmol·L-1 of ZnO NPs; C, cells treated with 62.5 μmol·L-1 of ZnO NPs; D, cells treated with 125.0 μmol·L-1 of ZnO NPs. E, The murine photoreceptor cells after treatment with different concentrations of ZnO NPs for 2 h.

圖4 不同濃度的ZnO納米粒子可降低細(xì)胞線粒體的膜電位注：A為正常對(duì)照組；B為31.25 μmol·L-1 ZnO干預(yù)組；C為62.5 μmol·L-1 ZnO干預(yù)組；D為125.0 μmol·L-1 ZnO干預(yù)組。 E為線粒體膜電位在不同濃度的ZnO納米粒子中的表達(dá)水平。圖中標(biāo)尺為20 μm (A～D)。Fig. 4 The mitochondrial membrane potential of murine photoreceptor cells before and after treatment with different concentrations of ZnO NPsNote: A, untreated cells; B, cells treated with 31.25 μmol·L-1 of ZnO NPs; C, cells treated with 62.5 μmol·L-1 of ZnONPs; D, cells treated with 125.0 μmol·L-1 of ZnO NPs. E, mitochondrial membrane potential level after treatment with different concentrations of ZnO NPs. Bar = 20 μm (A-D).

2.5 MnSOD的mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)減少

Q-PCR檢測(cè)不同濃度的ZnO納米粒子對(duì)細(xì)胞內(nèi)MnSOD mRNA表達(dá)水平的影響。如在圖5A中所示，細(xì)胞內(nèi)MnSOD mRNA表達(dá)的減少與ZnO納米粒子的濃度相關(guān)。31.25、62.5和125.0 μmol·L-1的ZnO納米粒子干預(yù)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)MnSOD的mRNA表達(dá)水平分別下降至0.384、0.225和0.076倍，對(duì)照組和ZnO納米粒子處理組細(xì)胞之間存在著顯著性差異(如圖5A)。

ELISA檢測(cè)不同濃度的ZnO納米粒子干預(yù)661W細(xì)胞后MnSOD蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。圖5B顯示在0、31.25、62.5和125.0 μmol·L-1的ZnO納米粒子干預(yù)處理后，661W細(xì)胞內(nèi)MnSOD蛋白水平從56.23 ng·mL-1分別下降到39.08、19.11和12.79 ng·mL-1，說(shuō)明MnSOD蛋白的表達(dá)水平隨著ZnO納米粒子的濃度的增加而降低(如圖5B)。

2.6 細(xì)胞內(nèi)MnSOD活性的降低

與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng)不同濃度ZnO納米粒子處理的細(xì)胞中MnSOD活性降低。圖6表明，經(jīng)0、31.25、62.5和125.0 μmol·L-1的的ZnO納米粒子處理后，MnSOD活性從79.30 U·mL-1分別減少到41.18、26.48和15.02 U·mL-1，表明ZnO納米顆粒能顯著降低MnSOD活性。

3 討論(Discussion)

前期研究發(fā)現(xiàn)，氧化鈰納米粒子能降低過(guò)氧化氫引起的氧化應(yīng)激，使光感受器細(xì)胞的生存率升高[18]。另有研究表明，硫化鋅納米粒子能顯示出劑量依賴(lài)性細(xì)胞毒性，導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷[19]；ZnO納米粒子誘導(dǎo)的活性氧可對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而造成細(xì)胞損傷[20]，因此ZnO納米粒子可能通過(guò)參與氧化應(yīng)激，對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[20-22]。因此，我們研究了ZnO納米粒子對(duì)小鼠光感受器細(xì)胞(661W)的活性和MnSOD的表達(dá)及活性的影響。

研究已證明，金屬氧化物納米粒子通過(guò)增加活性氧的生成導(dǎo)致細(xì)胞毒性。線粒體功能障礙是由于線粒體膜電位的降低導(dǎo)致線粒體去極化和多個(gè)促凋亡蛋白釋放到胞質(zhì)中，進(jìn)而激活凋亡通路[23]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)活性氧的主要來(lái)源，線粒體膜電位和活性氧可以為檢測(cè)細(xì)胞的生理狀態(tài)和線粒體的功能提供重要的線索[24]。我們研究發(fā)現(xiàn)，ZnO納米粒子處理組可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位的降低，ZnO納米粒子的濃度越高，靶細(xì)胞的線粒體膜電位越低。這一結(jié)果表明，活性氧引起的氧化應(yīng)激是ZnO納米粒子促進(jìn)661W細(xì)胞死亡的重要機(jī)制。

正常細(xì)胞內(nèi)的MnSOD能夠維持正常的線粒體功能和清除過(guò)多的活性氧，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。我們的研究結(jié)果表明，ZnO納米粒子處理后的靶細(xì)胞中產(chǎn)生了大量的活性氧，且MnSOD表達(dá)水平和活性均降低。同時(shí)，MnSOD的表達(dá)和活性降低不能及時(shí)清除過(guò)多的活性氧，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的積累?；钚匝跛降脑龈呖赏ㄟ^(guò)破壞DNA、脂類(lèi)和蛋白質(zhì)，影響細(xì)胞代謝，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，最后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死。

綜上所述，ZnO納米粒子可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并呈劑量依賴(lài)性。ZnO納米粒子干預(yù)的靶細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，高水平的活性氧導(dǎo)致線粒體膜電位下降，抑制MnSOD mRNA、蛋白的表達(dá)和活性，MnSOD表達(dá)水平和活性的降低導(dǎo)致無(wú)法清除過(guò)量的活性氧，進(jìn)而引起活性氧積累與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

圖5 不同濃度的ZnO納米粒子對(duì)MnSOD mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制作用Fig. 5 The expression of MnSOD at mRNA and protein levels during the ZnO nanoparticle treatment

圖6 不同濃度的ZnO納米粒子對(duì)MnSOD活性的抑制作用Fig. 6 Determination of MnSOD activity after treatment with different concentrations of ZnO nanoparticles

致謝：感謝江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金課題(jr1602)資助。

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10.7524/AJE.1673-5897.20161129001

2016-11-29錄用日期2017-01-05

1673-5897(2017)3-747-08

X171.5

A

畢宏生(1960-)，男，博士，泰山學(xué)者崗位教授、主任醫(yī)師，主要從事眼科臨床、教學(xué)與科研，發(fā)表SCI論文80余篇。

江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金課題資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)jr1602)；山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：XTCX2014A04-04)

孫園園(1992-)，女，2015級(jí)在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榘變?nèi)障及屈光不正，E-mail: yankesyybs@163.com;

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: hongshengbi1@163.com

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