5-氟尿嘧啶聚乳酸緩釋片的處方篩選及體外釋藥機(jī)制研究Δ

崔麗珺，黃潔，李興華，康前雁（.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，西安7006；.西安市食品藥品檢驗所，西安 70054；.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，西安 70004）

5-氟尿嘧啶聚乳酸緩釋片的處方篩選及體外釋藥機(jī)制研究Δ

崔麗珺1＊，黃潔2，李興華3，康前雁1（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，西安710061；2.西安市食品藥品檢驗所，西安 710054；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，西安 710004）

目的：篩選5-氟尿嘧啶（5-FU）聚乳酸（PLA）緩釋片（5-FU-PLA-DS）的處方，研究其體外釋藥機(jī)制。方法：采用紫外分光光度法測定釋放介質(zhì)中5-FU含量，以模擬體液為釋放介質(zhì)，于37℃水浴中進(jìn)行體外釋放試驗。以分子量分別為3 000、6 000、10 000、15 000和20 000的PLA，制備載藥量分別為1.5、2.5、3.0 mg/片，直徑3.0 mm、厚1.0 mm的15種圓形5-FU-PLA-DS；以有效濃度持續(xù)釋放時間與累積釋放度為指標(biāo)，篩選最優(yōu)處方。采用掃描電鏡觀察5-FU-PLA-DS釋藥后的形態(tài)，評價其釋藥機(jī)制。結(jié)果：最優(yōu)處方中PLA的分子量為20 000，載藥量為3.0 mg/片；所制5-FU-PLA-DS可釋放119 d，累積釋放度為100.63%，有效濃度持續(xù)釋放91 d。掃描電鏡觀察顯示，5-FU-PLA-DS表面的微球最先接觸釋放介質(zhì)而進(jìn)行蝕解、釋放藥物，待外層的微球和微球之間的PLA降解后才逐漸暴露出內(nèi)層的微球進(jìn)行釋藥，其釋藥機(jī)制主要為溶蝕和擴(kuò)散。結(jié)論：成功制得5-FU-PLA-DS，其有效濃度持續(xù)釋放時間長，能夠由外向內(nèi)有步驟地降解，實(shí)現(xiàn)不同層次微球的非同步釋藥。

5-氟尿嘧啶；聚乳酸；緩釋片；體外釋放度；掃描電鏡

濾過性手術(shù)（Glaucoma filtration surgery，GFS）是治療青光眼最常用的手術(shù)方式之一，但術(shù)后2年內(nèi)的失敗率仍達(dá)15%～25%，主要原因是成纖維細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外間質(zhì)中的膠原和葡糖胺聚糖大量合成，導(dǎo)致濾過道瘢痕化[1]。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是臨床上公認(rèn)的、能有效抑制青光眼濾過泡纖維化的抗代謝藥物[2]，但是由于頻繁結(jié)膜下注射，且單次注射造成結(jié)膜下藥物濃度過高，易引起角膜、結(jié)膜毒性反應(yīng)和濾過過暢。以可生物降解的生物材料為載體，包載抗代謝藥物、抑制纖維血管增生關(guān)鍵因子或抗體的緩控釋制劑，是目前青光眼抗瘢痕治療研究的新趨勢[3]。就5-FU這一經(jīng)典的抗代謝藥物來說，微球制劑的發(fā)展已經(jīng)比較成熟，能夠做到粒徑均勻、緩釋效果明顯，但是總的載藥量較少、釋藥時間短[4-6]。而報道的結(jié)膜下植入型片劑、膜劑，含藥量雖然很高，但由于是采用單純物理混合或壓制而成，釋藥速度過快、釋放時間亦短；此外釋放速度快會造成局部藥物濃度過高，增加并發(fā)癥的發(fā)生率[7-9]。本研究以5-FU和不同分子量聚乳酸（Poly lactic acid，PLA）為原料，制備5-FU-PLA緩釋片（5-FU-PLA sustained-release discs，5-FU-PLA-DS），并建立體外釋放度的測定方法，考察其體外釋藥情況及釋放后的形態(tài)變化，研究其釋藥機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

TU-1901型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；YKH-3型液體快速混合器（北京鴻泰順達(dá)科技有限公司）；DT5-4C型離心機(jī)（北京時代北利離心機(jī)有限公司）；BSA124S-CW型萬分之一天平[賽多利斯（中國）有限公司]；MS105型十萬分之一天平[梅特勒托利多（中國）有限公司]；JSM-840型掃描電鏡（日本Jeol公司）。

1.2 藥品與試劑

外消旋PLA（山東省醫(yī)療器械研究所，批號：15031801、15031802、15031807、15031808、15031809，分子量：3 000、6 000、10 000、15 000、20 000）；山梨糖醇酐單油酸酯（司盤80，上海紀(jì)寧生物科技有限公司，分析純）；5-FU對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：08052897，純度：100%）；5-FU原料藥（上海瀚思化工有限公司，批號：A106011217，純度：98.5%）；二氯甲烷（天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；石油醚（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；鹽酸（西安市化學(xué)試劑廠，分析純）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 5-FU-PLA-DS的制備

將5-FU原料藥充分研磨，200目篩網(wǎng)過篩后干燥備用。稱取處理過的5-FU原料藥，懸浮于含PLA及司盤80的二氯甲烷3 mL中，在液體快速混合器的高速攪拌下緩慢滴加石油醚15 mL（10～15滴/min）；待過量載體使微球聚積沉淀而上層液變清透后，再加入石油醚15 mL，固化10 min。3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心15 min，將白色糊狀、質(zhì)地均勻的沉淀物取出，置于表面涂有少許甘油的玻璃模具（3.0 cm×2.5 cm×1.0 mm）中，稍微加壓使其充滿模具。表面干燥后，以直徑3.0 mm的管狀模具進(jìn)行切割，50℃烘箱干燥。同時，按照上述方法制作與5-FU-PLA-DS規(guī)格相同，但不含5-FU的PLA空白緩釋片（PLA-DS）。分別用5種分子量（3 000、6 000、10 000、15 000、20 000）的PLA制備不同載藥量（1.5、2.5、3.0 mg/片）的5-FU-PLA-DS，為方便描述和記錄，以代稱表示15種緩釋片，如1.5P3表示5-FU載藥量1.5 mg/片，PLA分子量3 000；3.0P20表示5-FU載藥量3.0 mg/片，PLA分子量20 000；以此類推。不同載藥量的5-FU-PLA-DS的處方組成見表1。

表1 不同載藥量的5-FU-PLA-DS的處方組成Tab 1 Formulation composition of 5-FU-PLA-DS with different drug loading amount

2.2 體外釋放度的測定

2.2.1 模擬體液（Simulated body fluid，SBF）的制備 燒杯中加入750 mL純化水，36.5℃保溫，依次加入7.996 g NaCl、0.350 g NaHCO3、0.224 g KCl、0.228 g K2HPO4·2H2O、0.305 g MgCl2·6H2O、40 mL 1 mol/L的HCl溶液、0.278 g CaCl2、0.071 g Na2SO4，逐個加入，待一種完全溶解后再加入下一種；最后加入6.057 g（CH2OH）3CNH2，加入時應(yīng)一點(diǎn)一點(diǎn)加，每次不超過1 g，避免局部pH值增加；攪拌均勻，36.5℃時調(diào)節(jié)pH至7.5左右，然后再用1 mol/L的HCl溶液將pH調(diào)至7.25；轉(zhuǎn)移到1 000 mL量瓶中，用純化水定容至刻度，搖勻，5～10℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取5-FU對照品2.5 mg，置于10 mL量瓶中，加SBF使溶解并定容至刻度，制備成0.25 mg/mL的對照品貯備液。移取對照品貯備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于5 mL量瓶中，加SBF定容至刻度，制備成0.005、0.010、0.015、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060 mg/mL的對照品溶液。2.2.3 檢測波長的選擇 取1片5-FU-PLA-DS，溶于二氯甲烷中，振蕩搖勻，SBF萃取。取SBF溶液層，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果，5-FU在203 nm和265.5 nm波長處均有最大吸收?？紤]到SBF的截止波長，最終選擇265.5 nm為5-FU的檢測波長，與《中國藥典》（二部）規(guī)定[10]一致。同樣取1片PLA-DS，按上述方法處理后紫外掃描，結(jié)果上清液在265.5 nm波長處幾乎沒有紫外吸收，表明其對5-FU的測定不造成干擾。2.2.4 線性關(guān)系考察 以PLA-DS的SBF萃取液為空白對照，在265.5 nm波長處依次測定“2.2.2”項下對照品溶液的吸光度（A），并以5-FU的質(zhì)量濃度（x）對A進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝45.496x+0.147 5（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，5-FU檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.005～0.060 mg/mL。

2.2.5 精密度試驗 取0.010、0.030、0.050 mg/mL（低、中、高質(zhì)量濃度）的5-FU對照品溶液，在265.5 nm波長處測定吸光度，第1天內(nèi)測定5次，之后每天測定1次，連續(xù)測定5 d，考察日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液的日內(nèi)RSD分別為0.698%、0.641%、0.509%（n＝5），日間 RSD 分別為 1.534%、1.205%、1.214%（n＝5），滿足相關(guān)規(guī)定要求。

2.2.6 準(zhǔn)確度試驗 取0.010、0.030、0.050 mg/mL（低、中、高質(zhì)量濃度）的5-FU對照品溶液，分別在265.5 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算濃度。以測定值與真實(shí)值之間的比值計算回收率。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液的平均回收率分別為100.01%、98.87%、99.90%，RSD均小于1%（n＝3）。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 制備5-FU質(zhì)量濃度為0.030 mg/mL的SBF溶液（pH 7.4），置于具塞錐形瓶中，37℃恒溫水浴孵育，每天定時取樣，在265.5 nm波長處測定吸光度，連續(xù)測定7 d。結(jié)果，7 d后SBF中5-FU的相對含量仍維持在99.03%，吸光度的RSD＝0.36%（n＝7），表明5-FU在SBF中是比較穩(wěn)定的。

2.3 體外釋放試驗

2.3.1 5-FU飽和溶解度測定 取2 mL SBF置于具塞離心管中，加入過量的5-FU原料藥，超聲使其分散均勻，37℃水浴磁力攪拌。30 min后取樣，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液稀釋后測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算5-FU在SBF中的飽和溶解度，結(jié)果為35.16 mg/mL。所以試驗設(shè)計中設(shè)定的釋放介質(zhì)的體積，完全可以滿足“漏槽”條件。

2.3.2 體外釋放度測定 15種5-FU-PLA-DS隨機(jī)選取6片，稱質(zhì)量后置于一端封口的管狀釋放裝置底部，分別加入SBF釋放介質(zhì)5 mL，37℃水浴中進(jìn)行釋放，定時取樣并補(bǔ)充新鮮SBF。將取出的溶液適當(dāng)稀釋，以PLADS的SBF萃取液作為空白對照，在265.5 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算5-FU的含量，再計算累積釋放度，繪制體外釋放曲線。每周測定標(biāo)準(zhǔn)溶液并校正標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣時間點(diǎn)為：第1天的2、4、8、16、24 h；第1周每日1次；第2周隔日1次；第3～5周每4 d 1次；第6周之后每周1次。第1天2、4、8 h取樣后分別補(bǔ)充新鮮SBF 0.3、0.6、1.0 mL，之后各時間點(diǎn)取樣后均補(bǔ)充新鮮SBF 1.0 mL。最低有效濃度設(shè)定為10 μg/mL[11]，如果日平均釋放濃度＜5 μg/mL并持續(xù)2個時間點(diǎn)，且累積釋放量大于含藥量的90%，則停止取樣。15種5-FU-PLA-DS的體外釋放曲線見圖1，主要體外釋放參數(shù)見表2。

圖1 15種5-FU-PLA-DS的體外釋放曲線（n＝6）Fig 1 The in vitro release curves of 15 species of 5-FU-PLA-DS（n＝6）

從表2可以看出，對于PLA分子量?。? 000、6 000）的緩釋片，載藥量越高，釋放速度越快，有效濃度持續(xù)時間越短，突釋效應(yīng)越明顯（第1天累積釋放度越大）；而PLA分子量大（20 000）的緩釋片，隨著載藥量的增高，有效濃度持續(xù)時間明顯延長且釋放更徹底，突釋效應(yīng)不明顯。綜合考慮，確定5-FU-PLA-DS處方為5-FU載藥量3.0 mg/片，PLA分子量20 000。所制5-FU-PLA-DS可持續(xù)釋藥119 d，有效濃度持續(xù)時間91 d。

表2 15種5-FU-PLA-DS的主要體外釋放參數(shù)Tab 2 Main in vitro release parameters of 15 species of 5-FU-PLA-DS

2.3.3 釋藥形態(tài)觀察 觀察釋放后5-FU-PLA-DS的表面形態(tài)。按“2.3.2”確定的處方制備5-FU-PLA-DS 6片進(jìn)行體外釋放，分別于釋放前和釋藥14、28、56、84 d及釋藥結(jié)束（釋藥119 d）時各取出1片，經(jīng)清洗、烘干，進(jìn)行掃描電鏡觀察其形態(tài)變化，掃描電鏡圖見圖2。

圖2 最優(yōu)處方5-FU-PLA-DS體外釋藥不同時期的掃描電鏡圖Fig 2 Scanning electron microscopy of in vitro release of 5-FU-PLA-DS with optimal formulation in different drug-release time

由圖2可以看出，5-FU-PLA-DS釋藥前表面平整；釋藥14 d表層微球開始蝕解、脫落，留下圓形的空隙；釋藥28 d表層微球完全降解，暴露出深層的微球；釋藥56 d暴露出深層密集的聚積微球和基質(zhì)，并可見裂隙、孔洞向內(nèi)部延伸深；釋藥84 d表面形成許多較大的孔洞，孔洞間通過許多裂隙和通道相互連接；釋藥119 d孔洞內(nèi)的聚積微球消失，孔內(nèi)深部仍有少數(shù)聚積微球。由此推測5-FU-PLA-DS是由聚積的微球構(gòu)成，其釋藥機(jī)制主要為溶蝕和擴(kuò)散。

2.3.4 緩釋片殘余藥量測定 將體外釋放后的緩釋片用二氯甲烷溶解，經(jīng)HCl萃取后，于265.5 nm波長處測定吸光度，計算殘余藥量。結(jié)果測得殘余藥量為（72±6）μg（n＝6），殘余百分?jǐn)?shù)為2.35%。由此可見，所選處方5-FU-PLA-DS的釋放都是比較完全的。

3 討論

5-FU是目前青光眼濾過術(shù)的經(jīng)典輔助用藥，可以明顯提高青光眼手術(shù)的成功率[7]，但頻繁結(jié)膜下注射使患者痛苦，單次注射藥物濃度過高，在抑制濾過泡瘢痕形成的同時，必然不同程度地影響眼部其他代謝旺盛組織，易引起角膜、結(jié)膜毒性反應(yīng)[12]。已有不少學(xué)者致力于研究5-FU生物可降解緩控釋制劑，并進(jìn)行兔眼、猴眼等活體研究，但缺乏以最低有效濃度進(jìn)行長期、穩(wěn)定的釋藥研究。

PLA是合成高分子材料中的一種新型聚合物，具有良好的生物相容性和可降解吸收性，通過調(diào)節(jié)分子量、結(jié)構(gòu)和組成等手段可改變其力學(xué)性能和降解速度，生物可塑性強(qiáng)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床[13]。PLA類載體材料的釋藥主要與藥物分子量及分子量的分布，藥物與PLA的比例，制劑形狀、大小、厚薄、體積及藥物的極性等因素有關(guān)[14]。從筆者研究中也可以看出，隨著PLA分子量增加，有效濃度持續(xù)時間逐漸延長，平均日釋藥濃度降低，突釋效應(yīng)減小；隨著5-FU的載藥量增加，釋藥速度加快，突釋效應(yīng)明顯。

當(dāng)5-FU-PLA-DS接觸SBF后，表層微球首先暴露并降解、釋放藥物，藥物溶解擴(kuò)散后留下的通道使微球更容易降解；而間隔于微球之中的PLA并不含藥或含藥較少，降解速度明顯較慢。從掃描電鏡圖可以證實(shí)，整個5-FU-PLA-DS的降解過程是從外向內(nèi)逐層進(jìn)行：當(dāng)表層微球降解、脫落，遇到過量PLA形成的間隔后，要等待PLA降解暴露出內(nèi)層的微球，再開始溶解釋放藥物。正是這種由外向內(nèi)有步驟地降解、不同層次微球逐漸釋藥，使得5-FU以有效濃度緩慢、平穩(wěn)、長期地釋放，而PLA的分子量控制了整個緩釋片的釋藥速度和時間。

綜上所述，本研究成功制得5-FU-PLA-DS，其有效濃度持續(xù)釋放時間長，能夠由外向內(nèi)有步驟地降解，實(shí)現(xiàn)不同層次微球的非同步釋藥。

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Formulation Screening of 5-fluorouracil Polylactic Acid Sustained-release Tablet and Study on Its in vitro Drug-release Mechanism

CUI Lijun1，HUANG Jie2，LI Xinghua3，KANG Qianyan1（1.Dept.of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Medical College，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China；2.Institute for Food and Drug Control of Xi’an，Xi’an 710054，China；3.Dept.of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Medical College，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China）

OBJECTIVE：To screen the formulation of 5-fluorouracil（5-FU）polylactic acid（PLA）sustained-release discs（5-FU-PLA-DS），and study its in vitro drug-release mechanism.METHODS：UV spectrophotometry was used to determine the 5-FU content in the release medium.Using simulate body fluid as release medium，in vitro drug-release test was conducted under 37℃ water bath.Using PLA with molecular weight of 3 000，6 000，10 000，15 000，20 000，15 species of round 5-FU-PLA-DS with drug containing of 1.5，2.5，3.0 mg/piece and 3.0 mm in diameter and 1.0 mm in thickness were prepared.Using effective concentration sustained release time and cumulative release rate as indexes，the optimal formulation was screened.The form of 5-FU-PLA-DS was observed by scanning electron microscopy after release，and its release mechanism was evaluated.RESULTS：In the optimal formulation，the PLA molecular weight was 20 000 and drug containing was 3.0 mg/piece.The prepared 5-FU-PLA-DS can release for 119 d，with cumulative release degree of 100.63%and effective concentration sustained for 91 d.Scanning electron microscopy showed that the microspheres at the surface were degraded to the release medium first，and then the microspheres of inner layer exposed and release drug gradually after PLA degraded.The main mechanism of drug-release was melting and diffusion.CONCLUSIONS：5-FU-PLA-DS is successfully prepared，with long release time in effective concentration，can be degraded step by step from outside to inside and achieve non-synchronous drug-release of microspheres at different layers.

5-fluorouracil；Polylactic acid；Sustained-release tablet；in vitro drug-release rate；Scanning electron microscopy

R943

A

1001-0408（2017）28-3969-04

2017-05-11

2017-08-07）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81300765）

＊主治醫(yī)師，博士。研究方向：青光眼、白內(nèi)障。電話：029-85323960。E-mail：cuilijun@mail.xjtu.edu.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.22