蛋白酶水解骨素的對比及其優(yōu)化研究

肖龍泉， 王新惠， 李云成， 鄧 婷， 魏祖晨， 劉達(dá)玉

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106)

蛋白酶水解骨素的對比及其優(yōu)化研究

肖龍泉， 王新惠， 李云成， 鄧 婷， 魏祖晨， 劉達(dá)玉

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106)

選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶分別對骨素進(jìn)行酶解，對比了幾種酶解液的苦味和水解度.結(jié)果表明：風(fēng)味蛋白酶最適合酶解骨蛋白，其水解產(chǎn)物鮮味明顯，無明顯苦味；木瓜蛋白酶水解骨蛋白效果最差，其水解產(chǎn)物苦味最為明顯；中性蛋白酶水解效果介于風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶之間.風(fēng)味蛋白酶水解骨蛋白的最佳酶解條件為：溫度50 ℃，加酶量6 000 U/g底物蛋白，pH值為7.0，酶解時間2 h，料液比1∶5(g/mL)，在此條件下其水解度可達(dá)34.80%.

豬骨素；羊骨素；酶解；風(fēng)味蛋白酶

0 引 言

通過對畜禽骨提取物進(jìn)行水解，能夠極大地增加原料中游離氨基酸的含量，最大程度表現(xiàn)其呈味功能.目前，骨素酶解成氨基酸和多肽后，經(jīng)美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物在肉類工業(yè)中的應(yīng)用已成為新的發(fā)展趨勢[1].但是，蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中的疏水性氨基酸和低分子肽往往存在一定的苦澀味[2-3]，且不同蛋白酶水解時切割位點不一樣[4]，導(dǎo)致骨素水解產(chǎn)物苦味程度不一，為了控制水解產(chǎn)物的苦味，首先必須選擇合適的酶進(jìn)行水解.對此，本研究對比了3種酶水解骨素的效果，旨在找到能提升骨素水解產(chǎn)物風(fēng)味的蛋白酶.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1)實驗所用材料.骨提取物(豬骨素∶羊骨素=8∶2)，其蛋白含量22.41%，自制.在牛、羊肉香精實際生產(chǎn)中，因牛羊骨特有風(fēng)味原因，酶解原料應(yīng)以豬骨素為主(80%左右)，牛羊骨提取物(20%左右)用于呈現(xiàn)牛羊肉風(fēng)味特征較為適宜.

2)實驗所用試劑.木瓜蛋白酶(酶活力500 000 U/g)，北京奧博星生物技術(shù)有限公司，中性蛋白酶(酶活力200 000 U/g)，北京鴻潤寶順科技有限公司，風(fēng)味蛋白酶(內(nèi)切酶活力30 000 U/g、外切酶活力10 000 U/g)，廣西麥柯欣生物科技有限公司；福林—酚試劑(AR)、L-酪氨酸(BR)，成都市科龍化工試劑廠；40%中性甲醛；碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酪蛋白、甘氨酸均為國產(chǎn)分析純.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：JA3103N型電子天平、DN203型電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，KDN-102C型定氮儀(上海纖檢儀器有限公司)，721型分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)，PHS-2F數(shù)字pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，HZ85-2型磁力攪拌器、DZKW-4型水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，ZFD-A5140型鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 蛋白酶的選擇.

由于風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶最適pH值接近骨素的自然pH值，因此水解選用風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶較為合適，并根據(jù)3種酶的水解度和苦味評定確定最適水解骨蛋白的酶.

在實驗中，準(zhǔn)確稱取5 g濃縮的骨提取物，然后精確稱取相應(yīng)重量的酶，將酶溶解到緩沖液中，待其完全溶解，按相應(yīng)的料液比與骨提取物混合均勻，置于水浴鍋中加熱酶解.

1.3.2 指標(biāo)測定.

相關(guān)指標(biāo)測定的方法為：總氮，參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》的凱氏定氮法；粗脂肪，參照GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》的索氏抽提法；水分，參照GB 5009.3-2010《食品中水分的測定》的直接干燥法；灰分，參照GB 5009.4-2010《食品中灰分的測定》的方法；蛋白酶活力，參照SBT 10317-1999《蛋白酶活力測定》的方法；氨基氮，參照GB 18186-2000《氨基酸態(tài)氮測定》的甲醛滴定法.

1.3.3 水解度計算.

水解度的計算公式[5]為，

式中，DH為蛋白質(zhì)水解度；N1為酶解前氨基氮含量；N2為酶解后氨基氮含量；N0為酶解前液中總氮含量.

1.3.4 苦味評定.

以1 g苦丁茶溶于1 L水中，煮沸1 h，過濾澄清后定容至1 000 mL，并將其分別稀釋至800、700、600、500、400、300、200、100、50 mg/kg，作為苦味評分標(biāo)準(zhǔn)物[6-7].

感官評定小組由5位有經(jīng)驗的業(yè)內(nèi)人士組成，評定者先用蒸餾水漱口，取待評定液2～3 mL置于口中，10 s后吐出，漱口后品嘗標(biāo)準(zhǔn)液，如確認(rèn)兩者味道相近，即可將待評定液的苦味值定為該標(biāo)準(zhǔn)液的苦味值，否則需取其他標(biāo)準(zhǔn)液再品嘗，直至確定苦味值.最后取5位人士評定的平均值[8].

1.3.5 酶解條件確定.

1)酶解溫度確定.初始pH值為7.0，加酶量6 000 U/g底物蛋白，料液比1∶3(g/mL，下同)，3種酶分別于45、50、55、60、65、70 ℃下對骨素進(jìn)行2 h酶解后，測其水解度并評定苦味值.

2)酶解時間確定.選取風(fēng)味蛋白酶，酶解條件為：溫度50 ℃， 初始pH值為7.0，加酶量6 000 U/g底物蛋白，料液比1∶3，對骨素進(jìn)行4 h酶解，每隔0.5 h取樣，測其水解度并評定苦味值.

3)底物濃度確定.選取風(fēng)味蛋白酶，酶解條件為：溫度50 ℃， 初始pH值為7.0，加酶量6 000 U/g底物蛋白，分別在1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7的料液比下對骨素進(jìn)行2 h酶解，測其水解度并評定苦味值.

4)加酶量確定.選取風(fēng)味蛋白酶，酶解條件為：溫度50 ℃， 初始pH值為7.0，酶解2 h，分別選擇3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 U/g底物蛋白的酶對骨素進(jìn)行酶解、測其水解度并評定苦味值.

5)酶解最適pH值的確定.其他條件不變，調(diào)節(jié)水解體系的pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，測定不同pH值條件下的水解度并評定苦味值.

2 結(jié)果與分析

2.1 骨素主要成分

經(jīng)檢測，實驗所用骨素主要成分及含量如表1所示.

表1 骨素(骨提取物)成分及含量

2.2 酶解溫度對水解度和苦味的影響

在酶解時間2 h，pH值為7.0，加酶量為6 000 U/g底物蛋白，料液比1∶3，分別于40、45、50、55、60、65 ℃下對豬骨蛋白進(jìn)行酶解，考察酶解溫度對水解度、水解液苦味的影響，結(jié)果見圖1.

圖1酶解溫度對水解度和苦味的影響

結(jié)果表明，木瓜蛋白酶水解效果最差，其次是中性蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶水解效果最好.在風(fēng)味蛋白酶水解整個過程中，其水解液苦味值變化不明顯，始終維持在較低水平，這是因為風(fēng)味蛋白酶中同時含有內(nèi)切酶和外切酶，內(nèi)切酶水解的多肽等產(chǎn)物繼續(xù)被外切酶水解成氨基酸[9]，使得底物隨著水解度增加同時保持苦味值基本不變.此外，3種酶水解后的水解液帶有不同程度的鮮味，其中，風(fēng)味蛋白酶水解后的鮮味更為突出，木瓜蛋白酶水解后先出現(xiàn)一定的鮮味，隨后則出現(xiàn)較明顯的苦澀味.綜合考慮，3種酶中風(fēng)味蛋白酶最適合水解骨蛋白，且其水解溫度相對較低，用于工業(yè)化生產(chǎn)時耗能較小，鮮味較為突出，苦味值也較小，利于后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用，故本研究在此后實驗中選擇風(fēng)味蛋白酶對骨蛋白進(jìn)行酶解.

2.3 酶解時間對水解度和苦味的影響

酶解時間對水解度和苦味的影響如圖2所示.

結(jié)果表明，隨著酶解時間的增加，水解度和苦味值增加，在酶解時間1.5～2 h階段，水解度增加最快， 酶解2 h其水解度可達(dá)25.52%. 當(dāng)酶解時間超過2 h后，水解度增加變緩，而苦味增加不明顯.酶解5 h，其水解度僅增加到28.61%.這是因為反應(yīng)2 h后，底物(蛋白質(zhì))大多被消耗，降低了酶促反應(yīng)速率，從而使得水解度增加緩慢.另外，由于風(fēng)味蛋白酶中同時含有內(nèi)切酶和外切酶，內(nèi)切酶水解的多肽等產(chǎn)物繼續(xù)被外切酶水解成氨基酸，使得底物隨著水解度增加同時保持苦味值變化不明顯.

圖2酶解時間對水解度和苦味的影響

2.4 底物濃度對水解度和苦味的影響

底物濃度對水解度和苦味的影響如圖3所示.

圖3底物濃度對水解度和苦味的影響

結(jié)果表明，料液比在1∶1～1∶3范圍內(nèi)，隨著料液比增加，苦味增加不明顯，當(dāng)料液比增加到1∶4時，苦味增加明顯且達(dá)到最大值.這是由于隨著水解度增加，酶的作用切開了疏水性多肽和疏水性氨基酸，致使苦味變化較大.隨著水解度進(jìn)一步增加，苦味值逐漸變小，這是由于風(fēng)味蛋白酶中外切酶的繼續(xù)作用，將疏水性多肽進(jìn)一步酶解成氨基酸，從而使得苦味降低.實驗發(fā)現(xiàn)，如需要得到較高水解度的水解液，選取料液比為1∶5較為合適，但考慮到實際生產(chǎn)中后續(xù)美拉德反應(yīng)前濃縮酶解液的耗能情況，綜合考量，選取料液比為1∶3.

2.5 加酶量對水解度和苦味的影響

加酶量對水解度和苦味的影響如圖4所示.

圖4加酶量對水解度和苦味的影響

結(jié)果表明，加酶量在3 000～9 000 U/g范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，水解度逐漸增加，苦味值先增加后降低.加酶量在3 000～7 000 U/g階段，底物濃度一定，增加的酶量未使底物濃度飽和，隨著酶濃度增加，反應(yīng)速度加快，蛋白水解度增加明顯；當(dāng)料加酶量過7 000 U/g時，水解度增和苦味增加趨于平緩，由于加酶量過大，過量的酶抑制了反應(yīng)進(jìn)行，同時可能導(dǎo)致酶自身溶解，使得酶活力下降，從而減緩了反應(yīng)速度.考慮到實際生產(chǎn)中酶的成本，綜合考量，選取加酶量為6 000 U/g.

2.6 pH值對水解度和苦味的影響

pH值對水解度和苦味的影響如圖5所示.

圖5 pH值對水解度和苦味的影響

結(jié)果表明，pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，水解度和苦味值逐漸增加；當(dāng)pH值達(dá)到7.0時，水解度和苦味最高；當(dāng)pH值大于7.0時，水解度和苦味均呈現(xiàn)下降趨勢.產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是酶活力受外界pH值影響，pH值在一定范圍內(nèi)，隨著pH值變化，酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)可處于不同的解離狀態(tài)，而具有催化活性的離子基團(tuán)僅是其中一種特定的解離形式.因而pH值在某個點上，具有催化活性的離子基團(tuán)最多，酶活力最大，該點pH值為酶的最適pH值.最適pH值會由于實驗原料和底物濃度的不同會稍有變化，當(dāng)pH值小于5.0或大于8.0時，酶活力急劇下降，導(dǎo)致水解度下降.

3 結(jié) 論

骨提取物的酶解是酶將蛋白質(zhì)切割成肽類和氨基酸的一個過程，因不同酶水解時切割位點不一樣，其水解蛋白效果不一樣，同種酶在不同條件下水解效果差異也很大.實驗結(jié)果表明：在選取的3種蛋白酶中，風(fēng)味蛋白酶最適合酶解骨蛋白，其水解溫度相對較低，水解產(chǎn)物鮮味明顯，基本無明顯苦味；木瓜蛋白酶水解骨蛋白效果在3種酶中最差，其水解產(chǎn)物苦味最為明顯；中性蛋白酶水解效果介于風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶之間.

本研究認(rèn)為，風(fēng)味蛋白酶水解骨蛋白的最佳酶解條件為：溫度50 ℃，加酶量6 000 U/g底物蛋白，pH值為7.0，酶解時間2 h，料液比1∶5(g/mL)，在此條件下其水解度可達(dá)34.80%.同時，在酶解溫度50 ℃，pH值為7.00，風(fēng)味蛋白酶加酶量6 000 U/g底物蛋白(以外切酶活力計)，料液比1∶3條件下，酶解時間超過2 h后，其水解度趨于平緩.

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Abstract：Papain,neutral protease and flavourzyme are selected in the enzymatic hydrolysis of ossein,respectively.The degree of hydrolysis and bitterness value of different enzymatic hydrolysate are compared.The results show that the most suitable protease to hydrolyze ossein is flavourzyme whose hydrolysate has great fresh flavor and little bitterness.On the other hand,papain is the least suitable protease to hydrolyze ossein,with the most obvious bitterness.The hydrolysis efficacy of neutral protease is between those of the two protease mentioned above.The best enzymatic hydrolysis conditions of flavourzyme are:pH 7.0,hydrolysis time of 2 h,1∶5 solid-liquid rations,enzyme dosage 6 000 U/g,and the degree of hydrolysis could reach 34.80%.

Keywords：pig ossein;sheep pssein;enzymatic hydrolysis;flavor protease enzyme

ComparisonandOptimizationofEnzymaticHydrolysisofOsseinwithDifferentProtease

XIAOLongquan，WANGXinhui，LIYuncheng，DENGTing，WEIZucheng，LIUDayu

(School of Pharmacy and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China)

TS251.94

A

1004-5422(2017)03-0243-04

2017-07-18.

肖龍泉(1988 — )， 男， 碩士， 從事食品生物相關(guān)技術(shù)研究.