益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方對IgA腎病模型大鼠腎臟組織腫瘤壞死因子-α的影響

強(qiáng) 勝,杜珍芳,黃 敏,馬曉偉,周奕岑

(江蘇省張家港市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇 張家港,215600)

益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方對IgA腎病模型大鼠腎臟組織腫瘤壞死因子-α的影響

強(qiáng) 勝,杜珍芳,黃 敏,馬曉偉,周奕岑

(江蘇省張家港市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇 張家港,215600)

目的探討益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方對IgA腎病模型大鼠血尿、蛋白尿及對其腎臟組織病理的影響。方法60只雄性清潔級SD大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、黃葵組與中藥(益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方)高、中、低劑量組，于造模前及造模后第4、8、12、16周末對各組大鼠24 h尿蛋白定量、尿紅細(xì)胞計數(shù)進(jìn)行檢測，同時給藥后8周分別通過HE染色法、免疫組化法檢測各組大鼠腎組織病理變化及TNF-α表達(dá)情況。結(jié)果與空白組比較，模型組、黃葵組、中藥高、中、低劑量組大鼠給藥8周后尿紅細(xì)胞計數(shù)、24 h尿蛋白、TNF-α表達(dá)均不同程度增高(P<0.05);與模型組比較，黃葵組、中藥高、中、低劑量組給藥8周后尿紅細(xì)胞計數(shù)、24 h尿蛋白、TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05),且中藥組給藥8周上述指標(biāo)均顯著低于黃葵組(P<0.05)。光鏡顯示空白組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠多數(shù)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)出現(xiàn)中、重度增生，腎間質(zhì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤伴灶狀纖維化;各治療組腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生程度均有一定程度緩解。結(jié)論益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方可減少IgA腎病模型大鼠血尿、蛋白尿，減輕腎臟組織病變，其作用機(jī)制可能與其降低尿紅細(xì)胞數(shù)、24 h尿蛋白，抑制腎臟TNF-α表達(dá)有關(guān)。

IgA腎病;益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方;機(jī)制;TNF-α

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of yiqi yangyin tongluo regime on hematuria,proteinuria and renal tissue′s pathological changes in rats with IgA nephropathy (IgAN).MethodsSixty clean male SD rats were randomized into blank group,model group,huangkui group and high,medium and low-dose TCM (yiqi yangyin tongluo regime) group.After modeling for 0 week,4 weeks,8 weeks,12 weeks and 16 weeks,the levels of urine red blood cell count and 24 h urine protein were detected.Meanwhile,after feeding for 8 weeks,the pathological changes of remnant renal tissues and expression of TNF-α were detected by HE staining and immunohistochemical staining.ResultsAfter feeding for 8 weeks,compared with blank group,the level of urine red blood cell count,24h urine protein and TNF-α expression in model group,huangkui group,high,medium and low-dose TCM group were significantly higher (P<0.05).Compared with the model group,the level of urine red blood cell count,24h urine protein and TNF-α expression in huangkui group,high,medium and low-dose TCM group were significantly lower (P<0.05).The above indexes in TCM group were significantly lower than huangkui group (P<0.05).Light microscopy showed that the renal tissues were normal in blank group.In the model group,most of glomerular mesangial cells and matrix appeared moderate and severe hyperplasia,inflammatory cells and focal fibrosis were seed in renal interstitium.Proliferation of mesangial cells and matrix were relieved in huangkui group and TCM group.ConclusionYiqi yangyin tongluo regime can effectively ameliorate the levels of urine red blood cell count,24 h urine protein and renal pathological changes.The mechanism may be related to the decrease of urine red blood cell count and 24 h urinary protein,and inhibition of TNF-α expression.

KEYWORDS:IgA nephropathy;yiqi yangyin tongluo regime;mechanism;TNF-α

IgA腎病(IgAN)在中國十分常見，是一組以IgA或IgA為主的免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積為特征的原發(fā)性腎小球疾病。研究[1]發(fā)現(xiàn)25%～50%的患者在確診IgA腎病后的 10～20 年內(nèi)可發(fā)展至終末期腎病。目前IgA 腎病的治療[2]以對癥及免疫抑制為主，主要包括ACEI/ARB的使用、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、扁桃體摘除術(shù)等。本研究探討益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方對IgA腎病模型大鼠的治療效果及其機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g,由南京醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2014-0001。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級實(shí)驗(yàn)動物房，定時給予普通清潔級動物飼料，室溫22～25 ℃,濕度50%～70%,光照、黑暗時間各12 h。

1.2 藥品及試劑

益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方:太子參15 g,炙黃芪15 g,熟地10 g,生地10 g,海風(fēng)藤15 g,雞血藤15 g,青風(fēng)藤15 g,全蝎粉1.5 g,由張家港市中醫(yī)院制劑室制成口服液;黃葵膠囊，購自江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司;葡萄球菌腸毒素B(SEB)購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物研究所;牛血清白蛋白(BSA)、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司;兔抗大鼠異硫氰酸標(biāo)記的IgA抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;大鼠TNF-α試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 分組與建模

雄性清潔級Wistar大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，用代謝籠收集檢測尿蛋白和潛血均為陰性，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、黃葵膠囊組、YYTF高、中、低劑量組各10只。參考文獻(xiàn)[3]方法造模:從實(shí)驗(yàn)第1天起以 BSA 200 mg/kg(配成水溶液)隔日灌胃，共12周;于實(shí)驗(yàn)第1天皮下注射完全弗氏佐劑0.2 mL(含BSA 2 mg),第14、28天經(jīng)腹腔注射不完全弗氏試劑0.2 mL(含BSA 2 mg);第8～10周每周從尾靜脈注射SEB 0.4 mg/kg(用0.9% NaCl 配成水溶液共0.5 mL)。

1.4 給藥方式

60只大鼠采取灌胃給藥。從實(shí)驗(yàn)造模的第9周起，空白組、模型組給予同體積蒸餾水灌胃，黃葵組及中藥組按照大鼠體質(zhì)量(g)與藥物(mL)對照表給藥，每日給藥前均稱量大鼠體質(zhì)量，按體質(zhì)量變化增減給藥劑量，共治療8周。益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方(YYTF)常規(guī)煎煮，過濾收集煎液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至含生藥2 g/mL的濃縮液，分別抽取32.4 mL(含生藥64.8 g),64.8 mL(含生藥129.6 g)和129.6 mL(含生藥259.2 g)的濃縮液，加蒸餾水至200 mL,混勻配置YYTF 3個劑量組，即低劑量(YYTF1)、中劑量(YYTF2)和高劑量組(YYTF3)。期間大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.5 標(biāo)本采集及檢測

① 觀察飲食、尿量、精神狀態(tài)、毛色、體質(zhì)量等一般情況。② 分別于造模前及造模后第4、8、12、16周末代謝籠收集24 h尿液，檢測24 h尿蛋白定量(24 h-UTP)、尿紅細(xì)胞計數(shù)。③ 血液、腎臟標(biāo)本采集。標(biāo)本采取前，所有大鼠均禁食12 h，禁水4 h。用戊巴比妥鈉按每1～2 mL麻醉后，開腹穿刺腹主動脈取血4～5 mL,迅速摘取雙腎，用生理鹽水沖洗，除去非腎臟組織，觀察腎臟形態(tài)。取一側(cè)腎臟投入4%多聚甲醛溶液固定。④ TNF-α的測定。腎組織HE染色，取材、固定、洗滌、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、展片、貼片、脫蠟復(fù)水、染色、水洗、分化、漂洗、脫水、復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封存，顯微鏡下觀察各組腎臟組織切片特點(diǎn)。采用ELISA法測定TNF-α的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，模型組大鼠死亡 2 只，黃葵組死亡 1 只，其余各組均無死亡?？瞻捉M大鼠一般狀態(tài)較好，其余各組大鼠自第7周開始出現(xiàn)不同程度的精神不振、毛色萎黃、食欲及體質(zhì)量下降、皮下水腫及尿色改變。各治療組給予藥物治療后，上述癥狀于1～2周逐漸緩解。其中YYTF組緩解最快，模型組緩解最慢。

2.2 尿紅細(xì)胞及24 h尿蛋白定量檢測

2.2.1 各組大鼠尿紅細(xì)胞計數(shù)的比較:在實(shí)驗(yàn)過程中，空白組大鼠尿液中未檢測出紅細(xì)胞。其余各組在第8周末開始出現(xiàn)肉眼血尿及鏡下血尿，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);至12周末，各治療組尿紅細(xì)胞計數(shù)比模型組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但仍顯著高于空白組(P<0.05);各YYTF組與黃葵組相比，尿紅細(xì)胞計數(shù)顯著減少(P<0.05),YYTF組下降更為明顯;至16周末，各組大鼠尿紅細(xì)胞計數(shù)明顯減少,YYTF高、中劑量組與模型組相比，差異顯著(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠各周末尿紅細(xì)胞計數(shù)的比較個

與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與黃葵組相比,#P<0.05;與空白組比較,△P<0.05。

2.2.2 各組大鼠24 h尿蛋白檢測:在實(shí)驗(yàn)過程中，空白組大鼠未出現(xiàn)蛋白尿。其余各組在第8周末開始出現(xiàn)蛋白尿，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);至12周末，各治療組尿蛋白比模型組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但仍顯著高于空白組(P<0.05);各YYTF組與黃葵組相比，尿蛋白減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);至16周末，各組大鼠尿蛋白減少，各YYTF組與黃葵組相比尿蛋白減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),各治療組療效與藥物濃度呈正相關(guān)。見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白檢測 mg/24 h

與空白組比較,*P<0.05;與黃葵組相比,#P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。

2.3 腎組織切片光鏡觀察

光鏡下見空白組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常;模型組大鼠腎間質(zhì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤伴灶狀纖維化，多數(shù)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)出現(xiàn)中重度增生、球囊黏連、毛細(xì)血管受壓、足細(xì)胞腫脹;各治療組腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生程度均有不同程度緩解，系膜細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少，足細(xì)胞無明顯腫脹。

2.4 ELISA法測定TNF-α的表達(dá)

按照ELISA試劑盒操作步驟，測定系列含不同濃度TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品溶液的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程回歸y=79.822χ2+190.09χ+1.9701,r=0.9999。表示標(biāo)準(zhǔn)品在1000～15.625 pg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

再測定樣本的OD值，依據(jù)回歸方程計算樣本濃度，造模后各組大鼠血清TNF-α的含量明顯升高。治療后，各治療組與模型組相比血清TNF-α的含量顯著下降(P<0.05);提示IgA 腎病模型大鼠血清TNF-α與病情成正相關(guān);與黃葵組相比，各中藥治療組血清TNF-α下降程度更為顯著(P<0.05),說明益氣養(yǎng)陰通絡(luò)治療在降低血清TNF-α方面療效更明顯，見表3。

表3 各組大鼠TNF-α表達(dá)的比較 pg/mL

與空白組比較,*P<0.05;與黃葵組相比,#P<0.05;

與模型組比較,△P<0.05。

3 討 論

IgA腎病是中國最常見的腎小球疾病，占所有原發(fā)性腎小球疾病的45%～50%[4]。既往認(rèn)為IgA腎病預(yù)后良好，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)25%～50%的患者在確診IgA腎病后的10～20年內(nèi)可發(fā)展至終末期腎病。IgA腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，治療方案以ACEI/ARB類藥物、免疫抑制劑為主，有一定療效，但毒副作用不小。

現(xiàn)有研究[5-6]認(rèn)為IgA腎病的發(fā)病機(jī)制與免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積、炎癥反應(yīng)的觸發(fā)及遺傳因素相關(guān)。目前研究[7-8]認(rèn)為IgA腎病的典型病理改變是IgA1的沉積，由此推測IgA腎病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是形成IgA 免疫復(fù)合物。已有大量證據(jù)[9]表明，沉積在腎小球系膜區(qū)的免疫復(fù)合物主要為多聚IgA1。IgA1發(fā)生異常糖基化，出現(xiàn)O型寡糖鏈半乳糖基化降低、N-乙酰半乳糖胺增加，可促使IgA1在腎小球系膜區(qū)的沉積，從而加速腎小球的損傷[10]。IgA1與系膜細(xì)胞接觸后能觸發(fā)炎癥性瀑布樣反應(yīng)，促使系膜細(xì)胞分泌血小板活化因子、白細(xì)胞介素-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)，從而引起單核細(xì)胞趨化蛋白1、IL-8、IL-10的釋放，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，加重腎小球損傷。TNF-α是其中的一個重要的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，參與了IgA腎病的發(fā)病過程[11]。TNF-α通過影響腎小球系膜細(xì)胞(GMC)的功能，改變細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架，并刺激GMC 增殖、表達(dá)黏附分子以及成纖維細(xì)胞增生，從而導(dǎo)致腎臟發(fā)生纖維化[12]。TNF-α 還能通過激活轉(zhuǎn)錄因子蛋白介導(dǎo)路徑促使炎性介質(zhì)在GMC以及血管內(nèi)皮細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)，從而造成自分泌強(qiáng)化回路，加重炎癥損傷，加快炎癥發(fā)生、發(fā)展速度[13]。

IgA腎病病程長，遷延不愈，易病情反復(fù)，患者長期尿檢紅細(xì)胞、蛋白不易消失。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為IgA腎病的基本病因病機(jī)為感受外邪或濕熱損傷血絡(luò)或瘀血阻于腎絡(luò)，加之脾虛失其統(tǒng)攝、腎虛失其封藏，導(dǎo)致精微物質(zhì)下泄，出現(xiàn)蛋白尿、血尿。本課題組將中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腎臟組織結(jié)構(gòu)、生理、病理及微循環(huán)障礙學(xué)說相結(jié)合，提出慢性頑固性腎病有絡(luò)脈空虛、絡(luò)脈瘀阻兩大特征，從而制定了益氣養(yǎng)陰、導(dǎo)滯通絡(luò)的治療原則。絡(luò)脈在人身內(nèi)三維立體，網(wǎng)絡(luò)分布，為臟腑內(nèi)外整體性協(xié)調(diào)聯(lián)系的重要結(jié)構(gòu)，是構(gòu)成人體內(nèi)外環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)。其中絡(luò)脈中之陰絡(luò)滿溢灌注雙向流動的特征，與腎小球密布毛細(xì)血管網(wǎng)有相似之處。本課題組前期研究表明，補(bǔ)虛和絡(luò)、治傷止血標(biāo)本兼治，能修復(fù)損傷的腎小球，可顯著改善實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。本科多運(yùn)用益氣藥物如黃芪及重用以蟲類藥為主的活血化瘀通絡(luò)藥物，再根據(jù)長期臨床療效觀察，創(chuàng)立了益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方(由炙黃芪、太子參、熟地、生地、青風(fēng)藤、海風(fēng)藤、雞血藤、全蝎組成)。方中以黃芪為君重在益氣，太子參、生熟地為臣主以養(yǎng)陰，加之青風(fēng)藤等藤類藥及全蝎活血通絡(luò)，共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之功?，F(xiàn)代藥理[14]證明，黃芪具有增加腎臟血流量，減少腎小球IgA的沉積及蛋白尿的功效。地黃提取物[15-16]可有效下調(diào)體內(nèi)TNF-α水平。蟲類藥及藤類藥因其走竄透達(dá)、逐瘀破血特性，可以改善腎臟微循環(huán)[17-18]。

本研究結(jié)果顯示，各模型組大鼠血清TNF-α的含量顯著高于空白對照組(P<0.05),并且升高程度與病情成正相關(guān)，提示TNF-α 的異常增高是導(dǎo)IgA 腎病發(fā)病的病理機(jī)制之一。治療后，各組大鼠 24 h尿紅細(xì)胞計數(shù)、24 h-UTP明顯降低，同時腎臟組織中的TNF-α的含量也隨之下降。YYTF組大鼠的尿紅細(xì)胞數(shù)、蛋白尿情況及TNF-α水平均較黃葵組大鼠明顯下降，且療效與劑量呈正相關(guān)，提示益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方可顯著減輕IgA腎病模型大鼠蛋白尿及血尿，減少TNF-α水平表達(dá)，療效與劑量呈正相關(guān)。

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EffectofyiqiyangyintongluoregimeonexpressionofTNF-αinrenaltissueinratswithIgAnephropathy

QIANGSheng,DUZhenfang,HUANGMin,MAXiaowei,ZHOUYicen

(ZhangjiagangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Zhangjiagang,Jiangsu,215600)

R 692

A

1672-2353(2017)17-064-05

10.7619/jcmp.201717019

2017-04-06

江蘇省蘇州市科技局基金項(xiàng)目(SYSD2013156)