土壤辛硫磷污染對(duì)蚯蚓的生態(tài)毒理效應(yīng)研究*

賈 茹 王夢(mèng)遠(yuǎn) 黃 擎

(北京理工大學(xué)材料學(xué)院，北京 100081)

土壤辛硫磷污染對(duì)蚯蚓的生態(tài)毒理效應(yīng)研究*

賈 茹 王夢(mèng)遠(yuǎn) 黃 擎#

(北京理工大學(xué)材料學(xué)院，北京 100081)

采用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)標(biāo)準(zhǔn)法配置的人工土壤研究了不同初始質(zhì)量濃度(25、50、100mg/kg)辛硫磷對(duì)蚯蚓的生態(tài)毒理效應(yīng)，測(cè)定了不同老化時(shí)間(7、14、21、28d)下蚯蚓體內(nèi)及土壤中辛硫磷含量及各項(xiàng)生態(tài)毒理指標(biāo)。結(jié)果表明：28d內(nèi)辛硫磷在蚯蚓體內(nèi)及土壤中的含量持續(xù)降低；蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低；超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性隨辛硫磷初始濃度增加總體呈先升后降的趨勢(shì)，隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性總體降低，而CAT活性先降后升；28d時(shí)丙二醛(MDA)含量達(dá)到最高，且隨辛硫磷初始濃度增加而總體顯著提高(P<0.05)；土壤酸性磷酸酶(ACP)活性隨辛硫磷初始濃度增加而總體提高，而土壤脲酶(UE)活性隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)總體增加。綜合而言，SOD活性、CAT活性、MDA含量及土壤ACP活性可作為評(píng)價(jià)辛硫磷生態(tài)毒理效應(yīng)的生物標(biāo)志物，在有機(jī)磷農(nóng)藥的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)過(guò)程中應(yīng)給予考慮。

土壤污染 辛硫磷 蚯蚓 生態(tài)毒理效應(yīng)

Abstract: The subacute toxicity of the phoxim at different concentrations (25，50，100 mg/kg) to earthworm was studied by OECD artificial soil method. The phoxim concentrations in the soil and earthworms and ecotoxicological indexes were measured at the 7th，14th，21stand 28thaging day，respectively. Results were as follows：the phoxim concentrations in earthworms and soil kept decreasing within 28 days. The protein concentrations in earthworms decreased with time prolonged. Superoxide dismutase (SOD)，catalase (CAT) activity in earthworms increased first and then decreased with initial concentrations of phoxim increasing. With the aging time increasing，the former activity kept decreasing，while the later tended to decrease first and then rise again. Malondialdehyde (MDA) concentration in earthworms reached the maximum on the 28thday，which increased significantly with initial phoxim concentration increasing in soil (P<0.05). The activity of alkaline phosphatase (ACP) in soil increased with initial phoxim concentration increasing，while that of urease (UE) rose with aging time. In conclusion，SOD activity，CAT activity，MDA concentration and soil ACP activity could be used as biomarkers for evaluation of ecotoxicological effect of phoxim，which should be considered in the environmental security assessment of organophosphorus pesticide.

Keywords: soil pollution; phoxim; earthworm; ecotoxicological effects

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥使用品種多，用量大，其中70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)～80%的農(nóng)藥直接散落到環(huán)境中，對(duì)土壤、地表水、地下水和農(nóng)產(chǎn)品造成污染，并進(jìn)一步通過(guò)食物鏈對(duì)人類健康造成影響。有機(jī)磷農(nóng)藥因其高效性且在環(huán)境中具有較低的持久性而取代有機(jī)氯農(nóng)藥并得到廣泛應(yīng)用[1-2]。辛硫磷是一種以觸殺、胃毒為主的高效低毒有機(jī)磷殺蟲劑，主要是通過(guò)抑制神經(jīng)系統(tǒng)乙酰膽堿酯酶活性，使突觸后膜乙酰膽堿累積導(dǎo)致昆蟲死亡[3]，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的農(nóng)藥之一。

蚯蚓是陸地食物鏈底部的一種重要生物，在土壤污染生態(tài)毒理測(cè)試中可作為敏感生物受試物[4-6]，在正常情況下其體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)受到外源物質(zhì)脅迫時(shí)，自由基的產(chǎn)生大于分解而發(fā)生累積，此時(shí)其體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮作用維持氧化-抗氧化平衡[7-8]。研究表明，蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活性可作為研究有機(jī)農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物使用[9-11]，但辛硫磷對(duì)蚯蚓體內(nèi)抗氧化體系的研究還鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)在人工土壤中施加辛硫磷，分析不同老化時(shí)間蚯蚓體內(nèi)及土壤中辛硫磷含量，蚯蚓體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量、蛋白質(zhì)含量、土壤脲酶(UE)活性及酸性磷酸酶(ACP)活性，探討蚯蚓體內(nèi)及土壤中辛硫磷含量與相應(yīng)酶活性的劑量效應(yīng)關(guān)系，旨在為有機(jī)磷農(nóng)藥的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)以及揭示該類化合物的生物毒性機(jī)制提供有效的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

辛硫磷為有效成分40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的乳油。選用赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafetida)，以發(fā)酵牛糞作為飼料，于室溫(20～25 ℃)、自然光條件下飼養(yǎng)與繁殖，挑選生殖環(huán)明顯且無(wú)損傷、體重300～500 mg的健康成熟蚯蚓作為受試生物，實(shí)驗(yàn)前將蚯蚓放在濕潤(rùn)的濾紙上清腸24 h。

實(shí)驗(yàn)用土壤為依據(jù)經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)標(biāo)準(zhǔn)法[12]配置的人工土壤，其成分為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)泥炭蘚、20%高嶺土、69%工業(yè)石英砂(粒徑為0.1～0.3 mm)，添加1%的碳酸鈣將pH調(diào)整為6.5±0.5，配制完成后風(fēng)干、研磨并過(guò)1 mm篩備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取適當(dāng)體積的辛硫磷乳油用丙酮溶解定容為辛硫磷母液備用。分為4個(gè)處理組，包括辛硫磷初始質(zhì)量濃度為0 mg/kg的對(duì)照組以及辛硫磷初始質(zhì)量濃度為25、50、100 mg/kg的實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)處理組將400 g風(fēng)干土壤置于500 mL燒杯中，定量加入辛硫磷母液，用去離子水調(diào)節(jié)土壤濕度為25%后平衡5 h。預(yù)處理后的蚯蚓沖洗干凈，用濾紙吸干體表水分并稱量，每個(gè)處理組加入20條蚯蚓。均設(shè)3組平行處理。實(shí)驗(yàn)控制條件為：溫度(20±1) ℃，相對(duì)濕度80%，光照條件為光照18 h黑暗6 h循環(huán)。分別老化7、14、21、28 d后對(duì)全部蚯蚓和土壤進(jìn)行取樣。所取土壤樣品分為兩部分，一部分風(fēng)干2 d后研磨并過(guò)1 mm篩后進(jìn)行土壤UE和ACP活性分析，另一部分冷凍干燥后測(cè)定辛硫磷含量；新鮮蚯蚓樣品測(cè)定SOD活性、CAT活性、MDA含量和蛋白質(zhì)含量，冷凍干燥后進(jìn)行辛硫磷含量分析。

1.3 指標(biāo)分析方法

土壤中(或蚯蚓體內(nèi))辛硫磷含量分析采用高效液相色譜法。稱取20 g冷凍干燥的土壤(或5 g蚯蚓)加入25(或5) mL丙酮溶液，振蕩1 min后超聲處理20 min。上清液用分液漏斗過(guò)濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理后定容至10 mL，取1 mL裝入液相色譜儀專用取樣瓶，進(jìn)行定量分析。

蚯蚓體內(nèi)CAT活性、SOD活性、MDA含量、蛋白質(zhì)含量以及土壤ACP、UE活性分析均采用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行。CAT活性依據(jù)H2O2在240 nm處有特征吸收峰，測(cè)定酶促反應(yīng)前后H2O2含量差值計(jì)算得出，即每克組織每分鐘催化1 nmol H2O2降解的酶活力，單位U/g。SOD活性測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，在560 nm處比色測(cè)定超氧陰離子還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜的含量，即黃嘌呤氧化酶偶連反應(yīng)體系中抑制率為50%時(shí)的酶活力，單位U/g。MDA含量依據(jù)其與硫代巴比妥酸縮合生成紅色產(chǎn)物在波長(zhǎng)532、600 nm處的吸光度差值進(jìn)行測(cè)定，單位nmol/g。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，單位μg/mL。土壤ACP活性依據(jù)其在酸性環(huán)境中催化磷酸苯二鈉水解，進(jìn)而在660 nm處測(cè)得水解產(chǎn)物(苯酚)的生成量進(jìn)行表征，即37 ℃下每克土壤24 h釋放的苯酚含量，單位U/g。土壤UE活性利用靛酚藍(lán)比色法在578 nm處比色測(cè)得，即37 ℃下每克土壤24 h產(chǎn)生的氨氮含量，單位U/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Origin 9.1和SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蚯蚓體內(nèi)與土壤中辛硫磷含量

如圖1所示，相同老化時(shí)間下，隨辛硫磷初始濃度的增加，蚯蚓體內(nèi)辛硫磷顯著增加(P<0.05)，100 mg/kg實(shí)驗(yàn)組蚯蚓體內(nèi)辛硫磷是25 mg/kg實(shí)驗(yàn)組的2.26～7.05倍。各實(shí)驗(yàn)組蚯蚓體內(nèi)辛硫磷大體隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，28 d比7 d降低了87.7%～94.6%。如圖2所示，相同老化時(shí)間下，土壤中辛硫磷隨初始濃度的增加顯著升高(P<0.05)，100 mg/kg實(shí)驗(yàn)組土壤中辛硫磷是25 mg/kg實(shí)驗(yàn)組的2.99～10.34倍。各實(shí)驗(yàn)組土壤中辛硫磷均會(huì)隨老化時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，28 d比7 d降低了65.9%～90.1%。

2.2 蚯蚓體內(nèi)生理指標(biāo)變化

如圖3所示，蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，28 d比7 d降低了66.8%～69.3%；蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)隨辛硫磷初始濃度增加無(wú)顯著變化。如圖4所示，7、21、28 d時(shí)，蚯蚓體內(nèi)SOD活性隨辛硫磷初始濃度的增加先升后降，25、50 mg/kg實(shí)驗(yàn)組中蚯蚓體內(nèi)SOD活性達(dá)到最大，分別是對(duì)照組的1.11～2.10倍；14 d實(shí)驗(yàn)組SOD活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。SOD活性隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)有總體降低的趨勢(shì)。如圖5所示，7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組蚯蚓體內(nèi)CAT活性比對(duì)照組顯著降低13%～42%(P<0.05)；14、21、28 d時(shí)，隨著辛硫磷初始濃度增加，CAT活性總體先升后降，25 mg/kg實(shí)驗(yàn)組最高，是對(duì)照組的1.10～2.13倍。CAT活性隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈先降后升的趨勢(shì)，21 d時(shí)達(dá)到最小值。如圖6所示，蚯蚓體內(nèi)MDA大體隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，28 d時(shí)達(dá)到最高。7、14、21 d時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組MDA與對(duì)照組差異總體不顯著；28 d時(shí)，50、100 mg/kg實(shí)驗(yàn)組中蚯蚓體內(nèi)MDA顯著升高(P<0.05)，分別是對(duì)照組的1.53、1.52倍。

注：小寫字母相同表示差異不顯著；不同表示差異顯著。圖2至圖8同。

圖1不同老化時(shí)間下的蚯蚓體內(nèi)辛硫磷
Fig.1 Phoxim concentration in earthworms at different aging time

圖2 不同老化時(shí)間下土壤中辛硫磷Fig.2 Phoxim concentration in soil at different aging time

圖3 不同老化時(shí)間下蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)Fig.3 Protein concentration in earthworms at different aging time

圖4 不同老化時(shí)間下蚯蚓體內(nèi)SOD活性Fig.4 SOD activity in earthworms at different aging time

圖5 不同老化時(shí)間下蚯蚓體內(nèi)CAT活性Fig.5 CAT activity in earthworms at different aging time

圖6 不同老化時(shí)間下蚯蚓體內(nèi)MDAFig.6 MDA concentration in earthworms at different aging time

2.3 土壤ACP、UE活性變化

如圖7所示，土壤ACP活性隨辛硫磷初始濃度增加而總體提高。21 d內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組土壤ACP活性均總體顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，7 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組是對(duì)照組的1.53～5.78倍，14 d時(shí)為1.06～2.23倍，21 d時(shí)為1.36～1.85倍；28 d時(shí)，25、100 mg/kg實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，分別是對(duì)照組的0.88、1.69倍，而50 mg/kg實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。如圖8所示，土壤UE活性隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)總體增加，28 d時(shí)是7 d的1.28～3.79倍。7、21 d時(shí)100 mg/kg實(shí)驗(yàn)組中土壤UE活性最高；14 d時(shí)25 mg/kg實(shí)驗(yàn)組最高；28 d各實(shí)驗(yàn)組土壤UE活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。由此可見(jiàn)，在辛硫磷暴露條件下，土壤ACP活性對(duì)辛硫磷濃度較敏感，而土壤UE活性則對(duì)老化時(shí)間更敏感。

圖7 不同老化時(shí)間下土壤ACP活性Fig.7 Soil ACP activity at different aging time

圖8 不同老化時(shí)間下土壤UE活性Fig.8 Soil UE activity at different aging time

2.4 討 論

由表1可知，蚯蚓體內(nèi)辛硫磷含量與CAT活性呈顯著負(fù)相關(guān)，而SOD活性、蛋白質(zhì)含量、MDA含量則與辛硫磷含量無(wú)顯著相關(guān)性。

辛硫磷在老化28 d內(nèi)對(duì)蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生了影響，對(duì)不同酶呈現(xiàn)出不同程度的刺激或抑制作用。當(dāng)蚯蚓受到辛硫磷脅迫時(shí)，體內(nèi)CAT、SOD活性變化趨勢(shì)基本一致，隨著辛硫磷初始濃度的增加總體呈先升后降的趨勢(shì)。對(duì)于清除活性氧自由基，CAT與SOD有著不同的作用機(jī)制，CAT可有效將SOD歧化活性氧自由基的產(chǎn)物H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2[13-14]。與對(duì)照組比，7 d時(shí)，25、50 mg/kg實(shí)驗(yàn)組的SOD活性升高，而CAT活性降低，這可能是因?yàn)楫?dāng)蚯蚓受到辛硫磷氧化脅迫時(shí)，體內(nèi)自由基數(shù)量增多誘導(dǎo)SOD合成量增加，CAT尚未被誘導(dǎo)同時(shí)酶蛋白被破壞或消耗導(dǎo)致CAT活性下降[15]，表明生物體內(nèi)活性氧的清除SOD發(fā)揮作用在前、CAT作用在后。14 d時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組SOD活性降低、CAT活性總體升高，表明辛硫磷脅迫下蚯蚓體內(nèi)的活性氧自由基大量積累，使SOD活性受到抑制，而H2O2刺激了CAT合成使實(shí)驗(yàn)組CAT活性升高。21、28 d時(shí)，總體上SOD、CAT活性在低濃度實(shí)驗(yàn)組受到刺激，而在高濃度實(shí)驗(yàn)組受到不同程度的抑制，表明在實(shí)驗(yàn)后期，當(dāng)外源污染物對(duì)蚯蚓產(chǎn)生的損傷在一定程度內(nèi)，體內(nèi)SOD、CAT等抗氧化酶系統(tǒng)能相互協(xié)作保護(hù)細(xì)胞免受活性氧自由基的損傷。

MDA含量是有機(jī)體組織或細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其增加是機(jī)體細(xì)胞膜損傷的標(biāo)志。在實(shí)驗(yàn)初期，有機(jī)污染物刺激蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活力增加減輕了活性氧對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷程度，因而實(shí)驗(yàn)組蚯蚓體內(nèi)MDA含量與對(duì)照組總體無(wú)顯著變化；28 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組MDA含量與對(duì)照組差異顯著，隨辛硫磷初始濃度升高與老化時(shí)間延長(zhǎng)，體內(nèi)大量自由基的產(chǎn)生超出了機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的清除能力而積累，細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化使蚯蚓體內(nèi)MDA含量總體顯著增加。由此可見(jiàn)，MDA含量變化可作為反映辛硫磷對(duì)蚯蚓毒性效應(yīng)的指標(biāo)之一。

表1 蚯蚓生態(tài)毒理指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣1)

注：1)*表示具有顯著相關(guān)性。

由表2可知，土壤中辛硫磷含量、土壤UE活性和土壤ACP活性間無(wú)顯著相關(guān)性。

表2 土壤生態(tài)毒理指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣

3 結(jié) 語(yǔ)

有機(jī)磷農(nóng)藥辛硫磷對(duì)蚯蚓具有毒性效應(yīng)，使蚯蚓體內(nèi)各項(xiàng)生態(tài)毒理指標(biāo)產(chǎn)生變化。短期暴露條件下，SOD比CAT先發(fā)揮抗氧化作用，而MDA含量無(wú)明顯變化。長(zhǎng)期暴露條件下，SOD、CAT活性隨著辛硫磷初始濃度增加總體呈先升后降的趨勢(shì)，而MDA含量總體顯著增加。辛硫磷暴露會(huì)造成土壤ACP活性增加，而土壤UE活性隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)有增加趨勢(shì)。綜合而言，SOD活性、CAT活性、MDA含量與土壤ACP活性隨辛硫磷初始濃度不同均會(huì)發(fā)生變化，這4種指標(biāo)可作為評(píng)價(jià)辛硫磷生態(tài)毒理效應(yīng)的生物標(biāo)志物，在辛硫磷的使用以及環(huán)境安全性評(píng)價(jià)過(guò)程中應(yīng)給予考慮。

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Ecotoxicologicaleffectofphoximpollutioninsoilonearthworms

JIARu，WANGMengyuan，HUANGQing.

(SchoolofMaterialsScienceandEngineering，BeijingInstituteofTechnology，Beijing100081)

賈 茹，女，1992年生，碩士研究生，研究方向?yàn)橥寥拉h(huán)境化學(xué)。#

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*“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(No.2013BAD16B01)；北京理工大學(xué)基礎(chǔ)研究基金資助項(xiàng)目(No.20141042004)；北京理工大學(xué)科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015CX02027)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.09.003

2016-04-29)