畜禽衣原體病水平傳播免疫阻斷技術(shù)應(yīng)用

趙靜 朱雅寧 （天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 300402）

畜禽衣原體病水平傳播免疫阻斷技術(shù)應(yīng)用

趙靜 朱雅寧 （天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 300402）

天津地區(qū)畜禽衣原體病已廣泛存在，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，為有效防控衣原體病的發(fā)生，我們對(duì)疫苗進(jìn)行監(jiān)測和篩選，防止疫苗攜帶病原感染雞群，造成衣原體經(jīng)疫苗水平傳播。

衣原體??；疫苗篩選；水平傳播阻斷技術(shù)；應(yīng)用推廣

衣原體 (Chlamydia)是一種多宿主性病原微生物，可感染包括人在內(nèi)的靈長類動(dòng)物、家養(yǎng)和野生哺乳動(dòng)物、禽類及兩棲動(dòng)物。在臨床上引起支氣管肺炎、結(jié)膜炎、肺炎、腸炎等，犢牛、仔豬多表現(xiàn)為肺腸炎，1日齡雛雞可急性死亡，不死的出現(xiàn)結(jié)膜炎、喜蹲臥或呈企鵝姿勢站立、腹瀉、排綠色稀便。衣原體能在易感畜禽之間通過直接接觸或傳播媒介(如昆蟲、老鼠、風(fēng)等)的作用傳染，并在一定范圍內(nèi)流行。故若能有效阻斷水平傳播途徑，可有效減少衣原體病的傳播和發(fā)病，為衣原體病的防治提供新的技術(shù)途徑。

本研究引進(jìn)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的 “畜禽衣原體綜合防治技術(shù)與應(yīng)用研究”項(xiàng)目中的衣原體水平傳播阻斷技術(shù)，對(duì)天津畜禽養(yǎng)殖場使用的疫苗進(jìn)行監(jiān)測和篩選，防止疫苗攜帶病原感染雞群，造成衣原體經(jīng)疫苗水平傳播，從而有效防控畜禽衣原體的發(fā)生，降低養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生危害。

1 免疫阻斷技術(shù)的示范應(yīng)用

1.1 免疫

1.1.1 背景

本研究引進(jìn)中國農(nóng)業(yè)大學(xué) “畜禽衣原體病綜合防治技術(shù)與應(yīng)用研究”（2008年教育部科學(xué)技術(shù)進(jìn)步一等獎(jiǎng)，證書號(hào)2008-144）技術(shù)成果，利用其提供的雞衣原體亞單位基因工程疫苗、牛衣原體滅活疫苗、豬衣原體滅活疫苗，結(jié)合天津地區(qū)的實(shí)際情況，分別制定了適合禽場、牛場、豬場的免疫程序。

1.1.2 免疫程序

（1）禽免疫程序：30日齡、45日齡各免疫1次，劑量為0.5ml/只，每180天免疫1次，劑量為0.5ml/只。

（2）豬免疫程序：繁殖母豬在配種前或配種后1個(gè)月內(nèi)免疫，種公豬春秋各免疫1次，免疫劑量為2ml/頭份。

（3）牛免疫程序：適繁母牛在每次配種前1個(gè)月或配種后1個(gè)月免疫，免疫劑量為4～5ml/頭，新生犢牛在斷奶后1個(gè)月內(nèi)注射疫苗，免疫劑量為2ml/頭，種公牛每年免疫兩次，免疫劑量為4～5ml/頭。

1.1.3 材料和方法

（1） 樣品

血清樣品：雞、豬、牛血清。

棉拭子樣品：雞咽喉棉拭子、母豬陰道棉拭子、牛陰道棉拭子。

（2） 試劑

衣原體間接血凝 (IHA)試驗(yàn)試劑，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，抗原批號(hào)130524，稀釋液130524，陽性血清130403，陰性血清130524。

鸚鵡熱衣原體 （ACP）核酸檢測試劑盒：購自北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司。

（3） 疫苗

雞衣原體亞單位基因工程疫苗、豬衣原體滅活疫苗、牛衣原體滅活疫苗。

（4） 方法

①間接血凝抑制試驗(yàn) （IHA）

a)每孔加入75μl稀釋液。

b)在第一孔加入25μl被檢血清，呈4倍遞增稀釋3孔（1∶4～1∶16）， 第 3 孔棄去 25μl。 同一板上同時(shí)設(shè)陽性、 陰性和空白對(duì)照各2孔 （2個(gè)陽性、2個(gè)陰性）。

c)每孔加入稀釋的抗原25μl，置微型振蕩器上震蕩2min，封口，在37℃作用2h后判定結(jié)果。

結(jié)果判定 ：對(duì)照試驗(yàn)成立前提下，出現(xiàn) “++”以上的凝集現(xiàn)象者判為陽性凝集。

哺乳動(dòng)物血清效價(jià)≥1∶64判為陽性。

禽類血清效價(jià)≥1∶16判為陽性。

②熒光PCR試驗(yàn)

a)衣原體基因組DNA提取。

樣品處理：取1ml生理鹽水加入離心管中，充分洗滌棉拭子，將洗滌液轉(zhuǎn)至1.5ml干凈離心管中，13000rpm離心5min，棄上清，保留沉淀。

向樣品中加入50μl核酸提取液充分混勻，100℃裂解10min。13000rpm離心3min，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。

陰性質(zhì)控品：取50μl陰性質(zhì)控品加入50μl核酸提取液，充分震蕩。然后 100℃裂解 10min，然后 13000rpm離心3min，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。

ACP-陽性質(zhì)控品：直接取4μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

b)PCR擴(kuò)增

將ACP-PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。

設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+4管陽性對(duì)照），每個(gè)測試反應(yīng)體系配制為：ACP-PCR MIX 24μl， Taq 酶系 2μl。

c）結(jié)果判定

如果Ct值＜38，判定為陽性。

如果38＜Ct值＜40，為可疑，建議重新檢測，重新檢測若38＜Ct值＜40判為陽性，否則為陰性。

如果Ct值≥40，判定為陰性。

1.2 免疫抗體監(jiān)測結(jié)果

在全市7個(gè)養(yǎng)殖場進(jìn)行畜禽衣原體疫苗免疫技術(shù)的示范應(yīng)用。分別在禽免疫前和免疫后30d，豬、牛免疫前和免疫后21d，采集血清樣品和棉拭子樣品，采用IHA間接血凝檢測方法和熒光PCR檢測方法進(jìn)行抗體、抗原檢測，結(jié)果見表1。

表1 示范場疫苗免疫前后監(jiān)測結(jié)果

2 疫苗阻斷技術(shù)的示范應(yīng)用

2.1 種禽場常規(guī)弱毒疫苗的監(jiān)測和篩選

2.1.1 雞胚源弱毒疫苗樣品

收集疫苗42份，其中雞傳染性法氏囊病弱毒疫苗6份，雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗2份，雞痘活疫苗2份，雞傳染性喉氣管炎弱毒疫苗2份；雞新城疫傳染性支氣管炎二聯(lián)弱毒疫苗15份；雞新城疫弱毒疫苗15份。

2.1.2 試劑和檢測方法 （見1.1.3中的 （2）和1.1.3中的 （4））

2.2 疫苗的監(jiān)測和篩選

使用熒光PCR檢測方法，對(duì)天津地區(qū)示范雞場使用的常規(guī)弱毒疫苗進(jìn)行監(jiān)測和篩選，共檢測樣品42份，其中雞新城疫活疫苗陽性檢出率最高為26.7%、雞傳染性法氏囊病活疫苗陽性檢出率為16.7%、雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗陽性檢出率為20%，雞痘活疫苗、雞傳染性喉氣管炎弱毒疫苗、雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗樣品中未檢出衣原體抗原。檢測結(jié)果見表2。對(duì)父母代種雞免疫的雞胚源疫苗的衣原體監(jiān)測，阻止進(jìn)口、國產(chǎn)弱毒疫苗攜帶病原感染種雞群體，確保選用無污染的疫苗。

表2 不同生產(chǎn)廠家的不同批號(hào)雞胚源疫苗衣原體抗原檢測結(jié)果

3 示范應(yīng)用效果

通過在畜禽示范場進(jìn)行免疫阻斷技術(shù)的示范應(yīng)用，大幅降低了畜禽示范場的死淘率，詳見表3。

表3 示范場示范應(yīng)用前后死淘率比較

4 畜禽衣原體免疫阻斷技術(shù)的推廣應(yīng)用

綜上所述，已經(jīng)完成的應(yīng)用示范表明疫苗免疫效果確實(shí)，對(duì)畜禽無不良反應(yīng)，減少了畜禽的死淘率，由此帶動(dòng)輻射天津市12個(gè)區(qū)縣的畜禽養(yǎng)殖場進(jìn)行疫苗免疫阻斷的應(yīng)用，共計(jì)禽只641000羽份，豬只107700頭份，牛只62200頭份。

表4 各區(qū)縣推廣情況 （單位：羽份、頭份）

5 討論和結(jié)論

動(dòng)物衣原體病的傳播流行給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失，直接影響著畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，也對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重的威脅，為有效控制衣原體病的發(fā)生和流行，可從水平方向進(jìn)行阻斷，應(yīng)用疫苗免疫和疫苗篩選相結(jié)合的方法進(jìn)行預(yù)防。

（1）7個(gè)示范場在疫苗免疫后抗體陽性率由免疫前19.68%上升至94.60%，免疫后抗原陽性率由免疫前的11.36%降至2.08%。

（2）7個(gè)示范場在疫苗免疫和疫苗篩選后死淘率由應(yīng)用前的9.22%降至7.80%。

（3）疫苗注射后畜禽的飲水、進(jìn)食和精神狀態(tài)均無異常，生產(chǎn)性能基本正常，說明示范的衣原體疫苗有效性、安全性良好。

（4）通過對(duì)雞場的雞胚源疫苗進(jìn)行篩選和監(jiān)測，說明一些疫苗中確實(shí)存在衣原體感染，通過疫苗監(jiān)測和篩選確實(shí)能夠阻止衣原體在疫苗上的傳播，但由于各雞場用的疫苗種類不同、生產(chǎn)廠家也不盡相同，故此方法不適用于大規(guī)模推廣。