沉默cIAP-1基因表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞放療敏感性的影響

崔現(xiàn)平，馬玉華

(1山東省立醫(yī)院，濟(jì)南250014；2臨清市人民醫(yī)院)

沉默cIAP-1基因表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞放療敏感性的影響

崔現(xiàn)平1，馬玉華2

(1山東省立醫(yī)院，濟(jì)南250014；2臨清市人民醫(yī)院)

目的觀察沉默細(xì)胞凋亡抑制蛋白1(cIAP-1)基因表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞HS766T放療敏感性的影響。方法將HS766T細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、空載組和觀察組，觀察組和空載組分別轉(zhuǎn)染沉默cIAP-1基因質(zhì)粒cIAP-1-RNAi和陰性基因質(zhì)粒NC-RNAi，對(duì)照組不轉(zhuǎn)染處理，分別采用Real-time PCR法和Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中的cIAP-1 mRNA及蛋白；取觀察組cIAP-1穩(wěn)定沉默HS766T細(xì)胞及其對(duì)照組HS766T細(xì)胞，用CCK-8 法測(cè)算2、4、6、8 Gy X線照射24 h的細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀測(cè)算6 Gy X線照射12、24、48 h的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果觀察組較空載組和對(duì)照組cIAP-1 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)，空載組和對(duì)照組cIAP-1 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著照射劑量增加，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)；同等照射劑量下，觀察組細(xì)胞存活率低于空載組和對(duì)照組(P均<0.05)，空載組和對(duì)照組細(xì)胞存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)；同一時(shí)點(diǎn)內(nèi)，觀察組細(xì)胞凋亡率高于空載組和對(duì)照組(P均<0.05)，空載組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論沉默cIAP-1基因表達(dá)，可抑制胰腺癌細(xì)胞存活、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的放療敏感性。

胰腺癌；細(xì)胞凋亡抑制蛋白1；HS766T細(xì)胞；放射療法；敏感性

胰腺癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤，其早期發(fā)病隱匿，一般進(jìn)展至中晚期才能確診，患者接受治療后有著較高的復(fù)發(fā)率和病死率[1]。放療作為胰腺癌治療的常用方法，盡管能極大提高胰腺癌患者的局部控制率和生存率，但放療抵抗所導(dǎo)致的放療失敗仍是目前胰腺癌臨床治療的難點(diǎn)[2]，如何有效提高胰腺癌患者的放療敏感性成為目前胰腺癌治療的研究熱點(diǎn)。研究[3]證實(shí)，凋亡受阻是腫瘤細(xì)胞化療及放療耐受的主要分子機(jī)制之一，凋亡信號(hào)通路和凋亡相關(guān)調(diào)控因子的變化均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡耐受。細(xì)胞凋亡抑制蛋白1(cIAP-1)作為內(nèi)源性抑制凋亡蛋白家族成員，在多種腫瘤組織中可檢測(cè)到cIAP-1高表達(dá)；它可通過調(diào)控 Caspase而阻斷凋亡效應(yīng)進(jìn)程，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[4,5]。迄今，關(guān)于cIAP1基因?qū)σ认侔┘?xì)胞放療敏感性的研究報(bào)道極其有限。2015年2月～2016年6月，我們觀察了沉默cIAP-1基因表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞HS766T放療敏感性的影響，探討 cIAP-1基因在胰腺癌細(xì)胞耐藥性方面所發(fā)揮的作用，為提高胰腺癌的化療效果提供研究方向。

1 資料與方法

1.1 材料 HS766T細(xì)胞(上海華瑞生物科技有限公司)，沉默cIAP-1基因質(zhì)粒cIAP-1-RNAi和陰性基因質(zhì)粒NC-RNAi(上海華瑞生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板(NEST公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)，PBS(Hyclone公司)，DMSO(Hyclone公司)，DAPI(碧云天公司)。恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo HERACELL150i公司)，倒置生物顯微鏡(OPTEC BDS200-PH公司)，低速臺(tái)式離心機(jī)(飛鴿 80-2B公司)，無菌超凈臺(tái)(蘇潔 SW-CJ-1FD公司)，倒置光學(xué)顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)儀(美國(guó) BioTek公司)，兔抗人單克隆抗體 cIAP-1(Abcam 公司)，兔抗人GAPDH抗體(Abcam 公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司)，Real-time PCR SYBER Green 試劑盒(Roche公司)，BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HS766T細(xì)胞的培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染 將HS766T細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%左右時(shí)隨機(jī)分為對(duì)照組、空載組和觀察組。觀察組和空載組分別按MOI值50轉(zhuǎn)染沉沉默cIAP-1基因質(zhì)粒cIAP-1-RNAi和陰性基因質(zhì)粒NC-RNAi，對(duì)照組不轉(zhuǎn)染處理。

1.2.2 HS766T細(xì)胞中cIAP-1 mRNA檢測(cè) 采用Real-time PCR法。收集轉(zhuǎn)染48 h各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，離心后棄去培養(yǎng)液；TRIzol法提取總RNA，采用Roche逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)cIAP-1特異性引物，上游引物為5′-TTGTCAACTTCAGATACCACTGGAG-3′，下游引物為5′-CAAGGCAGATTTAACCACAGGTG-3′，長(zhǎng)度為123 bp。以cDNA為模板，利用SYBER Green 法在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的HS766T細(xì)胞cIAP-1及內(nèi)參對(duì)照GAPDH mRNA的表達(dá)。擴(kuò)增條件: 94 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 20 s， 循環(huán) 40 次。記錄各管擴(kuò)增 CT 值及基因拷貝數(shù)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.3 HS766T細(xì)胞中cIAP-1蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染48 h生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，離心后棄去培養(yǎng)液。加入細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，4 ℃條件下離心提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；吸取適量蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上；5% BSA封閉后，4 ℃條件下加入cIAP-1一抗(1∶2 000)孵育過夜，洗滌后加入HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000)，GAPDH 蛋白作為內(nèi)參。ECL 試劑顯色后，用Image J 圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶平均灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 HS766T細(xì)胞照射及存活率測(cè)算 采用CCK-8 法。取觀察組cIAP-1穩(wěn)定沉默HS766T細(xì)胞及其對(duì)照組HS766T細(xì)胞，用胰蛋白酶消化；調(diào)整細(xì)胞密度后以5×103/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用ELEKTA Synergy直線加速器照射裝置(德國(guó)西門子公司產(chǎn)品)分別給予 2、4、6、8 Gy X線照射24 h，照射條件為源皮距100 cm、劑量率200 cGy /min，每一劑量設(shè)3個(gè)平行樣本。在最后4 h每孔加CCK8溶液10 μL，4 h后于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算出活細(xì)胞數(shù)目并計(jì)算細(xì)胞存活率，繪制細(xì)胞存活率曲線。

1.2.5 HS766T細(xì)胞照射及凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞儀。取觀察組cIAP-1穩(wěn)定沉默HS766T細(xì)胞及其對(duì)照組HS766T細(xì)胞，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后給予6 Gy X線分別照射12、24、48 h。以PBS清洗后加入胰酶消化，4 ℃條件下離心后收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL；將不同的處理組各吸取 100 μL的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，在每管中加入5 μL Annexin V-APC 和10 μL 7-AAD，混勻后置于4℃冰箱避光15 min，再加入380 μL的 1×binding buffer置每個(gè)EP管，4 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 各組cIAP-1 mRNA和蛋白表達(dá)表達(dá)比較 觀察組較空載組和對(duì)照組cIAP-1 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)，空載組和對(duì)照組cIAP-1 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

表1 各組cIAP-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空載組比較，#P<0.05。

2.2 各組不同照射劑量下細(xì)胞存活率比較 隨著照射劑量增加，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)；同等照射劑量下，觀察組細(xì)胞存活率低于空載組和對(duì)照組(P均<0.05)，空載組和對(duì)照組細(xì)胞存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2、圖1。

表2 各組不同照射劑量下細(xì)胞存活率比較

注：與對(duì)照組同等照射劑量比較，*P<0.05；與空載組同等照射劑量比較，#P<0.05。

注：與空載組和對(duì)照組同等照射劑量比較，*P<0.05。

圖1X線照射24h時(shí)HST66T細(xì)胞存活曲線

2.3 各組同等照射劑量下不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較 隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)；同一時(shí)點(diǎn)內(nèi)，觀察組細(xì)胞凋亡率高于空載組和對(duì)照組(P均<0.05)，空載組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3。

3 討論

胰腺癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，80%的患者在診斷時(shí)已進(jìn)展至晚期[6]。放療是局部晚期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移胰腺癌患者的主要治療手段，但臨床胰腺癌患者的放療的敏感性差，易發(fā)生耐受，嚴(yán)重影響治療效果，常規(guī)放療患者的5年生存率僅為10%～20%，局部復(fù)發(fā)病死率高達(dá)60%～80%[7]，因此提高瘤體對(duì)放療的敏感性，減少耐受性是目前改善胰腺癌患者預(yù)后的重要策略。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是細(xì)胞增殖和凋亡失衡的結(jié)果，凋亡的抑制不僅延長(zhǎng)了腫瘤細(xì)胞的生存時(shí)間、促進(jìn)了腫瘤的惡性增殖，還與化療及放療耐受密切相關(guān)[3,8]。IAP家族作為一類重要的內(nèi)源性凋亡抑制蛋白，可通過阻斷凋亡信號(hào)激活及傳導(dǎo)，促使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視及細(xì)胞毒性藥物的殺傷作用[9]。目前認(rèn)為，放療射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)主要是通過破壞DNA完整性、激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑而實(shí)現(xiàn)的。因此，IAP對(duì)凋亡信號(hào)的調(diào)控作用是影響放療發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的關(guān)鍵。

表3 各組同等照射劑量下不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05；與空載組同時(shí)點(diǎn)比較，#P<0.05。

IAP廣泛分布于成人組織中，其家族成員cIAP-1定位于染色體11q22～q23。研究顯示，多種惡性腫瘤組織中可檢測(cè)到高表達(dá)的cIAP-1蛋白[10]。Gordon等[11]發(fā)現(xiàn)，惡性胸膜間皮瘤患者組織中cIAP-1 mRNA及蛋白表達(dá)量均高于正常人群，下調(diào)cIAP-1 mRNA 表達(dá)水平可增強(qiáng)惡性胸膜間皮瘤細(xì)胞株對(duì)順鉑敏感性。在舌鱗狀細(xì)胞癌中 cIAP -1表達(dá)與Caspase-3呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性[12]。目前研究認(rèn)為，過量表達(dá)的cIAP-1可阻斷腫瘤壞死因子、Fas等介導(dǎo)的凋亡信號(hào)，抑制化療藥物、放射線誘導(dǎo)的凋亡引發(fā)腫瘤細(xì)胞的耐藥性[13]。因此,cIAP-1被普遍認(rèn)為是放療、化療的預(yù)后標(biāo)記物。本研究為了闡明 cIAP-1對(duì)胰腺癌細(xì)胞放療敏感性的作用，我們通過RNAi抑制cIAP-1表達(dá)，觀察cIAP-1表達(dá)沉默后HS766T細(xì)胞對(duì)X射線敏感性的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，cIAP-1表達(dá)沉默的觀察組細(xì)胞存活率顯著低于空載組和對(duì)照組，凋亡率顯著高于空載組和對(duì)照組，提示沉默cIAP-1基因可提高HS766T細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。前期研究發(fā)現(xiàn)，cIAP-1表達(dá)下調(diào)可抑制膀胱癌PC-3細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其對(duì)TRAIL的敏感性，促進(jìn)PC-3細(xì)胞的凋亡，證實(shí)cIAP-1參與了調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，并認(rèn)為cIAP-1主要是通過抑制 Caspase 家族中Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的活性實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用[14]。鑒于Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡主要是通過由死亡受體起始的外源途徑和線粒體起始的內(nèi)源途徑共同實(shí)現(xiàn)的[15,16]，而線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑在X線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中核心作用已得到普遍認(rèn)可，我們推測(cè)本研究中cIAP-1沉默對(duì)胰腺癌放療敏感性的促進(jìn)作用也是通過激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實(shí)cIAP-1表達(dá)沉默可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞放療后凋亡，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的放療敏感性，通過靶向沉默 cIAP-1基因可改善胰腺癌細(xì)胞的放療抵抗，為今后胰腺癌的靶向治療策略提供了新的方向。

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Effect of silencing cIAP-1 gene on sensitivity of pancreatic cancer cells to radiotherapy

CUIXianping1,MAYuhua

(1ShandongProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Jinan250014;China)

ObjectiveTo observe the effect of silencing cellular inhibitor of apoptosis protein 1 (c-IAP1) on the sensitivity of pancreatic cancer HS766T cells to radiotherapy.MethodsHS766T cells were randomly divided into the control group, empty vector group, and observation group. The observation group and the empty vector group were transfected with silencing cIAP-1 gene plasmid cIAP-1-RNAi and negative gene plasmid NC-RNAi, and the control group was not transfected. The cIAP-1 mRNA and protein levels of cells were detected by real-time PCR and Western blotting. The HS766T cells with stably silenced cIAP-1 in the observation group and HS766T cells in the control group were collected to determine the survival rate of cells after 2, 4, 6 and 8 Gy X ray irradiation for 24 h by CCK-8, as well as the apoptotic rate of cells after 6 Gy X ray irradiation for 12, 24 and 48 h by flow cytometry.ResultsThe relative expression of cIAP-1 mRNA and protein in the observation group was lower than that in the empty vector group and the control group (P<0.05), and there was no significant difference in the relative expression of cIAP-1 mRNA and protein between the empty vector group and the control group. With the increase of radiation dose, the survival rate of cells decreased; under the same irradiation dose, the cell survival rate in observation group was lower than that in the empty vector group and the control group (P<0.05), and the cell survival rate showed no significant difference between the empty vector and control group. Over the time of irradiation, the apoptotic rate showed an increasing trend; at the same time point, the apoptotic rate of cells in the observation group was higher than that of the empty vector group and the control group (P<0.05), and there was no significant difference between the empty vector and control group.ConclusionSilencing cIAP-1 gene expression can inhibit the survival of pancreatic cancer cells, promote apoptosis and enhance the sensitivity of pancreatic cancer cells to radiotherapy.

pancreatic carcinoma; cellular inhibitor of apoptosis protein 1; HS766T cells; radiotherapy; sensitivity

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.004

R735.9

A

1002-266X(2017)34-0012-04

2016-09-23)

崔現(xiàn)平(1980-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楦文懸饶[瘤的臨床治療，E-mail: cuixping@163.com

馬玉華(1979-),女，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槠胀ㄍ饪萍膊〉幕A(chǔ)與臨床。E-mail: lqlzzbgs@163.com