生物質(zhì)木質(zhì)素分離和結(jié)構(gòu)研究方法進(jìn)展

文甲龍，陳天影，孫潤(rùn)倉

(北京林業(yè)大學(xué)林木生物質(zhì)化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

生物質(zhì)木質(zhì)素分離和結(jié)構(gòu)研究方法進(jìn)展

文甲龍，陳天影，孫潤(rùn)倉*

(北京林業(yè)大學(xué)林木生物質(zhì)化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

木質(zhì)素是自然界中最豐富的可再生芳香族聚合物，其高附加值化利用可減少目前木質(zhì)素資源燃燒所導(dǎo)致的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。生物質(zhì)細(xì)胞壁中三大組分(纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)通過共價(jià)鍵和氫鍵形成了致密而復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使得木質(zhì)素難以高效分離。若要實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)木質(zhì)素高效分離，首先需明確原料中木質(zhì)素的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和活性基團(tuán)?；谀举|(zhì)素結(jié)構(gòu)明確的生物質(zhì)原料才能夠更有效地選擇和開發(fā)木質(zhì)素解離及解聚方法。筆者主要概述了目前結(jié)構(gòu)分析用的木質(zhì)素分離和結(jié)構(gòu)分析方法研究進(jìn)展，重點(diǎn)闡述了液體核磁共振技術(shù)在分離木質(zhì)素定性和定量結(jié)構(gòu)方面的應(yīng)用，并基于目前的研究進(jìn)展提出了該領(lǐng)域的研究趨勢(shì)?？傊?，木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)解析將為樹木基因調(diào)控、林木遺傳育種和木質(zhì)纖維原料的生物煉制提供相關(guān)理論依據(jù)。

木質(zhì)素；分離純化；結(jié)構(gòu)分析；核磁共振技術(shù)

木質(zhì)素廣泛存在于高等植物中，是僅次于纖維素的第二大生物質(zhì)資源,占植物體總質(zhì)量的20%～30%。木質(zhì)素通過與半纖維素和纖維素形成共價(jià)鍵和氫鍵的形式連接在一起，共同構(gòu)成植物的木質(zhì)部。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，木質(zhì)素不僅提供植物組織機(jī)械支撐，保護(hù)細(xì)胞壁免受生物降解，而且能夠促進(jìn)植物中的水分傳輸。以植物纖維為原料的行業(yè)，如制漿造紙和燃料乙醇均有木質(zhì)素殘?jiān)欧拧?jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球化學(xué)漿產(chǎn)量每年約為1.5億t，同時(shí)產(chǎn)生木質(zhì)素0.7億t。由于制漿工業(yè)木質(zhì)素純度較低，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此木質(zhì)素產(chǎn)品的開發(fā)進(jìn)展較為緩慢，只有少部分高品質(zhì)工業(yè)木質(zhì)素(木質(zhì)素磺酸鹽)被開發(fā)為表面活性劑等產(chǎn)品，而約95%以上的木質(zhì)素直接用于燃燒獲取熱量，這造成了大量資源浪費(fèi)，并產(chǎn)生環(huán)境問題[1-2]。另外，目前的纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)也產(chǎn)生大量發(fā)酵殘?jiān)举|(zhì)素，如何將殘?jiān)举|(zhì)素高效經(jīng)濟(jì)地轉(zhuǎn)化為能源和化學(xué)品是目前面臨的科學(xué)難題[3]。不同的生物質(zhì)原料和預(yù)處理手段導(dǎo)致殘?jiān)举|(zhì)素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和反應(yīng)活性存在差異，因此需對(duì)殘?jiān)举|(zhì)素結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，進(jìn)而有針對(duì)性地選擇和開發(fā)相應(yīng)轉(zhuǎn)化方法，實(shí)現(xiàn)資源的高效轉(zhuǎn)化利用。此外，在木質(zhì)纖維原料預(yù)處理技術(shù)開發(fā)過程中，由于木質(zhì)素是構(gòu)成生物質(zhì)原料“抗降解屏障”最為重要的因素[4]，木質(zhì)素的存在使得細(xì)胞壁三大組分難以有效解構(gòu)和解離，進(jìn)而降低生物煉制總體效率。因此，研究生物質(zhì)原料中木質(zhì)素化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)既是破除生物質(zhì)“抗降解屏障”的基礎(chǔ)，又可為生物質(zhì)原料中主要組分高效解構(gòu)提供方法和技術(shù)支撐。筆者對(duì)木質(zhì)素分離和結(jié)構(gòu)分析方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述，提出了該領(lǐng)域的未來研究趨勢(shì)。

1 木質(zhì)素基本結(jié)構(gòu)

木質(zhì)素是自然界中含量最為豐富的可再生芳基化合物資源，其芳環(huán)聚合物結(jié)構(gòu)中主要包含甲氧基、酚羥基、醇羥基、端基醛等官能團(tuán)[5]。木質(zhì)素基本結(jié)構(gòu)是由對(duì)香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)3種前驅(qū)體物質(zhì)在酶的作用下經(jīng)脫氫聚合及自由基偶合形成的木質(zhì)素立體大分子結(jié)構(gòu)，與前驅(qū)體對(duì)應(yīng)的對(duì)羥苯基(H)、愈創(chuàng)木基(G)和紫丁香基(S)(圖1)構(gòu)成了木質(zhì)素的3種基本結(jié)構(gòu)單元。此外，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中還含有其他前驅(qū)體結(jié)構(gòu)，如對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸等[6]。在木質(zhì)素前驅(qū)體聚合過程中，木質(zhì)素單體之間主要形成芳基醚鍵(α-O-4′,β-O-4′)、樹脂醇(β-β′)、苯基香豆?jié)M(β-5′)、螺環(huán)二烯酮(β-1′)等基本連接鍵(圖2)。除這些連接鍵外，木質(zhì)素與碳水化合物間也存在一定程度的化學(xué)交聯(lián)，主要連接類型有芐基醚鍵、γ-酯鍵、苯基糖苷鍵等(圖2)。其中，禾本科植物原料的木質(zhì)素主要通過阿魏酸的橋接作用與碳水化合物產(chǎn)生交聯(lián)[7]。雖然木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)單元和連接方式已基本明確，但對(duì)于不同原料而言，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確信息主要受到木質(zhì)素分離方法和分析手段的影響。因此，獲得具有代表性的木質(zhì)素樣品對(duì)于準(zhǔn)確解析木質(zhì)素結(jié)構(gòu)信息更為有利[8-9]。

圖1 木質(zhì)素3種前驅(qū)體及相對(duì)應(yīng)基本結(jié)構(gòu)單元Fig.1 Primary precursors and phenylpropanoid units of lignin

圖2 常見木質(zhì)素連接鍵及木質(zhì)素碳水化合物連接鍵Fig.2 Common linkage of lignin and lignin-carbohydrate complex (LCC) linkages

2 木質(zhì)素分離研究

2.1 一般木質(zhì)素分離

用于結(jié)構(gòu)表征的木質(zhì)素，按照分離原理大致分為兩類[10]：一類為溶解類木質(zhì)素，即采用有機(jī)溶劑(例如1,4-二氧六環(huán))從球磨的生物質(zhì)原料中溶解出木質(zhì)素，經(jīng)純化后用于結(jié)構(gòu)表征，目前用于結(jié)構(gòu)分析的木質(zhì)素大多數(shù)屬于這一類；另一類為殘?jiān)举|(zhì)素，即采用酶水解(纖維素酶和半纖維素酶)方法去除絕大部分碳水化合物，而保留生物質(zhì)原料中殘?jiān)举|(zhì)素，但由于殘?jiān)举|(zhì)素樣品中含有少量未水解碳水化合物，從而導(dǎo)致其溶解度較差，因此該樣品一般不能用于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)分析。

一般情況下分離過程中結(jié)構(gòu)變化小、得率高、代表性強(qiáng)的木質(zhì)素樣品更適用于木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)分析。通常采用96%的1,4-二氧六環(huán)抽提球磨的生物質(zhì)原料，經(jīng)分離純化后得到木質(zhì)素樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。1956年研究人員提出了磨木木質(zhì)素(MWL)的制備方法[11]。該方法一直被研究人員用來分離原本木質(zhì)素，用于某種植物中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)表征。但由于傳統(tǒng)的MWL得率相對(duì)較低，且其得率與球磨方式和時(shí)間密切相關(guān)[12]，因此需要對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)。研究人員采用纖維素酶處理球磨木粉除去大部分碳水化合物，酶解后的殘?jiān)儆?6%的1,4-二氧六環(huán)提取得到纖維素酶解木質(zhì)素(CEL)。研究結(jié)果顯示，在結(jié)構(gòu)上CEL與MWL較為相似，但CEL得率明顯高于MWL，因此CEL較MWL更能代表原本木質(zhì)素[13]。然而，纖維素的高結(jié)晶結(jié)構(gòu)和不可及性較大地影響了酶水解效率，從而導(dǎo)致酶水解殘?jiān)腥杂胁糠植荒芩獾奶妓衔?。為克服該困難，酶解前的預(yù)潤(rùn)脹處理受到研究人員的廣泛關(guān)注，如采用有機(jī)溶劑(二甲基乙酰胺/氯化鋰)先預(yù)潤(rùn)脹或溶解球磨后的木粉，再逐滴加入水或乙酸乙酯中再生，隨后用纖維素復(fù)合酶處理再生后的殘?jiān)黐14]。預(yù)潤(rùn)脹可降低纖維素結(jié)晶度，在一定程度上提高再生細(xì)胞壁的酶解效率，增加酶水解木質(zhì)素的得率，但此方法在前期預(yù)潤(rùn)脹過程中會(huì)損失少量木質(zhì)素片段。2003年，根據(jù)苯基糖苷鍵、酯鍵、芐基醚鍵等木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體(lignin-carbohydrate complex,LCC)聯(lián)接鍵可在弱酸條件下部分?jǐn)嗔眩芯咳藛T提出了一種新的木質(zhì)素分離方法[15]。該方法采用0.01 mol/L鹽酸和85%的二氧六環(huán)水溶液對(duì)酶水解殘?jiān)M(jìn)行加溫提取(86℃)，制備得到的木質(zhì)素被命名為酶解-溫和酸解木質(zhì)素(EMAL)。經(jīng)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，利用溫和酸解分離得到的木質(zhì)素較傳統(tǒng)的MWL和CEL得率高，純度高[15]，且在 EMAL提取過程中少量木質(zhì)素與碳水化合物復(fù)合體的聯(lián)接鍵發(fā)生了斷裂，而木質(zhì)素大分子內(nèi)的各主要聯(lián)接鍵并無明顯斷裂[15]。上述方法一般適于木材類生物質(zhì)，而草類原料中由于存在羥基肉桂酸交聯(lián)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其木質(zhì)素得率和純度相對(duì)較低。在草類原料中，對(duì)香豆酸一般以酯鍵連接在木質(zhì)素側(cè)鏈的位置，而阿魏酸分別和半纖維素與木質(zhì)素以酯鍵和醚鍵相連，形成交聯(lián)的橋式結(jié)構(gòu)。針對(duì)這些特殊的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，研究人員提出了不同梯度條件下的溫和堿處理草類原料，并對(duì)得到的不同木質(zhì)素組分結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征[16]。該方法利用堿處理斷裂木質(zhì)素與碳水化合物之間對(duì)堿敏感的聯(lián)接鍵，使大部分木質(zhì)素與碳水化合物分離，然后通過溶解和沉淀方式分離木質(zhì)素組分。上述方法均涉及溶劑提取和木質(zhì)素的酸析沉淀分離。Wen等[17]以桉木為原料，提出了基于室溫弱堿處理結(jié)合原位酶解的“全木質(zhì)素”的制備方法，得到以殘?jiān)问奖Ａ粝聛淼娜鯄A潤(rùn)脹酶解殘?jiān)举|(zhì)素(SREL)，并對(duì)該殘?jiān)举|(zhì)素進(jìn)行全面的結(jié)構(gòu)研究。相比較而言，用于提取CEL的酶水解殘?jiān)捎谖茨茴A(yù)潤(rùn)脹而導(dǎo)致酶水解效率有限，最終使得殘?jiān)举|(zhì)素在氘代試劑中的溶解度較差而無法進(jìn)行后續(xù)分析。研究發(fā)現(xiàn)，SREL的得率(95%)明顯高于同等條件下的堿木質(zhì)素(AL，12%)和纖維素酶解木質(zhì)素(CEL，20%)，且SREL 含糖量(8.7%)相比同等條件下的CEL(13.4%)低[17]。通過元素分析、凝膠滲透色譜(GPC)、二維碳?xì)湎嚓P(guān)譜、磷譜和分析熱解技術(shù)對(duì)上述木質(zhì)素進(jìn)行全面表征，同時(shí)定量比較這些木質(zhì)素中的主要聯(lián)接鍵。核磁結(jié)果顯示，SREL與相應(yīng)CEL比較，紫丁香基含量高，且含有大量的β-O-4′ 聯(lián)接，酚羥基含量少，與傳統(tǒng)的酶木質(zhì)素CEL、堿木質(zhì)素AL的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)相似[17]。為避免弱堿預(yù)潤(rùn)脹對(duì)木質(zhì)素中某些特定結(jié)構(gòu)(?；瘑卧?造成破壞，研究人員對(duì)SREL方法進(jìn)行了改進(jìn)。Chen等[18]提出了一種基于兩次球磨和兩次酶解的殘?jiān)举|(zhì)素制備方法，該方法分離的木質(zhì)素具有得率高、代表性強(qiáng)、含糖量低、結(jié)構(gòu)完整、在氘代試劑中溶解度好等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為理想的結(jié)構(gòu)分析用的木質(zhì)素樣品?？傊?，上述殘?jiān)举|(zhì)素可以作為一種較有潛力的原本木質(zhì)素分離方法應(yīng)用于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)研究中，同時(shí)該方法制備的木質(zhì)素有助于全面鑒定植物細(xì)胞壁中全部木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特征，且該木質(zhì)素能夠作為“木質(zhì)素參照物”，從而促進(jìn)植物細(xì)胞壁解構(gòu)和木質(zhì)素解聚技術(shù)更加有效地開發(fā)。

2.2 生物煉制過程中特定結(jié)構(gòu)木質(zhì)素的分離提取

近年來，木質(zhì)素催化降解相關(guān)研究受到廣泛關(guān)注，相關(guān)研究進(jìn)展在文獻(xiàn)中已有詳細(xì)介紹[19]。事實(shí)上，由于木質(zhì)素來源和分離方法不同導(dǎo)致木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)差異，從而導(dǎo)致催化降解性能也不盡相同。有研究認(rèn)為木質(zhì)素中的β-O-4′ 聯(lián)接鍵含量可能影響木質(zhì)素降解產(chǎn)物的生成和分布，該研究認(rèn)為預(yù)處理過程中得到含有較高比例β-O-4′ 聯(lián)接鍵的木質(zhì)素，有利于木質(zhì)素的后續(xù)催化降解[20]。此外，低濃度硫酸輔助的γ-戊內(nèi)酯水溶液可以從木質(zhì)纖維素中提取出得率較高(約70%)、結(jié)構(gòu)較為完整的木質(zhì)素(芳基醚鍵含量較高)。研究人員將這種特定結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素用于木質(zhì)素催化降解，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素單體產(chǎn)率明顯提高[21]。近年來，研究人員對(duì)傳統(tǒng)的酸性二氧六環(huán)提取木質(zhì)素進(jìn)行改進(jìn)，即在提取過程中加入甲醛，發(fā)現(xiàn)加入甲醛使得木質(zhì)素的側(cè)鏈形成一個(gè)含有六元環(huán)的特定結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能有效阻止木質(zhì)素在提取和降解過程中的再縮合，最終實(shí)現(xiàn)該種特定結(jié)構(gòu)木質(zhì)素的高效催化降解[22]?？傊跏寄举|(zhì)素的結(jié)構(gòu)和后續(xù)的催化降解存在相關(guān)性，此方面需進(jìn)一步研究。

3 木質(zhì)素結(jié)構(gòu)分析技術(shù)進(jìn)展

木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)分析是木質(zhì)素研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)，也是木質(zhì)素轉(zhuǎn)化為材料和化學(xué)品的前提。

隨著分析方法的進(jìn)步，研究人員對(duì)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)和理解更加準(zhǔn)確和全面。在幾十年的研究中，木質(zhì)素化學(xué)家相繼發(fā)展了不同的化學(xué)降解方法、色譜技術(shù)和波譜技術(shù)，從而使木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)研究更加準(zhǔn)確。一般地，木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)分析方法包括化學(xué)降解法和波譜法兩類?；瘜W(xué)降解法主要包括硝基苯氧化法、高錳酸鉀氧化法、臭氧氧化法、酸水解法、硫醇酸解法、衍生化還原降解法(DFRC，derivatization followed by reductive cleavage)等；波譜法主要包括各種光譜技術(shù)，如紫外吸收光譜(UV)、傅里葉紅外吸收光譜(FT-IR)、拉曼光譜、核磁共振吸收光譜(1H NMR，13C NMR，31P NMR，2D-HSQC NMR)等[23]。

3.1 化學(xué)降解方法

硝基苯氧化法是研究木質(zhì)素苯環(huán)結(jié)構(gòu)的有效手段之一，該方法基于木質(zhì)素中β-芳基醚鍵的斷裂而形成芳環(huán)單體，進(jìn)而反推木質(zhì)素的組成(如S/G/H比例)。由于硝基苯氧化無法斷裂木質(zhì)素中的C—C鍵，因此，該方法只能測(cè)定非縮合木質(zhì)素(β-芳基醚)中的愈創(chuàng)木基丙烷、紫丁香基丙烷和對(duì)羥基苯丙烷的比例。高錳酸鉀氧化法則對(duì)木質(zhì)素側(cè)鏈進(jìn)行選擇性氧化，產(chǎn)物為芳香羧酸及其他脂肪族羧酸的混合物。通過分析降解產(chǎn)物，可以得到木質(zhì)素苯環(huán)結(jié)構(gòu)以及苯丙烷結(jié)構(gòu)單元間的連接方式、出現(xiàn)頻率等信息，但高錳酸鉀氧化法只能對(duì)樣品進(jìn)行定性分析。臭氧氧化法主要通過臭氧氧化降解木質(zhì)素，然后通過分析木質(zhì)素降解產(chǎn)物確定木質(zhì)素側(cè)鏈的立體化學(xué)。臭氧氧化法是將芳環(huán)氧化斷裂，通過與模型物比較，從而得到側(cè)鏈赤型與蘇型的比例，該法主要對(duì)木質(zhì)素β-O-4′ 聯(lián)接型的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。酸水解法是在含 0.2 mol/L HCl 的體積分?jǐn)?shù)為90%的二氧六環(huán)-水溶液中回流得到一系列木質(zhì)素降解產(chǎn)物，以此確認(rèn)木質(zhì)素中存在β-5′ 和β-O-4′ 連接。硫醇酸解法為酸解法的改良方法，其優(yōu)點(diǎn)在于可發(fā)生選擇性較強(qiáng)的斷裂反應(yīng)，并能形成高得率且可辨別的產(chǎn)物。但硫醇酸解法對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高，且需用到有惡臭氣味的乙硫醇，而且只能檢測(cè)β-O-4′ 鍵型連接的結(jié)構(gòu)單元。衍生化還原降解法(DFRC)可以選擇性地?cái)嗔涯举|(zhì)素中芳基醚鍵，得到乙?；哪举|(zhì)素單體，該方法沒有硫醇酸解法的惡臭味，是對(duì)硫醇酸解法的改進(jìn)[24-25]，但該法采用GC-MS定量測(cè)定木質(zhì)素降解產(chǎn)物時(shí)受到較大限制，每個(gè)降解產(chǎn)物均需合適的校正因子才可實(shí)現(xiàn)定量。校正因子需要用每一個(gè)降解產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，增加了操作難度，但上述降解方法均只反映非縮合木質(zhì)素部分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)木質(zhì)素縮合部分結(jié)構(gòu)的推斷仍存在一些問題。近年來，裂解氣相色譜/質(zhì)譜(Pyrolysis-GC/MS)技術(shù)也被應(yīng)用到木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)分析中，該技術(shù)是在無氧條件下，將樣品快速裂解氣化并通過GC分離，然后被MS識(shí)別來確定木質(zhì)素裂解單體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而反推出木質(zhì)素的S/G比例[26]。這種方法對(duì)儀器的靈敏度要求較高，且在不同條件下裂解的木質(zhì)素產(chǎn)物有所不同，難以對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析[27]，只適合對(duì)木質(zhì)素S/G比例的快速分析。

3.2 紫外吸收光譜(UV)

木質(zhì)素中存在一些對(duì)紫外線有很強(qiáng)吸收的發(fā)色基團(tuán)，而植物中其他組分(纖維素和半纖維素)幾乎不吸收紫外線，因此，可以利用木質(zhì)素的這一特性來研究木質(zhì)素的特定結(jié)構(gòu)。主要由愈創(chuàng)木基單元組成的針葉材木質(zhì)素的最大吸收峰位于280～285 nm附近，闊葉材的最大吸收峰位于275～279 nm附近，草類原料中的木質(zhì)素由于含有交聯(lián)的羥基肉桂酸(對(duì)香豆酸和阿魏酸)，除了出現(xiàn)275～279 nm之間的吸收峰，圖譜中還會(huì)出現(xiàn)位于310～320 nm的羥基肉桂酸吸收峰。

3.3 傅里葉紅外吸收光譜(FT-IR)

物質(zhì)分子中各基團(tuán)在不同波長(zhǎng)下對(duì)紅外光的吸收特性不同，根據(jù)這一原理，研究者使用紅外吸收光譜對(duì)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成進(jìn)行解析，也根據(jù)結(jié)構(gòu)分析鑒定未知化合物。FT-IR可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，且具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、使用和數(shù)據(jù)處理方便等優(yōu)點(diǎn)[28]。木質(zhì)素化學(xué)家Faix[29-30]利用傅里葉變換紅外光譜對(duì)木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了大量研究，在木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)分析方面取得了較大進(jìn)展。木質(zhì)素的紅外信號(hào)歸屬如下：3 750～3 000 cm-1代表OH的伸縮振動(dòng)，2 922 cm-1信號(hào)峰是由于—CH2的伸縮振動(dòng)引起的，1 740～1 655 cm-1為C—O伸展振動(dòng)，1 430，1 510和1 600 cm-1為芳環(huán)振動(dòng)，1 333 cm-1可能為紫丁香基型，1 230～1 210 cm-1為CO伸展，1 167 cm-1為共軛酯的聯(lián)接信號(hào)峰，1 050～1 020 cm-1為CO變形、伯醇羥基和甲氧基。紅外光譜在木質(zhì)素的快速定性分析和純度判斷中具有一定優(yōu)勢(shì)，但其不能獲得更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，達(dá)不到當(dāng)前對(duì)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)更詳細(xì)的分析要求。

3.4 拉曼光譜 (Raman)

拉曼光譜和傅里葉紅外光譜均依賴于分子振動(dòng)光譜，在木質(zhì)素分析方面和傅里葉變換紅外光譜相互補(bǔ)充。1999年研究人員采用傅里葉變換拉曼(FT-Raman)對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行分析，可以對(duì)磨木木素和不同原料(山楊、松木、云杉和甘蔗)酶解木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性研究[31]。Larsen等[32]將FT-Raman光譜學(xué)和密度泛函理論(DFT)相結(jié)合，并通過木質(zhì)素模型物單體得出了S、G、H型木質(zhì)素單體的振動(dòng)模式庫，他們發(fā)現(xiàn)溶劑和實(shí)驗(yàn)條件也會(huì)影響拉曼光譜帶的形狀和位置。Meyer等[33]采用近紅外拉曼分光光度計(jì)(NIR Raman)分析原料和醇提取過的原料，得到抽提物存在對(duì)木質(zhì)素峰位置影響的規(guī)律。共聚焦拉曼顯微鏡可以在沒有染色或化學(xué)預(yù)處理?xiàng)l件下揭示木質(zhì)素在生物質(zhì)細(xì)胞壁中的空間分布規(guī)律[34]。近年來，Saar等[35]使用受激拉曼散射(SRS)顯微鏡研究原料中木質(zhì)素在不同的預(yù)處理?xiàng)l件下降解規(guī)律。紫外共振拉曼光譜(UVRR)能原位地分析細(xì)胞壁中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和變化情況，研究人員采用其定性地研究溫度和pH對(duì)木質(zhì)素降解的影響[36]。相干反斯托克斯拉曼(CARS)顯微鏡不受熒光干擾，且能夠提供較強(qiáng)的木質(zhì)素信號(hào)，目前，研究者通過CARS研究了樺木、橡樹和云杉樣品的木質(zhì)素化學(xué)結(jié)構(gòu)[37]。拉曼技術(shù)的進(jìn)步使木質(zhì)纖維素樣品的結(jié)構(gòu)研究得到進(jìn)一步發(fā)展。

3.5 核磁共振波譜 (NMR)

液體核磁共振技術(shù)是目前木質(zhì)素結(jié)構(gòu)表征中最為先進(jìn)和可靠的方法，一般情況下，1H NMR譜、13C NMR譜、定量31P NMR[38-39]和二維異核碳?xì)湎嚓P(guān)譜(2D-HSQC NMR譜)[23]是木質(zhì)素結(jié)構(gòu)分析較常用的方法。液體核磁共振技術(shù)通常表征分離和純化后的木質(zhì)素樣品。隨著高場(chǎng)液體核磁共振技術(shù)和超低溫冷凍探頭技術(shù)的發(fā)展，研究人員采用二維碳?xì)湎嚓P(guān)譜技術(shù)(2D-HSQC)直接表征植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。該方法采用特定的氘代試劑直接溶解或者潤(rùn)脹球磨的細(xì)胞壁組分，再通過二維核磁進(jìn)行表征，理論上可有利于得到細(xì)胞壁中木質(zhì)素較為完整的結(jié)構(gòu)信息，但目前的全溶體系主要用來快速得到細(xì)胞壁中木質(zhì)素的S/G值，而對(duì)于木質(zhì)素精細(xì)結(jié)構(gòu)的鑒定仍需分離純化的木質(zhì)素樣品。細(xì)胞壁全溶技術(shù)尚存在兩點(diǎn)不足：1)木質(zhì)素側(cè)鏈區(qū)的信號(hào)易受細(xì)胞壁多糖信號(hào)干擾。2)氘代全溶體系的制備和溶解效果有待改善。全溶體系下木質(zhì)素的相關(guān)研究進(jìn)展已在文獻(xiàn)中詳述[23]。

3.5.11H NMR

1971年Sarkanen等[40]首次出版了較為全面的有關(guān)核磁共振(主要是1H核磁共振)應(yīng)用于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)分析的專著。但20世紀(jì)70年代核磁共振設(shè)備場(chǎng)強(qiáng)較低，導(dǎo)致1H NMR譜圖信號(hào)較寬且粗鈍；另外木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使得1H NMR譜峰存在大量重疊信號(hào)，難以進(jìn)行準(zhǔn)確解析。目前,由于氫譜采樣時(shí)間短、譜圖信號(hào)強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，氫譜尚可用來快速分析木質(zhì)素樣品純度和基本結(jié)構(gòu)類型等信息,但要深度解析更為詳細(xì)的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)信息，則需要其他核磁高級(jí)實(shí)驗(yàn)。

3.5.213C NMR

與1H NMR相比，13C NMR分辨率更高，但13C NMR中13C原子核的豐度較低，因此為提高圖譜靈敏度，需延長(zhǎng)采樣時(shí)間，增加采樣次數(shù)，提高樣品濃度，方能得到較為滿意的圖譜。木質(zhì)素大分子結(jié)構(gòu)中的芳基醚鍵、縮合和非縮合的結(jié)構(gòu)單元、甲氧基等結(jié)構(gòu)信息均可從13C NMR譜圖獲得。采用定量13C NMR模式(程序：C13IG，反向門控去耦法)對(duì)木質(zhì)素的官能團(tuán)(甲氧基，β-O-4′含量，C—C鍵，C—O鍵和C—H鍵含量)進(jìn)行定量計(jì)算[41]，可定量比較預(yù)處理過程中木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律以及潛在的斷裂機(jī)理。20世紀(jì)80年代以來，脫木質(zhì)素機(jī)理和殘留木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)分析開始用到13C NMR技術(shù)，相關(guān)內(nèi)容在Ralph等[42]撰寫的專著中有詳細(xì)介紹。

3.5.331P NMR

31P NMR最早被應(yīng)用于測(cè)定機(jī)械漿中醌型結(jié)構(gòu)研究，隨后Mazúr等[43]采用31P NMR定量研究分離的木質(zhì)素不同類型的羥基。磷譜的自然豐度為 100%，具有較高的靈敏度，且信號(hào)峰都為無耦合的單峰。31P NMR方法在檢測(cè)木質(zhì)素不同類型羥基方面具有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)，它可以在相對(duì)較短時(shí)間和較低實(shí)驗(yàn)濃度條件下獲得木質(zhì)素中各種類型羥基的定量信息。磷化試劑2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧膦雜戊環(huán)(2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane,TMDP)與木質(zhì)素中的不同羥基反應(yīng)，形成含有磷元素的木質(zhì)素衍生物，隨后加入內(nèi)標(biāo)，即可利用磷譜(31P)定量測(cè)定木質(zhì)素樣品中的酚羥基、脂肪羥基、羧基等特征的官能團(tuán)的含量。研究者將磷譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于木質(zhì)素羥基官能團(tuán)的定量研究，如三倍體毛白楊纖維素酶解木質(zhì)素(CEL)的磷譜(圖3)[18]。此外，Wen等[44]將31P NMR方法用于研究木質(zhì)素在離子液體([C2mim][OAc])預(yù)處理中的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，木質(zhì)素酚羥基和醇羥基呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，輔助證明了木質(zhì)素相繼發(fā)生了芳基醚鍵的斷裂，側(cè)鏈的脫水和氧化等反應(yīng)。

環(huán)己醇為內(nèi)標(biāo)，磷化試劑為TMDP圖3 毛白楊纖維素酶解木質(zhì)素(CEL)的磷譜Fig.3 Quantitative 31P NMR spectrum of poplar cellulolytic enzyme lignin (CEL)

3.5.4 異核單量子相關(guān)譜(2D-HSQC NMR)

異核單量子相干核磁共振光譜(2D-HSQC，heteronuclear single quantum coherence NMR)能較好地區(qū)分氫譜和碳譜中重疊的信號(hào)峰，它結(jié)合了1H NMR實(shí)驗(yàn)的信號(hào)檢測(cè)靈敏度和13C NMR譜圖譜寬范圍大、分辨率高等優(yōu)勢(shì)，可有效地分析復(fù)雜樣品的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[23,45]。木質(zhì)素2D-HSQC譜圖一般由異頭碳區(qū)、側(cè)鏈區(qū)和芳香環(huán)區(qū)3個(gè)區(qū)域組成。異頭碳區(qū)主要為多糖之間的各種聯(lián)接鍵，展現(xiàn)木質(zhì)素樣品中多糖的聯(lián)接鍵種類以及部分LCC鍵結(jié)構(gòu)信息，在此不做詳細(xì)介紹，詳見相關(guān)內(nèi)容的綜述論文[46]。

木質(zhì)素2D-HSQC譜圖的側(cè)鏈區(qū)(也稱聯(lián)接鍵區(qū)域)包含甲氧基、β-O-4′、β-β′、β-5′、β-1′等各種聯(lián)接鍵以及芐基醚鍵(BE)等與木質(zhì)素相連的碳水化合物聯(lián)接鍵相關(guān)信號(hào)(圖4)[45-46]。Rencoret等[47]研究了不同桉木磨木木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，通過半定量方法得出主要連接鍵為β-O-4′，約占總連接鍵的66%～72%，其次為β-β′和β-5′，約占16%～19%。Du等[48]發(fā)現(xiàn)漆酶介質(zhì)體系通過木質(zhì)素-碳水化合物分離脫除木質(zhì)素，并采用2D-HSQC技術(shù)表征木質(zhì)素脫除過程中的結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)對(duì)芐基醚鍵、苯基糖苷鍵等木質(zhì)素-碳水化合物鍵進(jìn)行了研究，相比之下， 2D-HSQC圖譜的芳香環(huán)區(qū)域能夠提供木質(zhì)素基本結(jié)構(gòu)單元及一些末端基(如對(duì)香豆酸、阿魏酸、對(duì)羥基肉桂醇末端基、肉桂醛末端基等)的結(jié)構(gòu)信息。此外，在芳香環(huán)區(qū)域，木質(zhì)素樣品的S/G比例可根據(jù)S單元2，6號(hào)位和G單元2號(hào)位的信號(hào)積分強(qiáng)度比值計(jì)算。Rencoret等[47]采用2D-HSQC技術(shù)對(duì)不同生長(zhǎng)年限的桉木磨木木質(zhì)素(MWL)結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素的S/G比例隨樹齡的增長(zhǎng)而升高，說明桉樹木質(zhì)化過程中S型單體顯著增加。Bauer等[49]通過2D-HSQC中S/G的變化研究了乙醇溶劑濃度和回流時(shí)間對(duì)分離芒草木質(zhì)素的影響，發(fā)現(xiàn)乙醇提取會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素側(cè)鏈α位置部分改性(α-乙氧基化)。Bunzel等[50]采用2D-HSQC NMR技術(shù)對(duì)獼猴桃、梨子、大黃葉柄和麥麩纖維中提取的木質(zhì)素進(jìn)行表征，通過他們已建立的木質(zhì)素模型物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行歸屬，但對(duì)麥麩木質(zhì)素尚未完全解析，因此，有必要探索準(zhǔn)確度更高、種類更全的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)研究數(shù)據(jù)庫。

圖4 不同生長(zhǎng)年限桉木的磨木木質(zhì)素二維碳?xì)湎嚓P(guān)譜(2D-HSQC)Fig.4 The 2D-HSQC spectrum of milled wood lignin isolated from Eucalyptus globulus wood samples at different growth stages

通過2D-HSQC NMR技術(shù)的定量積分功能，可以實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素成分(S/G比例)和各種化學(xué)聯(lián)接鍵的定量分析。核磁定量分析在預(yù)處理機(jī)理和木質(zhì)素降解研究方面具有重要作用。目前，主要通過3種核磁定量方式對(duì)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)定量，下面主要介紹這幾種定量方式：

1)半定量(無內(nèi)標(biāo))[23]。半定量方式可以計(jì)算每種聯(lián)接鍵單元在全部聯(lián)接鍵中的相對(duì)比例，它是2D-HSQC中較為常見的定量方式(歸一化法)。但該定量方式只適用于計(jì)算某一個(gè)木質(zhì)素樣品中各種聯(lián)接鍵的相對(duì)含量，而不能比較不同木質(zhì)素樣品中某一種聯(lián)接鍵含量的多寡。

2)相對(duì)定量(內(nèi)標(biāo)為芳環(huán)C9單元)[23]。目前這種相對(duì)定量方法應(yīng)用較為廣泛。由于木質(zhì)素的IC9單元(芳環(huán)區(qū)域)在預(yù)處理過程中可認(rèn)為相對(duì)不變，根據(jù)木質(zhì)素中各種聯(lián)接鍵含量變化可推測(cè)木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化機(jī)理。一般針葉材和闊葉材以木質(zhì)素的G2和0.5S2,6+G2作為內(nèi)標(biāo)，而草類木質(zhì)素中，將0.5S2,6+G2+0.5H2,6定為內(nèi)標(biāo)。

3)基于定量13C和2D-HSQC的絕對(duì)定量。Zhang等[51]將定量13C譜和2D-HSQC譜相結(jié)合，并找到合適的內(nèi)標(biāo)信號(hào)對(duì)木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量表征，利用這一內(nèi)標(biāo)可以將2D-HSQC譜圖上相對(duì)積分值轉(zhuǎn)化為絕對(duì)值。取定量碳譜上δ78～90區(qū)間的積分值為絕對(duì)積分值，再以二維相應(yīng)部分(δ78～90/2.5～6.0)的相關(guān)信號(hào)計(jì)算出每個(gè)聯(lián)接鍵單元的半定量比例(定量方式1，半定量模式)，最后根據(jù)定量碳譜的絕對(duì)值進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最終確定每種結(jié)構(gòu)單元的絕對(duì)數(shù)值。該方法能夠克服碳水化合物對(duì)木質(zhì)素信號(hào)的干擾。研究表明，三醋酸纖維素、MWL和LCC樣品的定量表征也可通過此方法完成[51-52]。

4 展 望

研究人員針對(duì)不同生物質(zhì)類型，在原本木質(zhì)素分離方法和結(jié)構(gòu)分析方面已經(jīng)開展了較為深入的研究工作，并取得較大進(jìn)展，已基本明確大部分生物質(zhì)原料的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。隨著生物質(zhì)預(yù)處理技術(shù)和木質(zhì)素綜合利用技術(shù)的發(fā)展，木質(zhì)素化學(xué)需進(jìn)一步發(fā)展以適應(yīng)當(dāng)前快速準(zhǔn)確分析木質(zhì)素成分和結(jié)構(gòu)的要求。為較好地適應(yīng)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)分析的要求，尚需在以下兩方面加強(qiáng)研究：

1)原本木質(zhì)素的高效分離與純化。木質(zhì)素和其他組分間復(fù)雜的交聯(lián)結(jié)構(gòu)使得木質(zhì)素以“結(jié)構(gòu)完全不變的形式”分離出較為困難。另外，在條件劇烈的分離過程中，天然木質(zhì)素中的酚羥基等活性基團(tuán)，易發(fā)生氧化和縮合反應(yīng)。因此，在結(jié)構(gòu)分析用的木質(zhì)素樣品分離中，應(yīng)盡量避免破壞木質(zhì)素的原始結(jié)構(gòu)，采用中性溶劑(二氧六環(huán)水溶液)以高得率提取植物細(xì)胞壁中的木質(zhì)素。此外，還可采用球磨處理結(jié)合高效的纖維素復(fù)合酶水解去除球磨植物細(xì)胞壁中的絕大部分碳水化合物，將細(xì)胞壁中的木質(zhì)素大分子以“殘?jiān)举|(zhì)素”形式留下，再經(jīng)過洗滌純化步驟，得到高得率、高代表性的酶水解殘?jiān)举|(zhì)素，該木質(zhì)素可直接用于木質(zhì)纖維原料中木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)分析，而無需進(jìn)行進(jìn)一步溶劑提取。由于該方法得率較高、代表性強(qiáng)，在原始木質(zhì)素分離中將呈現(xiàn)出較好優(yōu)勢(shì)。

2)木質(zhì)素精確結(jié)構(gòu)測(cè)定方法的開發(fā)。分析儀器和分析方法的進(jìn)步將為研發(fā)新的木質(zhì)素精確分析方法提供有利條件。目前，基于高分辨率液體核磁技術(shù)和相關(guān)核磁實(shí)驗(yàn)方法(HSQC、HMBC等)在木質(zhì)素結(jié)構(gòu)定性和定量分析方面的應(yīng)用將更加有利于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的深入解析；同時(shí)，結(jié)合較具有代表性的木質(zhì)素制備方法(殘?jiān)举|(zhì)素)，采用配備超低溫探頭的高場(chǎng)核磁技術(shù)對(duì)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入解析，將為樹木基因調(diào)控、林木遺傳育種和木質(zhì)纖維原料精煉領(lǐng)域研究提供依據(jù)。

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Research progress on separation and structural analysis oflignin in lignocellulosic biomass

WEN Jialong,CHEN Tianying,SUN Runcang*

(Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Lignin is the most abundant renewable aromatic polymer in nature.Finding value-added applications of the lignin can reduce the waste of resources and environmental pollution caused by the burning of the lignin such as it does in pulp and paper making process.The three main components (cellulose,hemicelluloses,and lignin) in the plant cell wall constitute a complex cell wall structure through forming covalent bonds and hydrogen bonds,which leads to the fact that the lignin is difficult to be separated efficiently from plant cell wall.To achieve the efficient isolation of the lignin from biomass,it is necessary to clarify the molecular structure and functional groups of the lignin in different lignocellulosic raw materials.Based on the identified structures of the lignin macromolecules,efficient isolation methods can be better selected and developed.This paper reviewed the recent advances in the lignin isolation methods for the structural analysis purpose and the latest advances in the structural analysis of the lignin.The application of liquid-state nuclear magnetic resonance (NMR) techniques in the qualitative and quantitative structural analysis of the lignin was reviewed in detail.In addition,based on the current research progress,trends of future research in this field were proposed.In short,the structural analysis of the lignin will provide theoretical basis for the gene regulation and genetic breeding of tree as well as biorefinery of lignocellulosic biomass.

lignin;isolation and purification;structural analysis;NMR technique

S216.2

A

2096-1359(2017)05-0076-09

2016-11-25

2017-01-09

國家自然科學(xué)基金(31500486，31430092)。

文甲龍，男，講師，研究方向?yàn)橹参锢w維化學(xué)及生物煉制。

孫潤(rùn)倉，男，教授。E-mail:rcsun3@bjfu.edu.cn